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1、无菌工艺验证无菌工艺验证 培养基灌封试验培养基灌封试验吴军 2011.21目录目录主题主题1：为什么要进行培养基灌装验证？：为什么要进行培养基灌装验证？主题主题2：相关：相关GMP法规对培养基灌装验证的要求法规对培养基灌装验证的要求主题主题3：培养基灌封实验的常规要求：培养基灌封实验的常规要求主题主题4：特殊剂型的培养基灌装验证方法：特殊剂型的培养基灌装验证方法主题主题5：培养基灌装验证设计、执行与文件编制：培养基灌装验证设计、执行与文件编制主题主题6：培养基灌装验证的关键点分析：培养基灌装验证的关键点分析主题主题7：培养基灌装验证检查要点：培养基灌装验证检查要点2主题主题1：为什么要进行培养
2、基灌装验证？：为什么要进行培养基灌装验证？3为什么需要进行培养基灌封试验为什么需要进行培养基灌封试验？4几个概念几个概念n无菌状态Asepsis(FDA指南)：通过使用无菌工作区及防止暴露的无菌产品受到微生物污染的方式进行操作所达到的一种控制状态n 无菌工艺Aseptic processing(PDA TR22)：在对空气、物料、设备、人员进行微生物和颗粒物污染严格控制的环境下，对无菌物料进行加工。n 无菌灌装Aseptic filling(PDA TR22)：将预先灭菌的产品灌和/或装入无菌容器中并密封，属于无菌工艺的一个组成部分。n关键区Critical area(PDA TR44)：通过
3、设计使产品、容器、封装件和设备能够保持无菌性的一个区域。5概况概况洗瓶机干热隧道隔离柜冻干机轧盖机转移瓶塞灌装机容器6来自生产工艺的要求来自生产工艺的要求对产品进行最终灭菌，是降低微生物污染风险的常用办法。对产品进行最终灭菌，是降低微生物污染风险的常用办法。但有大量药品不适用于最终灭菌而只能采用无菌生产工艺但有大量药品不适用于最终灭菌而只能采用无菌生产工艺方法。方法。无菌生产工艺是制药领域中最难的工艺之一，确保产品无无菌生产工艺是制药领域中最难的工艺之一，确保产品无菌是该工艺最大的难点。菌是该工艺最大的难点。减少无菌工艺药品污染风险的两项重要措施减少无菌工艺药品污染风险的两项重要措施人员培训无
4、菌工艺验证7最终灭菌工艺与无菌生产工艺的差异最终灭菌工艺与无菌生产工艺的差异最终灭菌工艺最终灭菌工艺在高洁净净环境下进行灌装和密封在高洁净净环境下进行灌装和密封通常，产品、容器和密封件的微生物污通常，产品、容器和密封件的微生物污染水平很低染水平很低在密封容器中进行最终灭菌在密封容器中进行最终灭菌无菌生产工艺无菌生产工艺产品、容器和密封件分别进行灭菌，然产品、容器和密封件分别进行灭菌，然后进行灌封后进行灌封在极高洁净环境下进行灌装和密封在极高洁净环境下进行灌装和密封产品在最终容器中不再做进一步的灭菌产品在最终容器中不再做进一步的灭菌处理处理对各个组成部分的灭菌工艺需要进行严对各个组成部分的灭菌工
5、艺需要进行严格验证和监控格验证和监控在灌封前和灌封过程中的操作会带来污在灌封前和灌封过程中的操作会带来污染风险染风险空瓶灭菌隧道密封件蒸汽灭菌釜除菌过滤人员半压塞瓶冻干机全压塞瓶8无菌生产系统9消毒剂消毒剂灭菌设备灭菌设备清洗清洗设备设备蒸汽蒸汽灭菌灭菌干热干热灭菌灭菌水预水预处理处理纯蒸汽纯蒸汽发生器发生器高风险操作区域高风险操作区域混合混合灌装灌装其他其他VHP,EOVHP,EO发生器发生器冻干机冻干机最终最终灭菌灭菌压缩空气压缩空气无菌检测无菌检测9污染类型举例来源（举例）处理方法（举例）非活性（粒子）金属斑点衣物纤维仪器人员衣物外部空气供水悬浮粒子由高效过滤器过滤接触部分清洁和灭菌纯化
6、水系统活性（微生物）细菌酵母，霉菌人员水外部空气仪器工具辅料活性物质有限的无菌核心区干扰悬浮粒子由高效过滤器过滤溶液无菌过滤（0.2um）蒸汽灭菌或零件的辐射灭菌内毒素（通常与空气中的细菌无关）来源于某种有机体细胞壁（经常水生的）潮湿的设备或更换零件，或暴露一段时间后的容器/密封容器加热的苛性钠溶液高温（大于200度）时间视情况而定ISPE：无菌设施设计规范P1610USPUSP注射剂无菌测试结果注射剂无菌测试结果n试验目的：不合格的可能性试验目的：不合格的可能性(%)n试验批量：试验批量：60,000支支n试验方法：按美国药典无菌测试方法试验方法：按美国药典无菌测试方法真实的不合格率真实的不
