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1、CHO 细胞无血清培育基技术手册1 CHO 细胞CHO 细胞是中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)，1957 年美国科罗拉多大学 Dr. Theodore T. Puck 从一成年雌性仓鼠卵巢分别获得，为上皮贴壁型细胞，是目前生物工程上广泛使用的细胞系。工业生产上应用较多的是CHO-K1 细胞，为转化细胞系，细胞染色体分布频率是2n22，系亚二倍体细胞。ATCC 保存 CHO-K1 细胞株，编号为 CCL-61，被广泛地用于重组 DNA 蛋白的表达。由于该细胞存在遗传缺陷，无脯氨酸合成基因，不能将谷氨酸转变为谷氨酸-半醛，培育过程中需在培育基中 添加 L-脯氨
2、酸才能生长。并且由于该细胞已经霍乱毒素适应，形态学有所转变。最初细胞为贴壁型细胞， 经屡次传代筛选后，也可悬浮生长。ATCC 供给的 CHO-K1 细胞照片CHO 细胞简洁发生基因突变，也较易进展基因转染，是良好的哺乳动物基因表达宿主细胞，代表性细胞有二氢叶酸复原酶dihydrofolate reductase养分缺陷型突变细胞株CHO/dhfr-、转染谷氨酰胺合成酶Glutamine synthetase,GS基因的 GS-CHO 细胞。二氢叶酸复原酶是真核细胞核苷酸生物合成过程中起着重要作用的一种酶，是常用的遗传选择标记之一，它可催化二氢叶酸复原成四氢叶酸。对于 dhfr 突变体细胞而言，
3、由于不能够合成四氢叶酸，阻断了正常核酸代谢途径，因此不能在常规培育基上生长，但假设在培育基中参加次黄嘌呤hypoxanthine和胸 苷thymidine，则突变体细胞可以借助核苷酸的补救合成途径维持生长。利用dhfr 基因进展筛选时， 首先将重组 DNA 分子导入 dhfr- 表型的受体细胞，然后撤除原培育基中的的次黄嘌呤和胸苷，即可获得dhfr+并能表达外源基因的克隆细胞系。因此在选择表达外源基因的阳性克隆细胞时需选用不含次黄嘌呤 和胸苷的培育基。另外，氨甲喋呤MTX选择压力可使 CHO/dhfr- 细胞的外源基因的拷贝数扩增并得 到较高水平的表达。CHO-GS 细胞是用含单抗蛋白等的目的
4、基因和谷氨酰胺合成酶(GS)基因标记的表达载体，转染宿主细胞 CHO，再通过 L-氨基亚砜蛋氨酸(methionine sulphoximine，MSX)等化合物选择加压促使 GS 基因和目的蛋白基因扩增，筛选获得重组细胞株，可在不含谷氨酰胺培育基中生长、增殖，可避开或削减细胞代谢过程中谷氨酰胺降解积存的氨对细胞的损伤、抑制作用。ATCC 供给的 CHO/dhfr-细胞照片2 CHO 细胞表达系统的优势与特点由于哺乳动物细胞构造、功能和基因表达调控的简单性，外源基因在哺乳动物细胞中的表达与在原核生物中的表达存在较大差异，因而外源基因在哺乳动物细胞中高效表达所需的元件也不同于在原核生物细 胞中的
5、表达所需的元件。外源基因在哺乳动物细胞中的表达包括基因的转录、mRNA 翻译及翻译后蛋白质的加工等过程，如蛋白质的糖基化、磷酸化、寡聚体的形成以及蛋白质分子内或分子间二硫键的形成等比 较简单，要表达具有生物学功能的蛋白质如膜蛋白、抗体和具有特异性催化功能的酶需要在哺乳动物细胞 中进展。哺乳动物基因表达宿主细胞选择的根本原则是来源丰富、转化效率高、表达效果好，CHO 细胞作为表达系统除具有上述的特点要求外，还有以下优势：1） 外源基因被整合到宿主染色体上后，在没有选择压力的状况下能稳定保持；2） 适合多种蛋白质的分泌表达和胞内表达，并且很少分泌自身的内源蛋白，便于下游产物分别纯化；3） 对培育基
