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1、血中碳氧血红蛋白的分光光度法1. 适用范围：血中碳氧血红蛋白的定量测定。2. 原理：血液中含有四种血红蛋白成分，即还原血红蛋白（Hb），氧合血红蛋白（HbO2）、碳氧血红蛋白HbCO及微量的变性血红蛋白HbMet。用连二亚硫酸钠将HbO2和HbMet还原成Hb，则血液中只存在HbCO和Hb两种成分。HbCO和HVB 的最大吸收波长分别在420nm和430nm。测出被检血样在两个波长下的吸光度,在利用HbCO与Hb两个波长下的摩尔吸光系数计算HbCO的百分浓度。3.方法重要参数3.1 线性范围：测定范围为2%-70%HbCO； 3.2 精密度：相对标准偏差为1.9%-5.6%（HbCO浓度为9.
2、9%，36.6%，56.8%，n=6）。3.3 准确度：血样加已知浓度血测定回收率为95.8%（3个浓度，n=8）。检出限：本法的最低检测浓度为2%HbCO（按取10l血样计）。3.5 全程测定时间：60min。4. 器材与试剂4.1 器材 4.1.1采血吸管。4.1.2小玻璃管,25mm4mm,带帽。4.1.3试管，10ml,具有口塞，实际能盛15ml至满。4.1.4液体快速混合器。4.1.5分光光度计。4.2 试剂实验用水为蒸馏水。4.2.1硫酸 。4.2.2甲酸，85%（m/m）。4.2.3连二亚硫酸钠（Na2S2O4）。4.2.4氮气，高纯。4.2.5氧气，高纯。4.2.6一氧化碳纯气
3、，钢瓶装或自制。制备方法：在装有滴液漏斗和气体导出管的烧瓶中加入甲酸，然后缓慢滴入浓硫酸 ，产生的CO通过氢氧化钠洗气瓶及另一空瓶后，通入样品液中。操作应在良好的通风橱内进行。4.2.7氢氧化钠溶液，20g/L。4.2.8血液稀释液，0.02mol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶液。4.2.9肝素溶液，5g/L。 5. 操作步骤5.1 摩吸光系数的测定：摩尔吸光系数不易测定，但在本法计算中，可用同一浓度的血样制得Hb及HbCO，测其在420nm及430nm下的吸光值来代替，作为常数。测定方法如下：取不吸烟健康人血（肝素抗凝），用水稀释5 倍。取0.3ml加血稀释液至90ml，通氧气30min
4、。从中取4份，每份15ml于试管中，其中2份通氮气10min,以除于过剩的氧，得到HbO2液。另两份同纯一氧化碳气10min，得到HbCO液。立即将HbO2、HbCO制备液分别转入内盛60mg 连二亚硫酸钠的试管中，混匀，放置10min后测量。读取430nm和420nm波长处的吸光值，代替摩尔吸光系数（以下简称吸光常数）。5.2 样品处理和测定：将冷藏的血样于室温放置，用液体快速混合器混匀。迅速取10 l（二个平行样），加入内盛15ml血液稀释液的试管中（若采样后随即分析，可直接取10 l血放入内盛15ml血液稀释液的试管中），加入60mg连二亚硫酸钠，轻轻混匀，放置10min。用10mm比色
5、杯，以试剂空白为参比，测其在420nm和430nm波长处的吸光度。6. 计算 按式（9-39）计算血中HbCO的浓度： 式中：C血中HbCO的浓度，%；A420血样在420nm波长处的吸光度读数；A430血样在 430nm波长处的吸光度读数据；k1HbCO在420nm波长处的吸光常数；k2HbCO在430nm波长处的吸光常数；k3Hb在430nm波长处的吸光系数7.说明7.1 本法测定所依据的Hb与HbCO含量比例与血红蛋白含量高低无关，因此取血量不需要很准确。吸光度常数测定后只要仪器波长稳定，可较长时间的使用。7.2 空气中有大量氧气，所以血样及制成的待测液接触空气越少越好。实验证明含HbC
6、O20%及近饱和的HbCO待测液，其容器上端空气分别为5ml-6ml及20ml时，较装满或近满者，测定结果HbCO平均下降4.5%及10.2%（n=6）。7.3非高纯级的钢瓶氧气和氮气含有微量的一氧化碳。制备HbO2时应通过加热至80C-100C的1cm*10cm霍加拉特管除去。7.4连二亚硫酸钠遇水易分解，应避光密封保存，临用现称。如试剂放置过久可按下法标定：用预先盛有15ml250g/L碱性溶液的30ml高型称量瓶，称取约1g样品（称量至0.002g）。待样品充分溶解后移于250ml容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀，明吸出25.0ml置于锥形瓶中。加5ml 5%(v/v)乙酸溶液，2ml 10g/L可溶性淀粉溶液，用0.05mol/L碘标准溶液滴定至蓝色为终点。计算连二亚硫酸钠的百分含量。7.5本法摘自上海市化工局企业标准：沪Q/HG2-001-80(88)。