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1、纤维素酶的生产工艺及分别提纯摘要：姓名：朱帅帅 学号：202304015024 四院三连 通信工程纤维素酶是一种重要的酶产品，是一种复合酶，主要由外切 - 葡聚糖酶、内切-葡聚糖酶和-葡萄糖苷酶等组成，还有很高活力的木聚糖酶。由于纤维素酶在饲料、酒精、纺织和食品等领域具有巨大的市场潜力，已被国内外业内人士看好，将是继糖化酶、淀粉酶和蛋白酶之后的第四大工业酶种，甚至在中国完全有可能成为第一大酶种，因此纤维素酶是酶制剂工业中的一个的增长点。是可以将纤维素分解成寡糖或单糖的蛋白质。关键词：发酵法；盐析法；凝胶过滤；离子交换层析；电泳Abstract：Cellulase is an important
2、 enzyme products, a complex enzyme, mainly by theexo-glucanase,endo-glucanaseand-glucosidaseandother components, there are very high energy Xylanase. Because cellulase has great market potential in the fields of feed, alcohol, textile and food, it has been regarded as the fourth largest industrial e
3、nzyme after saccharifying enzyme, amylase and protease, even in China it is entirely possible to become the largest enzyme species, so the enzyme enzyme industry is a newgrowthpoint.Isaproteinthatcandecompose cellulose into oligosaccharides or monosaccharides.Keywords: Fermentation, Salting out, Gel
4、 filtration, Ion exchangechromatography, Electrophoresis.一、纤维素酶的概述纤维素酶是一种对纤维素大分子的水解具有特别催化作用的活性蛋白质，它是一组酶的总称，不是单成分酶，而是由多个酶起协同作用的多酶体系。其外观为灰白色的无定形粉末或液体，最适作用温度为 4055，反响最适PH 值为 4.06.0，在 4070以下稳定存在，溶于水，几乎不溶于乙醇、乙醚和氯仿等有机溶剂。该酶催化效率高，比一般酶高 106107 倍。自 1906 年 Seillere 在蜗牛的消化液中觉察纤维素酶至今已有一百余年了，现在纤维素酶已被广泛应用于食品、酿酒、饲料
5、加工、纺织、洗衣、农业等多个领域1。食品方面，纤维素酶被应用于果实和蔬菜加工、油料作物加工、茶叶加工、酒精生产、啤酒生产、食醋酿造、酱油酿造等生产工艺。在饲料工业中，纤维素酶用来制备低纤维饲料、饲料酶制剂、水解植物纤维生产饲料酵母。在纺织工业中， 纤维素酶被用于纤维改性，真丝脱胶，染整的退浆、精炼、整理加工等方面。纤维素酶还被用于解决“白色污染”问题。纤维素酶用于造纸工业，利用外切纤维素酶只从末端切断纤维素的作用原理，可以提高纸张的光滑度。2纤维素酶在自然界分布极为广泛，昆虫、软体动物、高等植物、细菌、放线菌和真菌都能产生纤维素酶3。反刍动物的瘤胃以及猪大肠也有分解纤维素的细菌存在。纤维素酶的