7、合格率测试测试20支样品支样品不合格的可能性不合格的可能性测试测试40支样品支样品不合格的可能性不合格的可能性118.2%33.1%564.2%87.2%1596.1%99.8%3099.9%100.0%11无菌工艺产品的无菌保证无菌工艺产品的无菌保证 无菌工艺产品PersonnelEnvironment工艺验证人员原料环境无菌检验12注射剂生产的风险分析n内源性的影响因素n系统n设备n工艺过程n物料和中间体的质量n外源性的影响因素n人员 13作业环节与风险作业环节与风险作业环节作业环节验证难易度验证难易度人员依赖程度人员依赖程度相关风险相关风险灭菌灭菌易易低低低低房间设计房间设计N/AN/A
8、中等中等环境监测环境监测中等中等可变可变高高消毒消毒难难高高高高更衣更衣难难很高很高很高很高物品转移物品转移难难高高高高无菌无菌技术（灌封）技术（灌封）难难很高很高很高很高无菌无菌装配装配难难很高很高很高很高14 厂房/房间人员 无菌工艺 生产线 工艺 人流 物流 布局 HVAC/公用工程*日常无菌保证 培养基灌装 QA/QC 消毒操作 偏差&环境控制趋势Richard L.Friedman,M.S.药物评价及研究中心 法规办公室，美国FDA*包括设计及维护15为什么要进行无菌工艺验证为什么要进行无菌工艺验证n证明采用无菌工艺生产无菌产品的能力证明采用无菌工艺生产无菌产品的能力n无菌工艺人员资
9、格和保证无菌工艺人员资格和保证n符合现行的符合现行的GMP要求要求16无菌工艺的意义无菌工艺的意义n无菌工艺试验仅证明无菌工艺系统（环无菌工艺试验仅证明无菌工艺系统（环境、设备、程序和人员）能力在某一个境、设备、程序和人员）能力在某一个时间点的表现。时间点的表现。n并不保证生产程序在同一个生产线不同并不保证生产程序在同一个生产线不同时间段表现出相同的微生物质量水平。时间段表现出相同的微生物质量水平。n通过控制和验证所以的相关工艺，如环通过控制和验证所以的相关工艺，如环境监测、人员确认和清洁、灭菌程序的境监测、人员确认和清洁、灭菌程序的验证，维持工艺模拟验证时的无菌水平。验证，维持工艺模拟验证时
10、的无菌水平。17主题主题2：相关：相关GMP法规对培养基灌装法规对培养基灌装验证的要求验证的要求18来自来自FDA和和USP的要求的要求FDACGMP无菌工艺药品指南（无菌工艺药品指南（2004年版）年版）Anasepticprocessingoperationshouldbevalidatedusingamicrobiologicalgrowthmediuminplaceoftheproduct.Thisprocesssimulation,alsoknownasamediafill.USP31洁净室和其它控制环境的微生物学评价洁净室和其它控制环境的微生物学评价Toassurethatmini
11、malbioburdenisachieved,additionalinformationontheevaluationofthemicrobiologicalstatusofthecontrolledenvironmentcanbeobtainedbytheuseofmedia fills.Anacceptablemediafillshowsthatasuccessfulsimulatedproductruncanbeconductedonthemanufacturinglineatthatpointintime.19来自来自EU GMP和国内的要求和国内的要求EUGMP附件附件1无菌药品的生
12、产（无菌药品的生产（2008年年2月新版）月新版）Validation of aseptic processing should include a process simulation test using a nutrient medium(media fill).中国药品生产质量管理规范附录（中国药品生产质量管理规范附录（1998年修订）年修订）SFDA 化学药品注射剂基本技术要求（试行）化学药品注射剂基本技术要求（试行）培养基灌装验证是对设备、环境以及人员操作的一培养基灌装验证是对设备、环境以及人员操作的一种系统验证种系统验证,是判断无菌保证水平的关键手段是判断无菌保证水平的关键手段
13、采用无菌生产工艺的粉针剂，应能保证采用无菌生产工艺的粉针剂，应能保证SAL不大于不大于10-3 20附录一：无菌制剂附录一：无菌制剂第四十七条 无菌生产工艺的验证应包括培养基模拟灌装试验。应根据产品的剂型以及培养基的选择性、澄清度、浓度和灭菌的适用性选择培养基。应尽可能模拟常规的无菌生产工艺，包括所有对产品的无菌特性有影响的关键操作，及生产中可能出现的各种干预和最差条件。培养基模拟灌装试验的首次验证，每班次应连续进行3次合格的试验。空气净化系统、设备、生产工艺及人员重大变更后，应重复进行培养基模拟灌装试验。培养基模拟灌装试验通常应按生产工艺每班次半年进行1次，每次至少一批。21 培养基灌装容器