6、的要求较低，可在无血清培育基中培育；4） 细胞可进展贴壁培育也可进展悬浮培育，且具有较高的耐受剪切力和渗透压力量；5） 可进展高密度大量培育，进展较大规模生产时其培育量可放大到20230L 以上，是目前应用最广泛的哺乳动物基因表达受体细胞之一。另有争辩者尝试将类胰岛素生长因子IGF 基因和转铁蛋白基因转入CHO 细胞获得能自身分泌必需蛋白的“超级 CHO”，无需在培育基中转铁蛋白和胰岛素，细胞可在无血清培育基SFM中生长良好。3 CHO 细胞在生物制药中的应用目前已有多种外源基因如人组织性纤溶酶原激活剂tPA、人促红细胞生成素EPO、乙肝外表抗原HBsAg、干扰素IFN、干扰素IFN、白细胞介
7、素2IL2、凝血因子等在CHO 细胞中得到表达。在美国已注册的大约73 种蛋白药物生产中，应用哺乳动物细胞培育的有35 种，CHO 细胞培育的就占 27 种，其中包括 10 种单克隆抗体。下表是以 CHO 细胞培育为基质生产的重组制品。4 无血清细胞培育基无血清培育基的消灭是培育基进展历程上的一个里程碑，其一般是在合成培育基的根底上，引入成分完全明确的或局部明确的血清替代成分，使培育基能满足动物细胞培育的要求，又可有效的抑制因使用血 清所引发的问题。进入 20 世纪 80 年月后，的无血清培育基不断问世，人们经过争辩觉察，只要在培育基中增加某些适于细胞生长的成分，如纤连蛋白fibronecti
8、n、转铁蛋白Transferrin, TRF、胰岛素Insulin和表皮生长因子epidermal growth factor, EGF等，不少细胞即能在无血清供给的状况下生长，尤其是 CHO、杂交瘤、骨髓瘤细胞以及 BHK21 细胞等。某些细胞在无血清的条件下，其生长和抗体的产量甚至较有血清培育时高出数倍。目前，无血清培育基的争辩有两个方向：一是培育基中不含有任何动物来源的添加组分；二是培育基中不含有不明确的添加组分。依此可以将当前应用较多的无血清培育基归纳为以下四种：(1) 无血清培育基，为一般意义上无血清培育基，用各类可替代血清功能的生物材料配制细胞培育基，如牛血清白蛋白(BSA) 、转
9、铁蛋白、胰岛素等生物大分子物质，以及从血清中提取的去除蛋白质的混合脂类以及水解蛋白等。其特点是培育基中的蛋白含量较高,添加物质的化学成分不明确，其中含有大量的动物来源蛋白。(2) 无动物来源培育基，很多商业公司开发的无动物来源培育基是基于生产重组药物的安全考虑，培养基中的添加组分无动物来源，需要的蛋白来源于重组蛋白或者蛋白水解物，这些组分可以保障细胞生长 及增殖的需要。(3) 无动物蛋白培育基，培育基完全不用动物来源的蛋白，但仍有局部添加物是来源于植物蛋白的水解片段或合成多肽片段等其他衍生物。此类培育基组分相对稳定，但必需添加类固醇激素和脂类前体，并且对培育的细胞是高度特异性的。(4) 化学组
10、分限定培育基，此类培育基是目前最安全、最为抱负的培育基，首先可以保证培育基批次 间的全都性，其中所添加的少量动物来源的蛋白水解物、蛋白都是成清楚确的组份。其特点是培育基的性 质明确，有利于进展细胞培育的代谢争辩，同时分别纯化也比较便利。争辩者对 CHO 细胞无血清培育基的开发比较深入，目前有多种用于CHO 细胞无血清培育的培育基面世，形成了很多固定的商业配方，这些配方有的是专利保护的，有的是商业隐秘。国外有局部优秀的无 血清培育基，但价格昂贵。CHO 细胞存在多种克隆细胞系，仅 ATCC 保存的 CHO 细胞就多达 38 种，再加上各公司或争辩单位构建的细胞，其克隆细胞数量远不止这些。对于CH