6、来源主要有三方面：植物、动物和微生物。纤维素酶虽然在植物中广泛存在，且在植物发育的某些阶段发挥着水解细胞壁的作用，假照实成熟、蒂柄脱落等，但从植物中提取纤维素酶比较困难，且含量不高。很多食木性的动物及食草动物之所以可以以植物为食物来源，主要是由于其体内存在内源性的纤维素酶，但是依靠这类动物来进展工业化大规模生产也比较困难。工业化纤维素酶的生产主要承受微生物来进展。据不完全统计， 20 世纪 60 年月以来国内外共记录了产纤维素酶的菌株大约有 53 个属的几千个菌种。由于放线菌纤维素酶的产量极低，所以争辩很少。细菌纤维素酶产量也不高，主要是葡聚糖内切酶，大多数对结晶纤维素没有降解活性，且所产生的
7、酶是胞内酶或吸附在细胞壁上，不分泌到培育液中，增加了提取纯化的难度，所以工业上很少承受细菌作为生产菌株。目前用于生产纤维素酶的微生物较多的是丝状真菌，其中酶活力较强的菌种为木霉、曲霉、根霉和青霉，以木霉属菌种居多， 较为典型的有里氏木霉、绿色木霉、康氏、木霉。二、 纤维素酶的生产方法1、固体发酵法固体发酵法以玉米、稻草等植物秸秆为主要原料生产纤维素酶。该法投资少，工艺简洁，产品价格低廉。然而固体发酵法存在着根本上的缺陷不行能像液体发酵那样随着规模的扩大，大幅度降低本钱。以秸秆为原料的固体发酵法生产的纤维素酶很难提取和精制。目前生产厂家只能承受直接枯燥、粉碎来得到固体酶制剂，或用水浸泡后压滤得到
8、液体酶制剂，产品外观粗糙，质量不稳定，杂质含量高； 劳动强度大、生产效率低；易污染杂菌。国内外对木霉纤维素酶的争辩较多，但木霉一方面毒性大，使之应用受到限制；另一方面普遍存在着-葡萄糖昔酶活力偏低的缺陷，致使纤维二糖积存，影响了酶解效率。2、液体发酵法液体发酵生产时，将原料送入发酵罐内发酵，同时接入纤维素酶菌种。发酵过程中，需要从发酵罐底部通入无菌空气对物料进展气流搅拌，发酵完后的物料经过处理可得到纤维素酶产品。液体发酵法生产纤维素酶，原料利用率高，生产条件易把握、产量高、劳动强度小、产品质量稳定，但动力消耗大，设备要求高。液体深层发酵的方法具有培育条件简洁把握，不易染菌，生产效率高等特点。因
9、此，目前此方法是大规模生产的可行方法。 其生产工艺过程是将玉米秸秆粉碎至 20 目以下，进展灭菌处理后，送发酵釜内发酵，同时参加纤维素酶菌种，发酵时间约为 70 h，把握温度低于 60，将净化后的无菌空气从釜底通入，进展物料的气流搅拌，发酵完的物料经压滤机压滤、超滤浓缩、喷雾枯燥，制得纤维素酶产品。三、纤维素酶的分别纯化纤维素酶的组分大多为糖蛋白，工业上用于生产纤维素酶的粗酶 制剂常承受硫酸铵沉淀法、酒精沉淀法、丹宁沉淀法和离心喷雾枯燥 等方法。但在纤维素酶分析争辩上主要承受一系列蛋白质分别纯化技 术，如分级沉淀、色谱法、电泳法等。目前，对粗酶的提取大多承受硫酸桉分级沉淀法；对酶活力的测定国际
10、上一般承受 Horikoshi 方法； 对蛋白质的测定按考马斯亮蓝(Bradford)法；复原糖的测定承受, 一二硝基水杨酸(DNS)法。以下介绍一些常用的纯化方法：1. 盐析法：盐析法就是在溶液中参加中性盐使各种蛋白质依次分别沉淀的方法。其原理是依据蛋白质在溶液中由于外表带电的氨基酸残基与溶剂分子(H20)相互作用，所以能保持溶解状态，当参加盐离子时，蛋白质分子四周所带电荷增加，促进了与溶剂分子的相互作用， 使溶解度增加，此现象称为盐溶，在盐浓度较低时以这种情形为主； 但当盐浓度连续增加到达一限量，大量盐离子使水浓度相对降低，蛋白质的水化作用减弱，相互分散而沉淀下来，称为盐析。选择肯定浓度范