14、的数量应足以保证评价的有效性。批量较小的产品，培养基灌装的数量应至少等于产品的批量。培养基模拟灌装试验的目标是零污染，应遵循以下要求：（1）灌装数量少于5000支时，不得检出污染品；（2）灌装数量在5000至10000支时：1.有1支污染，需调查，可考虑重复试验；2.有2支污染，需调查后，进行再验证。（3)灌装数量超过10000支时：1.有1支污染，需调查；2.有2支污染，需调查后，进行再验证。（4）发生任何微生物污染时，均应进行调查。22主题主题3：培养基灌封实验的常规要求：培养基灌封实验的常规要求23定义与目的定义与目的 目的证明生产线采用无菌工艺生产无菌产品的能力对人员进行资格确认符合G
15、MP的要求使用培养基模拟药品进行无菌灌封，对无菌工艺进使用培养基模拟药品进行无菌灌封，对无菌工艺进行验证。又称为行验证。又称为“工艺模拟试验工艺模拟试验”.24工艺模拟试验的通常流程工艺模拟试验的通常流程 将培养基暴露于设备、容器胶塞密封系统的表面和关键环将培养基暴露于设备、容器胶塞密封系统的表面和关键环境条件中，并模拟实际生产完成工艺操作。境条件中，并模拟实际生产完成工艺操作。对装有培养基的密闭容器进行培养以检查微生物的生长。评价结果，确定实际生产中（如灌装前的调试、加入无菌原辅材料、无菌连接、灌装和密封）产品污染的可能性。25工艺模拟的过程工艺模拟的过程n从灭菌开始到完全灌装结束的全过程。
16、从灭菌开始到完全灌装结束的全过程。n如处方混合阶段采用的无菌过程必须作为验证如处方混合阶段采用的无菌过程必须作为验证的一部分。的一部分。n配制后除菌、原液的保存。如取样、保存时间、物配制后除菌、原液的保存。如取样、保存时间、物料的循环等操作。料的循环等操作。n灌装操作。如容器、设备的灌装操作。如容器、设备的CIP和和SIP；设备依照；设备依照设定的速度和包装规格包装容器等，正常与异常干设定的速度和包装规格包装容器等，正常与异常干扰等。扰等。n冻干工艺过程冻干工艺过程26模拟条件模拟条件-最差条件最差条件n最差条件的目的是有意对工艺、系统、设备在最差条件的目的是有意对工艺、系统、设备在更高的挑战
17、条件下进行验证。更高的挑战条件下进行验证。n使用的原料、组件和密封在无菌工艺区域保存时间使用的原料、组件和密封在无菌工艺区域保存时间超出控制要求；超出控制要求；n增加灌装人员的数量，超过正常灌装生产所需的人增加灌装人员的数量，超过正常灌装生产所需的人员数量；员数量；n在工艺模拟实验中使用促生长培养基，而不是使用在工艺模拟实验中使用促生长培养基，而不是使用有抑制性或保护性的处方。有抑制性或保护性的处方。HACCP、FEMA、FAT方法确定最差条件方法确定最差条件27培养基灌封试验的时机：培养基灌封试验的时机：初始验证与再验证初始验证与再验证初始验证初始验证需要重复多次，以确保结果的一致性和有效性
18、。需要重复多次，以确保结果的一致性和有效性。有差异的多次实验结果工艺过程失控的象征定期再验证定期进行，评估无菌工艺的受控情况。应综合考虑每一班次及班次变化过程中有代表性的活动及干预。对人员的资格再确认应纳入到定期再验证中。28培养基灌封试验的时机：培养基灌封试验的时机：增补性培养基灌封试增补性培养基灌封试验验变更及其评估变更及其评估对产品或生产线的每一种变更，均应根据书面的变更对产品或生产线的每一种变更，均应根据书面的变更控制系统进行评估控制系统进行评估。如果通过评估认为此项变更会影响到无菌生产工艺产如果通过评估认为此项变更会影响到无菌生产工艺产品的无菌保证水平，则需要进行增补性培养基灌封实品
19、的无菌保证水平，则需要进行增补性培养基灌封实验。验。比如，设施或设备的变化、生产线配置的变动、人员比如，设施或设备的变化、生产线配置的变动、人员重要变动、环境监控结果异常、容器重要变动、环境监控结果异常、容器-胶塞系统变更、胶塞系统变更、停车时间延长、无菌检查结果阳性等。停车时间延长、无菌检查结果阳性等。29实验用培养基和培养温度的选择实验用培养基和培养温度的选择选择时的注意事项选择时的注意事项适应广谱微生物生长，包括细菌和真菌适应广谱微生物生长，包括细菌和真菌较好的澄明度，较小的粘度较好的澄明度，较小的粘度易于除菌过滤易于除菌过滤常用培养基：常用培养基：3大豆胰蛋白肉汤大豆胰蛋白肉汤（TSB