11、O 细胞无血清培育而言，由于构建的各种高性能CHO 细胞系不同，不同克隆细胞的养分要求也都格外的不同，对养分要求往往是共性化的。另外，CHO 细胞培育过程的不同培育阶段、重组 CHO 细胞构建的各个阶段，细胞代谢所需的养分或限制因素也是不同的， 即同一细胞系在整个培育过程也需要使用不同的培育基，需要与之相对应的共性化培育基Customed Cell Culture Medium。5 CHO 细胞无血清无动物组分培育基SAF-CHO-G-004其实共性化培育基并不颖，在国外生物制药企业普遍承受共性化培育基，世界有名的生物制药公司如 Amgen、Genetech往往和培育基企业合作，通过细胞培育基
12、的客户定制方式，研制最适合自身细胞特点的共性化细胞培育基应用于生产实践，用于提高细胞产率和生产效率。另有数据显示，国际上的细 胞培育基生产企业，共性化、定制培育基占其培育基业务的90%以上，名目培育基缺乏 10%。北京清大天一生物技术依托于在细胞培育基研发和动物细胞大规模培育方面具有丰富阅历 的研发团队，潜心争辩，开发研制了多种共性化培育基，通过在生产实践中的应用已取得可喜的成果，如CHO 细胞无血清无动物组分细胞培育基SAF-CHO-G-004就是其中之一。5.1 CHO 细胞无血清无动物组分培育基SAF-CHO-G-004的特点SAF-CHO-G-004代码：SAF108是北京清大天一生物
13、技术开发的一代CHO 细胞无血清无动物组分细胞培育基，能支持多种 CHO 细胞的生长维持，可广泛应用于 CHO 细胞的无血清悬浮培育及抗体、重组蛋白的生产过程。细胞培育基产品的生产、检验严格执行GMP 治理和 ISO9001 治理体系，符合生物制药原辅料要求，质量稳定牢靠。1） SAF-CHO-G-004 细胞培育基系无血清无动物组分培育基，不含有血清替代物、动物来源蛋白等动物来源组分，化学成清楚确，保证了细胞培育中原辅料的使用安全性；2） SAF-CHO-G-004 细胞培育基能支持多种 CHO 细胞的生长、维持，具有较为广泛的适用性；3） 适用于试验争辩和大规模培育应用；4） 依据用户的不
14、同使用，可定制SAF-CHO-G-004 培育基，以满足 CHO/dhfr-、GS-CHO 等不同系统的应用需求；5） 有多种包装规格可供选择，满足不同用户的使用需求。5.2 CHO 细胞无血清无动物组分细胞培育基培育效果使用 SAF-CHO-G-004 细胞培育基培育已驯化过的 CHO 细胞，图 1 是 CHO 细胞接种密度为2105cells/ml 时的细胞生长曲线，可以看到，经过34 天的培育过程，细胞密度可提高到细胞4-5106cells/ml，细胞活率超过 90，细胞扩增了二十多倍。图2 是细胞批培育的葡萄糖和乳酸代谢状况。图 3 和图 4 分别表示培育了 96 小时4 天的 CHO
15、 台盼蓝染色和细胞显微照片，细胞形态饱满、安康。图 1.CHO 细胞生长曲线图 2. CHO 细胞批培育葡萄糖和乳酸代谢状况图 3 培育 96hr 的台盼蓝染色的CHO 细胞图 4 培育第 96hr 的 CHO 悬浮细胞5.3 CHO 细胞无血清无动物组分细胞培育基使用说明5.3.1 成分无机盐氨基酸维生素其它氯化钙、五水硫酸铜、七水合硫酸亚铁、氯化钾、六水合氯化镁、五水硫酸镁、氯化钠、无水磷酸二氢钠、无水磷酸氢二钠、七水合硫酸锌等L-盐酸精氨酸、L-胱氨酸盐酸盐、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-盐酸组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-盐酸赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸
16、、L-丙氨酸、L-天门冬酰胺、L-天门冬氨酸、L-盐酸半胱氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸等维生素B 、维生素B 、维生素B 、维生素C、维生素H、盐酸吡哆醇、盐酸吡哆醛、肌醇、1212叶酸等无水葡萄糖、HEPES、丙酮酸钠、亚油酸、硫辛酸、胰岛素、亚硒酸钠、植物蛋白等SAF-CHO-G-004 细胞培育基毎升标示量 27.80g，含 L-谷氨酰胺、次黄嘌呤和胸苷，可依据客户使用需求定制不含谷氨酰胺或次黄嘌呤、胸苷的无血清培育基，具体的成分、标示量等详见对应产品的说 明书。5.3.2 贮存28冷藏，枯燥、密封、避光贮藏。【贮存期限】：暂定一年。5.3.3 配制方法以 1L 包装为例1. 1)将一袋
17、粉末培育基全部倒入一容器中，用少量注射用水将袋内残留培育基洗下，并入容器，加注射用水水温 20-30到 950 毫升，稍微搅拌溶解；2. 2)参加 1.9 克碳酸氢钠；3. 3)稍微搅拌溶解，加注射用水至1 升；4. 4)如有必要，用 1mol / L 氢氧化钠溶液或盐酸溶液调 pH 至所需值；5. 5)用 0.2m 滤膜正压过滤除菌；6. 6)溶液应在 2-8下避光保存。5.3.4 SAF-CHO-G-004 培育基不同 NaHCO3 加量的 pH、渗透压参考比照表5.4 CHO细胞无血清驯化在含血清培育基中生长的 CHO 细胞可经过肯定的细胞驯化过程，适应SAF-CHO-G-004 细胞培
18、育基，进展细胞的无血清培育。已经适应无血清培育的 CHO 细胞可直接在 SAF-CHO-G-004 中实现无血清培育培育，建议前二代的细胞密度不低于4105cells/ml。细胞的无血清驯化过程如下：1. 取处于对数生长期的贴壁 CHO 细胞，活率大于 95%，开头进展无血清驯化。2. 细胞驯化可以在方瓶T-flask、摇瓶shake-flask或转瓶spinner-bottle中进展。3. 将无血清细胞培育基和含血清培育基的按1：1V/V的比例进展混合，接种密度为24105cells/ml的细胞，在 37、5CO2 培育箱进展培育。4. 依据细胞生长和活率状况，在降血清的每一阶段可稳定传代
19、13 代，接种密度维持在 2- 4105cells/ml。5. 逐步提高无血清细胞培育基在混合液中的比例V/V，即降低混合液中的血清含量，传代过程的细胞接种密度仍维持为 2- 4105cells/ml。6. 直至混合液中的血清浓度降低至 0.1-0.2%，每一代的细胞活率大于 90后，此时可将细胞完全培育在CHO 无血清无动物组分培育基中。7. 在CHO 无血清无动物组分培育基中进展放大培育，建立起适应无血清无动物组分培育的CHO 种子细胞库。清大天一共性化细胞培育基主要特点产品名称产品代特点号MD205改进 DMEM，具有较强细胞维持力量，可增加收液次数，提高病毒表达率。DMEMMD208D
20、MEM 培育基的改进低血清培育基，可用于CHO 细胞的低血清培育。MD210改进 DMEM，适用于Marc145 细胞培育。MD502改进 199，具有高缓冲性能，提高病毒滴度。199MD504199 培育基的改进低血清培育基。可用于 Vero 细胞、地鼠肾细胞的低血清培育。MD505199 培育基的改进低血清培育基。可用于Vero 细胞微载体反响器低血清培育。MD610适用于二倍体细胞的培育MEMMD611MEM 培育基的改进低血清培育基。可用于BHK21 细胞的低血清培育。SAF-CHO-G-004SAF108无血清无动物来源组分细胞培育基，CHO 悬浮细胞生长培育基，不含苯酚红。SAF-CHO-F-001SAF107无血清无动物来源组分细胞培育基，CHO 细胞培育基添加剂，不含苯酚红。SAF-NS0-G-001SAF110无血清无动物来源组分细胞培育基，NS0 悬浮细胞生长培育基。