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1、亚硫酸氢钠测序法(bisulfite genomic sequencing) 直接测序法是建立在MSP 基础上进一步深入研究CpG岛各个位点甲基化情况的方法. 重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶, 而甲基化的胞嘧啶保持不变, 行PCR扩增 ( 引物设计时尽量避免有CpG,以免受甲基化因素的影响) 所需片段 , 则尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶 . 最后 , 对 PCR 产物进行测序, 并且与未经处理的序列比较, 判断是否 CpG 位点发生甲基化 . 此方法一种可靠性及精确度很高的方法, 能明确目的片段中每一个CpG 位点的甲基化状态 .在寻找有意义的关键性CpG位点上 , 有
2、其他方法无法比拟的优点. 测序法以 CpG岛两侧不含CpG 点的一段序列为引物配对区,所以能够同时扩增出甲基化和非甲基化靶序列.它的不足是耗费时间和耗资过多, 至少要测序10 个以上的克隆才能获得可靠数据, 需要大量的克隆及质粒提取测序, 过程较为繁琐、昂贵. 第一部分基因组 DNA的提取 . 这一步没有悬念, 完全可以购买供细胞或组织使用的DNA提取试剂盒 , 如果实验室条件成熟,自己配试剂提取完全可以.DNA 比较稳定 , 只要在操作中不要使用暴力, 提出的基因组DNA应该是完整的 . 此步重点在于DNA的纯度 , 即减少或避免RNA 、蛋白的污染很重要.因此在提取过程中需使用蛋白酶 K及
3、 RNA酶以去除两者. 使用两者的细节：1：蛋白酶K可以使用灭菌双蒸水配制成20mg/ml；2：RNA酶必须要配制成不含DNA酶的 RNA酶, 即在购买市售RNA酶后进行再处理,配制成10mg/ml. 否则可能的后果是不仅没有RNA,连 DNA也被消化了 . 两者均于 -20 度保存 . 验证提取DNA的纯度的方法有二：1：紫外分光光度计计算OD比值；2：1%-1.5%的琼脂糖凝胶电泳. 我倾向于第二种方法, 这种方法完全可以明确所提基因组DNA的纯度 , 并根据 Marker 的上样量估计其浓度 , 以用于下一步的修饰. 第二部分亚硫酸氢钠修饰基因组DNA 如不特别指出 , 所用双蒸水（ D
4、DW ）均经高压蒸汽灭菌. 1：将约 2ugDNA于 1.5mlEP 管中使用DDW 稀释至 50ul ；2：加 5.5ul新鲜配制的3M NaOH ；3： 42 水浴 30min；水浴期间配制：4：10mM对苯二酚（氢醌）, 加 30ul 至上述水浴后混合液中；（溶液变成淡黄色）5： 3.6M 亚硫酸氢钠（ Sigma,S9000）, 配制方法： 1.88g 亚硫酸氢钠使用DDW 稀释 , 并以 3M NaOH滴定溶液至PH 5.0, 最终体积为5ml. 这么大浓度的亚硫酸氢钠很难溶,但加入NaOH后会慢慢溶解 , 需要有耐心 .PH 一定要准确为5.0. 加 520ul 至上述水浴后溶液中
5、. 6：EP管外裹以铝箔纸, 避光 , 轻柔颠倒混匀溶液. 7：加 200 ul 石蜡油 , 防止水分蒸发, 限制氧化 . 8：50避光水浴16h. 一般此步在4pm开始做 , 熟练的话不到5pm即可完成 , 水浴 16h 正好至次日8am以后收 , 时间上很合适 . 这一步细节：1： 基因组 DNA的量不需十分精确, 宁多勿少 , 因为在以后纯化回收步骤中会有丢失, 且此方法修饰最多可至4ug. 2：所有试剂均须新鲜配制, 所以配液的技术要过关, 既要快 , 又要精确 . 精品资料 - - - 欢迎下载 - - - - - - - - - - - 欢迎下载 名师归纳 - - - - - -
6、- - - -第 1 页，共 4 页 - - - - - - - - - - 3：亚硫酸氢钠溶液呈强酸性, 一定用碱将PH调制 5.0, 否则 PH不合适会影响后续纯化吸收. 4：水浴最好达16 小时 , 虽可以短至8 小时 , 但后者修饰会有不完全. 第三部分修饰后 DNA纯化回收EP管如无特别说明均为高压蒸汽灭菌的. 1. 将移液器枪头伸入石蜡油层下, 先轻轻加压使其中一小段石蜡油排出, 然后吸取混合液至一洁净 1.5mlEP 管中 . 2：以下使用Promega Wizard Cleanup DNA纯化回收系统（Promega,A7280）1）70水浴预热DDW ；配制 80% 异丙醇；