20、）厌氧培养基仅在特殊情况下使用厌氧培养基仅在特殊情况下使用培养温度培养温度FDA-20-35，目标值目标值2.5，不少于，不少于14天；如选择天；如选择两个温度，则每一温度下至少培养两个温度，则每一温度下至少培养7天，从低温开始。天，从低温开始。PIC-20-25下至少下至少14天，或，先天，或，先20-25下下7天，天，然后然后30-35下下7天。天。30培养基的选择试验培养基的选择试验n培养基的配制和灭菌培养基的配制和灭菌n培养基验证培养基验证n分装到若干数量的无菌小瓶或试管分装到若干数量的无菌小瓶或试管n制备三种微生物（枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、制备三种微生物（枯草芽孢杆菌、金黄色葡
21、萄球菌、白色念珠菌的混悬液，菌液浓度控制在白色念珠菌的混悬液，菌液浓度控制在100-1000个个菌菌/mln分别加入菌悬液各分别加入菌悬液各0.1ml,每份至少每份至少2瓶（支）瓶（支）n培养：培养：30-35（枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌）（枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌）20-25（白色念珠菌）（白色念珠菌）n观察：如果在观察：如果在7天内，每种微生物培养据至少有天内，每种微生物培养据至少有50%长菌，则可认为培养基可用于无菌工艺验证。长菌，则可认为培养基可用于无菌工艺验证。31灌装体积与数量灌装体积与数量灌装体积灌装体积每只容器的灌装体积不少于总容积的每只容器的灌装体积不少于总容积的1/3
22、同样，灌装体积也不宜过大同样，灌装体积也不宜过大既要考虑到瓶倒转或旋转时，培养基能充分接触到容器既要考虑到瓶倒转或旋转时，培养基能充分接触到容器和密封件的内表面，又要保证容器内有足够的氧气支持和密封件的内表面，又要保证容器内有足够的氧气支持微生物生长。微生物生长。灌封数量灌封数量综合考虑统计学要求和实际生产批量。综合考虑统计学要求和实际生产批量。FDA(5000瓶瓶)：如果正常生产的批次量低于：如果正常生产的批次量低于5000瓶，瓶，则培养基灌封至少应为实际生产线的最大批次量。则培养基灌封至少应为实际生产线的最大批次量。PIC(3000瓶瓶)：如果正常生产的批次量低于：如果正常生产的批次量低于
23、3000瓶，瓶，则培养基灌封至少应为实际生产线的最大批次量。则培养基灌封至少应为实际生产线的最大批次量。32灌封时间与批次量控制灌封时间与批次量控制灌装时间灌装时间对于初始性验证，培养基灌封实验应安排在一周内的不同对于初始性验证，培养基灌封实验应安排在一周内的不同时间进行。时间进行。对于再验证，可选择在一周结束或其它最差条件下进行。对于再验证，可选择在一周结束或其它最差条件下进行。灌封时间要涵盖实际生产班次。灌封时间要涵盖实际生产班次。批次量控制批次量控制初次验证，至少要连续成功灌封初次验证，至少要连续成功灌封3个批次。个批次。再验证至少需要成功灌封再验证至少需要成功灌封1个批次。个批次。33
24、培养基灌封实验的合格标准培养基灌封实验的合格标准FDA指南（指南（2004版）与版）与EUGMP附件附件1标准统一标准统一1.灌封量灌封量10000瓶时，若有瓶时，若有1瓶污染，需彻底调查；若瓶污染，需彻底调查；若有两瓶污染，必须进行彻底调查，并重新验证（有两瓶污染，必须进行彻底调查，并重新验证（3批）批）。注：欧盟标准将自注：欧盟标准将自2009年年3月起执行。月起执行。34培养基灌封实验的合格标准培养基灌封实验的合格标准2009年年3月以前欧盟通用标准：污染率低于月以前欧盟通用标准：污染率低于0.1%计算公式：实际污染率计算公式：实际污染率=(95%置信限值置信限值)/(灌封容器数灌封容器
25、数)100%污染瓶数与污染瓶数与95%置信限值间的关系置信限值间的关系污染污染瓶数瓶数01234567891095%置信置信限值限值34.746.37.759.1510.51 11.8413.1514.4315.7116.9635培养基灌封实验的合格标准培养基灌封实验的合格标准SFDA 化学药品注射剂基本技术要求（试行）化学药品注射剂基本技术要求（试行）培养基灌装试验的批量与判断合格的标准培养基灌装试验的批量与判断合格的标准批量（瓶）批量（瓶）3000475063007760允许污染的数量（瓶）允许污染的数量（瓶）012336主题主题4:特殊剂型的培养基灌装验证方法特殊剂型的培养基灌装验证方法