11、围的盐(如025饱和度硫酸铵)使杂质蛋白沉淀而有效成分呈盐溶状态，经离心分别得到上清液后，再选择肯定浓度范围的盐溶液使有效成分等物质呈盐析状态而另一局部杂质呈盐溶状态，用离心法收集的沉淀物即为初步纯化的有效成分物质。此法是蛋白质进展分级沉淀时常用操作步骤，常选用的盐是硫酸铵。2. 凝胶过滤：凝胶过滤又叫分子筛层析，是利用分子筛效应分别纯化生物大分子和测定其分子量及样品脱盐的一种色谱方法。凝胶过滤层析所用的基质是具有立体网状构造、筛孔直径全都的球状颗粒。这种物质可以完全或局部排阻某些大分子物质，而不能排阻某些小分子化合物。当样品进入色谱柱时，由于被分别物质的分子质量不同。较大的分予不能通过孔道进
12、入凝胶颗粒的微孔内部，与流淌相一起先流精彩谱柱；分子质量小的物质可通过局部孔道，更小的分子可通过任意孔道进入珠体内部。这样小分子向下流淌的速度必定比大分子慢， 结果是分子质量大的物质先从柱中流出，分子质量小的则后从柱中流出而到达分别的目的。凝胶过滤具有设备简洁、操作便利、重复性好及样品回收率高等特点，所以该方法除了常用于分别纯化蛋白质，核酸、多糖、激素、氨基酸和抗生素等物质外，还可测定蛋白质的分子量、样品浓缩和脱盐等方面。3. 离子交换层析：离子交换层析是依据物质所带电荷的差异进展分别纯化的方法。离子交换剂以纤维素、葡聚糖凝胶等不溶性物质为母体，通过酯化、醚化或氧化等化学反响，引入阳性或阴性离
13、子的特别制剂，可与带相反电荷的化学物质进展交换吸附。对于呈两性离子的蛋白质、酶类、多肽等物质与离子交换剂的结合力，取决于它们的物理化学性质和特定pH 条件下呈现的离子状态。当pH 低于等电点(pI) 时，被阳离子交换剂吸附；反之被阴离子交换剂吸附。对于呈胶体状态的大分子物质一般使用选择性好的弱酸性离子交换剂。离子交换层析法是常用的层析方法之一，广泛应用于多种生化物质的分析、制备、纯化等。4. 电泳：电泳是带电颗粒在电场作用下，向着与其电荷相反的电极移动的现象。当把一个带净电荷的颗粒放入电场时，就会受到电场力的作用，带电颗粒在电场中向肯定方向泳动，速度与电场强度和带电颗粒的净电荷量成正比，与颗粒
14、半径和黏度成反比。当颗粒是两性电介质性质的蛋白质分子时，它在肯定 pH 溶液中电荷量是独特的。由于不同的蛋白质等电点和分子量是不同的，因此经泳动后就形成了泳动度不同的区带。利用此性质，可以将混合液中不同的蛋白质区分开，同时也可以对其纯度进展测定。现在电泳法已成为开展生物化学和分子生物学争辩的必不行少的常规工具。参考文献：1 高论江，董全纤维素酶的争辩进展及前景展望2023，4.2 顾方媛，陈朝银纤维素酶的争辩进展及进展趋势2023，283 刘小杰，何国庆纤维素发酵培育基的优化2023，374 邱雁临主编纤维素酶的争辩和应用前景，粮食与饲料科技出版， 20235 宋桂经主编纤维素科学与技术，广西人学学报出版，2023 6俞俊棠主编生物工艺学，化学工业出版社，20237肖春玲主编微生物纤维素酶的应用争辩，微生物学杂志，2023A. 内容说明：本文与第四章能量与代谢其次节生物催化剂酶的内容相关， 阐述了纤维素酶的生产工艺及分别提纯。B. 对课程内容和教学方式的意见和建议我觉得课程内容较多，课时又较少，所以上课速度过快，可以选择一些章节让大家自学，然后着重讲解一些关键的章节。