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1、样本显微镜(Ziehl.)敏感性低培养培养敏感性高2 到8 周改良罗氏培养基 Coletsos液态培养基(MGIT,Bactec,BacT Alert.)鉴定鉴定生化检测实验条件苛刻,需数天(Reference center)目视检测准确低MTD2.5小时敏感性高 特异性强Accuprobe 1 小时简单-准确 分枝杆菌:用Gen-Probe 产品检测程序和时间第1页/共22页Gen-Probe检测分枝杆菌试剂类型扩增+杂交检测结核分枝杆菌复合菌:AMPLIFIED MTD(Gen-Probe)临床痰标本(涂阳或涂阴)杂交检测分枝杆菌:ACCUPROBE Gen-Probe 培养阳性标本(菌落
2、或肉汤)第2页/共22页MTD(AMPLIFIED Mycobacterium Tuberculosis Direct)检测结核分枝杆菌复合菌结核分枝杆菌复合菌:M.tuberculosis 结核分枝杆菌M.bovis 牛分枝杆菌 M.bovis BCG 牛分枝杆菌BCGM.africanum 非洲分枝杆菌 M.microti 田鼠分枝杆菌 M.canetti 卡氏分枝杆菌第3页/共22页Gen-Probe MTD检测4以16S rRNA 为靶核酸4TMA：转录介导扩增4 HPA：杂交保护分析第4页/共22页RNA与 DNA DNA非常稳定，在死亡生物内也可存在双链结构 RNA只存在于活细胞非
3、常脆弱(RNA容易受破坏)单链结构第5页/共22页结核菌核酸RNA是DNA的4-5倍rRNA占80%第6页/共22页Gen-Probe 扩增 3 3 个主要步骤个主要步骤 标本处理标本处理 释放 rRNA TMA TMA rRNA 扩增物 HPAHPA 检测扩增物检测扩增物第7页/共22页超声波裂解样品细胞溶解目标 rRNA 释放第8页/共22页TMA转录介导扩增2条引物：2种酶：*逆转录酶(双功能:逆转录和RNAse H酶)(RNAse H：一种核糖核酸内切酶，特异性水解DNA：RNA杂交链上RNA链的磷酸二酯键，产生5核苷酸，该酶对单链核酸、双链DNA或双链RNA没有作用)*RNA聚合酶等
4、温扩增：42第9页/共22页引物引物1 1靶靶rRNArRNARTRTDNADNARNARNARNAse H RNAse H 作用作用DNADNART引物引物2 2DNA DNA 模板模板RNA 合成酶RNA RNA 扩增物扩增物 100-1000 100-1000 拷贝拷贝 RT引物引物2 2RNAse H RNAse H 作用作用RT引物引物1 1逆转录酶逆转录酶TMA原理原理第10页/共22页敏敏 感感 10 000 拷贝rRNACA TATA TG CG CA TT AA TCGT AG CG CG CA TATG CT AC GT ADNARNA RNA 聚合酶聚合酶(eg:E.co
5、li)(eg:E.coli)第11页/共22页扩增产物检测：HPA技术HPA：杂交保护分析技术 标记丫啶酯（丫啶酯（Acridinium esterAcridinium ester）的）的DNA DNA 探针与探针与 RNA RNA 扩增产物杂交，形成扩增产物杂交，形成DNADNA：RNARNA双螺旋结构保护荧光物双螺旋结构保护荧光物丫啶酯丫啶酯不被选择试剂淬灭（水解）。不被选择试剂淬灭（水解）。AE第12页/共22页HPA 步骤 丫啶酯标记的特异丫啶酯标记的特异 DNADNA探针与探针与RNARNA扩增物杂交扩增物杂交 使用生化水解方法，分离杂交及未杂交探针使用生化水解方法，分离杂交及未杂交
6、探针 检测：化学发光检测检测：化学发光检测 试剂试剂1 1：0.001N0.001N硝酸中含硝酸中含0.1%0.1%过氧化氢；过氧化氢；试剂试剂2 2：1N NaOH1N NaOH第13页/共22页杂 交AE6060杂交rRNA探针AEAEAEAEAEAEAE第14页/共22页杂交温度的影响606061615959AEAEAE非特异结合非特异结合无杂交无杂交假阴性高假阴性高假阳性高假阳性高第15页/共22页选 择6060选择试剂选择试剂AEAEAEAEAEAEAEAE第16页/共22页CH3N+OORH2O2/OH-light检 测第17页/共22页敏 感 度 比 较化学发光10-19 mol
7、e辐射同位素 10-18 mole荧光 10-12 mole比色 10-9 mole第18页/共22页总 结靶核酸:rRNA等温扩增，2种酶是关键（逆转录酶(RNAse H)、RNA 聚合酶）扩增原理：TMA（转录介导扩增）液相杂交：HPA（杂交保护分析）化学发光法：检测杂交信号第19页/共22页MTD 方法STEP1：标本预处理 超声波降解标本STEP2：扩增(TMA)扩增试剂,石腊油，经过预处理的标本-消化 95,15 分钟，水浴 42,5 分钟-加入酶试剂，扩增 42,30 分钟STEP3：探测(HPA)加入探针试剂-杂交 60,15 分钟-选择 60,15 分钟-在发光仪读数第20页/共22页 扩增扩增 :TMA:TMA加入试管加入试管 :扩增试剂,石腊油 经过预处理的标本 消化消化 95,15 分钟 水浴水浴 42,5 分钟加入加入 酶试剂酶试剂扩增扩增 42,30 分钟 标本预处理标本预处理 :准备并（超）声波降解标本 探测探测 :HPA:HPA加入探针试剂杂交杂交 60,15 分钟选择 60,15 分钟在发光仪读数第21页/共22页谢谢您的观看！第22页/共22页