26、37冻干制剂对培养基灌封的要求冻干制剂对培养基灌封的要求冻干制剂的典型生产流程冻干制剂的典型生产流程配制配制灌装灌装冻干冻干加塞加塞轧盖轧盖第一种方式，模拟装载/卸载过程，缩短放置时间（首选）容器内灌封好培养基，以半压塞状态装入冻干机冻干机内部分抽真空（500mbar），在室温放置一定的时间，不得冷冻。用无菌空气破真空（不使用惰性气体），全压塞轧盖 缺点:真空度不能过高，不能照成培养基沸腾。注意，若所使用的容器透明度不高，应将内容物倒出进行检查。冻干制剂培养基灌封试验的特殊性冻干制剂培养基灌封试验的特殊性对产品在冻干机内放置步骤的模拟对产品在冻干机内放置步骤的模拟38冻干制剂对培养基灌封的要求
27、冻干制剂对培养基灌封的要求第二种方式，模拟冻干时间第二种方式，模拟冻干时间半压塞产品在冻干机腔室内的放置时间同于正常工艺。半压塞产品在冻干机腔室内的放置时间同于正常工艺。缺点：耗时长缺点：耗时长第三种方式，以经稀释的培养基模拟冻干过程容器内灌封好经稀释的培养基（diluted medium），以半压塞状态装入冻干机模拟冻干过程，直到容器内的培养基大致达到正常浓度（full strength）为止。缺点：耗时长，需开发特殊的冻干程序，营养支持性不均一，影响微生物的存活力。39粉针剂对培养基灌封的要求粉针剂对培养基灌封的要求第一种方法第一种方法在灌装线上直接灌装液体培养基，灌装后压塞在灌装线上直接
28、灌装液体培养基，灌装后压塞-轧盖或轧盖或熔封。熔封。第二种方法第二种方法先灌装干粉培养基，再加入注射用水先灌装干粉培养基，再加入注射用水第三种方法第三种方法先灌装惰性剂，再加入液体培养基先灌装惰性剂，再加入液体培养基要点要点采用第二、三种方法时，所用惰性剂或干粉培养基需采用第二、三种方法时，所用惰性剂或干粉培养基需事先经过辐射灭菌。事先经过辐射灭菌。常用惰性剂有聚乙二醇常用惰性剂有聚乙二醇8000、羧甲基纤维素、乳糖。、羧甲基纤维素、乳糖。40混悬剂混悬剂/半固体制剂对培养基灌封的要求半固体制剂对培养基灌封的要求悬浮剂悬浮剂需要模拟搅拌或循环流动的过程。需要模拟搅拌或循环流动的过程。如果有无菌
29、添加过程，也应进行模拟。如果有无菌添加过程，也应进行模拟。半固体制剂半固体制剂需要将液体培养基增稠到适当粘度。需要将液体培养基增稠到适当粘度。可选用琼脂或羧甲基纤维素作为增稠剂，也可选用其可选用琼脂或羧甲基纤维素作为增稠剂，也可选用其它试剂，但要证明其没有抑制细菌或真菌的作用。它试剂，但要证明其没有抑制细菌或真菌的作用。在培养结束后，需将培养基从塑料或金属管中挤出检在培养结束后，需将培养基从塑料或金属管中挤出检查其混浊度和真菌菌落，也可进行无菌检查实验。查其混浊度和真菌菌落，也可进行无菌检查实验。如果选择显色培养基遇到污染物变色的方法，则需要如果选择显色培养基遇到污染物变色的方法，则需要对其进
30、行验证。对其进行验证。41主题主题5：培养基灌装验证设计、执行与文件编制：培养基灌装验证设计、执行与文件编制42制订培养基灌封实验方案的考虑因素（一）制订培养基灌封实验方案的考虑因素（一）生产线最长运行时间及其造成的相关风险生产线最长运行时间及其造成的相关风险干预的次数、类型和复杂程度干预的次数、类型和复杂程度是否有冻干工序是否有冻干工序设备的无菌装配设备的无菌装配总人数和所从事的操作总人数和所从事的操作无菌加入和无菌转移的次数无菌加入和无菌转移的次数班次更换、暂停和必要的更衣班次更换、暂停和必要的更衣无菌设备的拆卸与连接无菌设备的拆卸与连接环境监测环境监测43制订培养基灌封实验方案的考虑因素
31、（二）制订培养基灌封实验方案的考虑因素（二）生产线的配置和运行速度生产线的配置和运行速度产品重量检查产品重量检查容器容器/密封系统密封系统与无菌操作相关的各种特殊规定与无菌操作相关的各种特殊规定总人数和所从事的操作总人数和所从事的操作n总的原则n综合考虑生产线可能造成污染的各种因素 n尽可能模拟实际生产的无菌操作 n可能时，应包括最差条件的模拟测试44验证开始前的准备工作验证开始前的准备工作设备确认设备确认通风系统（通风系统（HVAC）的确认的确认设备的在线清洗和灭菌设备的在线清洗和灭菌CIP,SIP灭（除）菌工艺验证灭（除）菌工艺验证湿热、干热灭菌工艺湿热、干热灭菌工艺除菌过滤除菌过滤空气过
32、滤器的完好性检测空气过滤器的完好性检测容器容器/胶塞密封完好性测试胶塞密封完好性测试人员培训人员培训洁净室环境达到设计要求洁净室环境达到设计要求45培养基灌封实验方案的内容举例培养基灌封实验方案的内容举例定义被模拟的工艺定义被模拟的工艺定义使用的房间，灌封线和定义使用的房间，灌封线和设备设备使用的容器和密封件的类型使用的容器和密封件的类型灌装线的速度灌装线的速度灌封数量灌封数量模拟过程中的干扰和中断的模拟过程中的干扰和中断的数目和类型数目和类型参与的人员数目参与的人员数目使用的培养基使用的培养基灌封到容器内培养基的体积选择的最差条件及其原理培养条件，培养温度，培养时间所进行的环境监测批记录复印
33、件职责说明所有工作的合格标准列举最终报告中需要的文件本次模拟的持续时间46方案的执行与记录（一）方案的执行与记录（一）培养基灌封的日期和时间培养基灌封的日期和时间使用的房间和设备使用的房间和设备容器胶塞的型号和尺寸容器胶塞的型号和尺寸培养基种类和灭菌方式培养基种类和灭菌方式每容器中的灌装体积每容器中的灌装体积灌装速度灌装速度灌封的瓶数，灯检丢弃的瓶数和原因灌封的瓶数，灯检丢弃的瓶数和原因培养的瓶数，阳性的数量培养的瓶数，阳性的数量培养时间和温度培养时间和温度47方案的执行与记录（二）方案的执行与记录（二）环境监测的数据环境监测的数据参与培养基灌封的人员参与培养基灌封的人员培养基灵敏度检查的结果
34、培养基灵敏度检查的结果有无阳性结果。如有，要给出有无阳性结果。如有，要给出微生物鉴定的结果。微生物鉴定的结果。如发生异常情况，需给出调查如发生异常情况，需给出调查报告。报告。48培养基灌封实验中的环境监测培养基灌封实验中的环境监测环境监测按照相应的规程进行，包括：环境监测按照相应的规程进行，包括：空气粒子数空气粒子数沉降碟沉降碟浮游菌浮游菌表面监测表面监测人员监测人员监测n对无菌生产区环境的评估对无菌生产区环境的评估49培养基灌封实验中的灵敏度检查实验培养基灌封实验中的灵敏度检查实验n培养基灵敏度检查实验：培养基灵敏度检查实验：使用完成使用完成14天培养的灌封前期培养基样品天培养的灌封前期培养
35、基样品n用枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠球菌、铜绿假用枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠球菌、铜绿假单胞菌、黑曲霉和环境菌作为阳性菌单胞菌、黑曲霉和环境菌作为阳性菌n将每个菌种准备含将每个菌种准备含100cfu/0.1ml的菌液，每个菌种接种的菌液，每个菌种接种2支培养基样品，同时并平板计数（双份）支培养基样品，同时并平板计数（双份）n对真菌对真菌在在20-25 C下培养，对细菌在下培养，对细菌在30-35 C下培养，每下培养，每天检查，天检查，5天内需有生长迹象天内需有生长迹象50再验证与增补性验证的要求再验证与增补性验证的要求再验证再验证对每条生产线，每年进行两次再验证，间隔时
36、间为对每条生产线，每年进行两次再验证，间隔时间为5-7个月个月。人员至少每年参加一次再验证，以进行资格再确认。人员至少每年参加一次再验证，以进行资格再确认。每条生产线轮流使用最大和最小规格的容器，变换生产线每条生产线轮流使用最大和最小规格的容器，变换生产线的速度。的速度。增补性验证增补性验证根据风险程度决定培养基灌封实验的批数。通常为根据风险程度决定培养基灌封实验的批数。通常为1-3批。批。51培养基灌封实验的总结报告培养基灌封实验的总结报告最终报告中应包括以下内容最终报告中应包括以下内容模拟的最差条件模拟的最差条件事件清单事件清单环境监测结果环境监测结果微生物鉴别结果微生物鉴别结果培养基的营
37、养检查实验结果培养基的营养检查实验结果培养条件、结果读取日、结果读取人、每位参与者的灌装瓶培养条件、结果读取日、结果读取人、每位参与者的灌装瓶数等信息。数等信息。结论（结果是否可以接受）结论（结果是否可以接受）合格证书合格证书工艺验证工艺验证/再验证合格证书再验证合格证书人员资格确认证书人员资格确认证书52培养基灌封实验阳性结果的调查培养基灌封实验阳性结果的调查(一一)n调查的范围应包括调查的范围应包括环环境微生物境微生物监测监测数据，空气数据，空气悬悬浮粒子浮粒子监测监测数据数据CIP设备设备，清，清洁洁、消毒程序的、消毒程序的执执行情况行情况培养基、培养基、设备设备和零件的和零件的灭灭菌工
38、菌工艺艺，灭灭菌釜的校正情况菌釜的校正情况高效高效过滤过滤器器检测检测(空气空气悬悬浮粒子水平，浮粒子水平，过滤过滤器器检检漏，漏，风风速速测测量，密封系量，密封系统检查统检查，使用年限等，使用年限等)除菌除菌过滤过滤器完好性器完好性房房间间气流型式与气流型式与压压差差人人员员操作技操作技术术培培训训情况情况53培养基灌封实验阳性结果的调查培养基灌封实验阳性结果的调查(二二)n调查的范围还应包括调查的范围还应包括以往以往产产品无菌品无菌检查实验结检查实验结果果人人员卫员卫生状况生状况监测监测数据数据培养基灌装培养基灌装实验实验中的干中的干预预方式分析方式分析该该区域近期是否有区域近期是否有过维
39、过维修活修活动动，生，生产线产线的改造情况的改造情况该该生生产线产线培养基灌封培养基灌封实验历实验历史数据史数据已已灭灭菌物品的菌物品的储储存条件存条件培养基灌封培养基灌封过过程中的异常事件程中的异常事件阳性阳性污污染菌与染菌与环环境境监测污监测污染菌的染菌的鉴别鉴别54培养基灌封实验阳性结果的调查培养基灌封实验阳性结果的调查(三三)调查结论与风险评估调查结论与风险评估培养基灌封实验结果有效培养基灌封实验结果有效暂停生产，直至确定污染来源并采取有效的纠偏措施。再验证合格后，产品方可放行。对培养基灌封实验后和此前所生产的产品，进行风险评估培养基灌封实验结果无效培养基灌封实验结果无效重新进行培养基
40、灌封实验重新进行培养基灌封实验条件条件1无菌灌装区的物理条件不满足要求无菌灌装区的物理条件不满足要求条件条件2人员未按照正常生产程序操作人员未按照正常生产程序操作55污染污染 率率灌装过程灌装过程(时间或灌装量时间或灌装量)在灌装过程中污染率上升 这表明污染可能来源于液体培养基(如与培养基贮罐非无菌连接，在循环管路中受到污染)。很重要的是，在灌装结束后，保持培养基贮罐处于无菌状态，当等到培养基灌装结果时，可以核实这样的假设。56污染率污染率灌装过程灌装过程(时间或灌装量时间或灌装量)在灌装过程中污染率下降这表明污染发生于生产设备中（胶塞容器/轨道,计量泵/针头)，在清“灌装过程中污染被部分或全
41、部。”洗掉57污染率污染率灌装过程灌装过程(时间或灌装量时间或灌装量)在灌装过程中污染率出现尖峰一个尖峰（在短时段的一些产品被污染）可能与在灌装过程中不正确操作导致的关键失误有关。对于这个原因，很关键的是必须知道被污染产品灌装的准确时间，以及当时实施的干预措施（灌装操作过程的录像是非常有用的）58污染率污染率灌装过程灌装过程(时间或灌装量时间或灌装量)污染率出现尖峰后，呈上升趋势 与前面的例子相同，但如果错误的干预措施能够影响到液体的管路/回路时（如培养基贮罐的变化，泵或针的替换）59污染率污染率灌装过程灌装过程(时间或灌装量时间或灌装量)孤立事件(试验中少数污染)不幸的是，这些现象是最普通的
42、，也是最难调查的。如果这种现象在多次试验中反复出现，可能说明这，所以需”环境噪声“个工艺存在要根本的措施（如 更衣/着装、消毒剂和气流模式的改变)60主题主题6：培养基灌装验证的关键点分析：培养基灌装验证的关键点分析61培养基灌封后的生产培养基灌封后的生产n培养基灌封后可以进行生产，但要等培养基灌封合培养基灌封后可以进行生产，但要等培养基灌封合格后产品才能放行（产品有报废的风险）。格后产品才能放行（产品有报废的风险）。n无效的培养基灌封后可以进行生产，但所生产的批无效的培养基灌封后可以进行生产，但所生产的批次要在成功培养基灌封后方可放行。次要在成功培养基灌封后方可放行。n培养基灌封失败培养基灌
43、封失败 生产线不能用来生产，根据调查结果决定培养基灌生产线不能用来生产，根据调查结果决定培养基灌封的次数和数量，培养基灌封合格后，才能生产。封的次数和数量，培养基灌封合格后，才能生产。62讨论：最差条件讨论：最差条件 Worst Case最差条件高于或低于正常范围的条件限度，与正常生产条高于或低于正常范围的条件限度，与正常生产条件相比最有可能造成工艺或生产失败的条件。件相比最有可能造成工艺或生产失败的条件。注意如果某些做法会带来污染的风险，则不允许用培如果某些做法会带来污染的风险，则不允许用培养基灌封的结果为它的不合理的进行辩护养基灌封的结果为它的不合理的进行辩护 63最差条件的设计（最差条件
44、的设计（1）储存时间储存时间Holding timen灌封设备、灌封部件、储罐、无菌物料、药液在实际灌封灌封设备、灌封部件、储罐、无菌物料、药液在实际灌封前能够放置的最长时间前能够放置的最长时间n1.灌封设备、灌封部件、储罐、无菌物料需要再灭菌灌封设备、灌封部件、储罐、无菌物料需要再灭菌（除菌）的时间间隔（除菌）的时间间隔nWorst case:用超出保存时间的灌封设备、灌封部件、用超出保存时间的灌封设备、灌封部件、储罐、无菌物料参与培养基灌封储罐、无菌物料参与培养基灌封n2.产品从无菌过滤到灌封加塞完成所需要的时间产品从无菌过滤到灌封加塞完成所需要的时间nWorst case：无菌过滤后存放
45、在储罐内的培养基模拟无菌过滤后存放在储罐内的培养基模拟实际生产时产品的最大储存时间后再灌封实际生产时产品的最大储存时间后再灌封n产品在灌装后的储存时间应在培养基灌封中验证产品在灌装后的储存时间应在培养基灌封中验证64最差条件的设计（最差条件的设计（2）灌封的持续时间灌封的持续时间Duration of runsn最保守的设计：在培养基灌封试验中，模拟用时最长的瓶最保守的设计：在培养基灌封试验中，模拟用时最长的瓶子满批量生产所需要的时间，其中包括正常的干扰时间子满批量生产所需要的时间，其中包括正常的干扰时间（换班、设备维修）。（换班、设备维修）。n其他的设计：其他的设计：1.在生产完成后接着进行
46、培养基灌封实验在生产完成后接着进行培养基灌封实验2.为了减少灌封瓶数，在每批实验刚开始及结束前均灌装为了减少灌封瓶数，在每批实验刚开始及结束前均灌装培养基，中间空运行灌封机以达到所需要的时间培养基，中间空运行灌封机以达到所需要的时间n在任何情况下模拟了与实际生产不相同的情况，都要有在任何情况下模拟了与实际生产不相同的情况，都要有记录，并解释原因记录，并解释原因n在正常生产过程中所需的最长时间，包括可能发生的事在正常生产过程中所需的最长时间，包括可能发生的事件，人员的换班等，应予以模拟件，人员的换班等，应予以模拟65最差条件的设计（最差条件的设计（3）灌封数量灌封数量n灌封数量没必要总是满批量灌
47、封数量没必要总是满批量n惯例：小批量，至少要满批量惯例：小批量，至少要满批量 大批量，一般至少大批量，一般至少5000瓶瓶n在模拟无菌生产时间时会超过在模拟无菌生产时间时会超过5000瓶瓶66最差条件的设计（最差条件的设计（4）灌封速度与瓶子规格灌封速度与瓶子规格n灌封速度和瓶子规格的关系灌封速度和瓶子规格的关系n最慢的速度，最大的瓶子规格最慢的速度，最大的瓶子规格n最小的瓶子规格，最快的速度最小的瓶子规格，最快的速度67最差条件的设计（最差条件的设计（5）人员人员n培养基灌封时模拟无菌区可能容纳最多的人数培养基灌封时模拟无菌区可能容纳最多的人数n无菌区工作人员至少每年参与一次培养基灌封无菌区
48、工作人员至少每年参与一次培养基灌封n不是每个人员都要参与最差条件的模拟不是每个人员都要参与最差条件的模拟n看，不是参与看，不是参与68最差条件的设计（最差条件的设计（6）设备装配设备装配n动作多动作多n对灌封区环境产生直接影响对灌封区环境产生直接影响69最差条件的设计（最差条件的设计（7）干预干预n正常的（灌封线装配，称量调节，加胶塞，处理倒正常的（灌封线装配，称量调节，加胶塞，处理倒瓶，取样，环境监测）瓶，取样，环境监测）n非正常的（设备故障，灌封线堵塞，轨道调节，拆非正常的（设备故障，灌封线堵塞，轨道调节，拆卸卸/替换破损的部件）替换破损的部件）nSOP中应列出哪些干扰是容许的，非正常的干
49、扰至中应列出哪些干扰是容许的，非正常的干扰至少每年模拟一次少每年模拟一次n干扰的次数应该等于正常生产时发生的次数干扰的次数应该等于正常生产时发生的次数n不应挑战干扰而应避免干扰不应挑战干扰而应避免干扰70综合理解综合理解培养基灌封实验的条件应充分体现生产操作的实际情况培养基灌封实验的条件应充分体现生产操作的实际情况采取特别的生产控制和预防措施，或在环境条件特别好时采取特别的生产控制和预防措施，或在环境条件特别好时进行工艺模拟，会造成良好工艺条件的假象。进行工艺模拟，会造成良好工艺条件的假象。选取选取SOP范围内的苛刻条件，能证明其有效性范围内的苛刻条件，能证明其有效性挑战条件不是人为的创造特别
50、环境挑战条件不是人为的创造特别环境缺陷样品的处理缺陷样品的处理有密封性缺陷的样品应在培养前剔除。有密封性缺陷的样品应在培养前剔除。对培养过程中发现损坏的样品处理。对培养过程中发现损坏的样品处理。培养基灌封实验中断续出现微生物污染，是无菌生产线呈现不培养基灌封实验中断续出现微生物污染，是无菌生产线呈现不良趋势的征兆。良趋势的征兆。71无菌工艺验证的无菌工艺验证的CAPAn增加培养基的灌装数量和环境监测数据已查明污染源；增加培养基的灌装数量和环境监测数据已查明污染源；n加强无菌生产环境的洁净和消毒措施；加强无菌生产环境的洁净和消毒措施；n增加灌装前静态下的环境监测数据以检查无菌环境条增加灌装前静态