7、2）加 1ml Promega s Wizard DNA Clean-up resin,轻柔颠倒混匀,使 DNA充分与树脂结合；3）由于该试剂盒中仅配备针筒没有针栓, 如果有真空负压吸引器,使用起来很方便；如果没有, 需要自备3ml-5ml 注射器 . 将注射器针筒与试剂盒提供的回收小柱紧密连接后, 将上述混合物用移液器移至针筒内, 用 2ml 以上的 EP管放置小柱下接收废液. 加针栓 , 轻轻加压 , 将液体挤出 , 此时可见小柱内有白色的树脂沉积. 4） 将注射器与小柱分离后拔出针栓, 再将针筒与小柱连接, 向针筒内加入2ml 80的异丙醇 ,插入针栓 ,轻轻加压 , 将异丙醇挤出. 此
8、为洗涤步骤. 5）将注射器与小柱分离, 将小柱置于洁净1.5ml 洁净 EP管上 , 离心 12000rpm,2min, 以甩去残余异丙醇成分, 使树脂干燥 . 此时 , 修饰后 DNA处于与树脂结合状态. 6）将小柱取下置于另一洁净1.5mlEP 管上 , 移液器加50ul 预热好的 DDW, 室温放置5min. 7）离心 12000rpm,20s, 此为洗脱步骤 , 此时 EP管内液体即为洗脱的修饰后DNA溶液 ,终体积为 50ul. 3：加 5.5ul 新鲜配制的3M NaOH,室温放置 15min. 4：加 33ul 10M 乙酸铵 , 以中和 NaOH,使溶液 PH于 7.0 左右
9、. 5：加 4ul 10mg/ml 糖原 , 此作为沉淀指示剂, 因为其与乙醇混合后可产生沉淀, 便于以后离心后辨别回收物的位置, 以防在吸取残余乙醇时将回收物吸走. 其实 ,加入这些糖原究竟能起多大作用 , 不好说 . 不过有国产糖原卖,包装不大 , 也很便宜 , 买来一用 , 算严格遵守文献的步骤吧. 6：加 270ul 冰无水乙醇 , 置于 -20 度, 过夜沉淀 . 有人为沉淀最短可至2 小时 , 但我认为时间长些可能会更好. 并且做到此步骤时, 一般会到中午, 如果样本多的话要到下午, 不妨放置过夜, 日程可以轻松些, 顺便做些其他试验. 如果想当天做完, 没有问题 , 但我认为最好
10、多沉淀些时候 , 至少 6 小时吧（这是经验, 我做过最少6 小时 , 也是可以的 , 再短就不敢发表意见了）7：4 度,12000rpm 离心 ,30min, 倒去上清液 , 收集沉淀 . 不必吸净 . 8： 加 500ul 70% 乙醇 , 不要将沉淀吹打起来, 只要把乙醇加上即可. 轻柔倾斜 EP管, 旋转一圈 ,再次离心 ,4度 12000rpm,5min. 离心后倒掉上清, 再加同量乙醇 , 同样再做一遍. 此为洗涤步骤, 共 2 次. 9： 倒掉上清 , 并常温简短离心后, 将附壁乙醇离至EP管底 ,移液器小心将残余液体吸净, 室温干燥 5min, 或沉淀由不透明变为半透明或透明时
11、, 加入 20ul- 30ulDDW,溶解沉淀 . 至此 , 已完成了修饰后DNA的纯化回收 , 所得为修饰后DNA溶液 , 可用于此后的进一步实验. 10： -20 保存 DNA溶液 . 此步细节：1：在使用注射器时, 一定要用力均匀且轻, 如使用暴力 , 会将小柱内的薄膜挤破, 失去作用 . 2：乙酸铵、糖原不需新鲜配制, 糖原配好后放在-20 度保存 , 乙酸铵室温即可, 因为这样浓度的乙酸铵非常难溶,一旦放在4 度, 取出用时也会有很多溶质析出. 3：异丙醇、 70% 乙醇都不需要新鲜配制,但如果用量大, 现场配也很方便. 此步关键是在树脂与DNA的结合上 , 这就再次强调第二部分调亚
12、硫酸钠PH值得重要性 . 因为精品资料 - - - 欢迎下载 - - - - - - - - - - - 欢迎下载 名师归纳 - - - - - - - - - -第 2 页，共 4 页 - - - - - - - - - - 树脂与 DNA结合需要有一个适当的PH,如前一步没做好, 此步树脂不能与DNA很好结合 , 将会带来灾难性后果, 即 DNA随着液体被挤出了, 洗脱时实际已没有任何DNA了. 第四部分修饰后 DNA用于 PCR 这一步也没有悬念.我主要谈一下这里面的几个比较棘手的问题：1：引物问题：我感觉自己设计引物有相当的难度, 我曾设计过几对引物, 并且试验了一下,但以失败告终 .
13、 如果时间充裕、作的又是比较新的基因文献不多, 自己设计引物没有问题. 如果不是这样 , 还是参考文献更好些. 首先查阅SCI 分值高的文献, 然后是著名实验室的文献,如果国内有做的, 更好了 , 可以直接联系咨询. 查到序列后 , 一定要和Genbank 中的序列进行比对 , 防止有印刷错误造成的个别碱基的差别. 然后再到google 上搜一下 , 看用的人多否 , 体系条件是否一样. 用的人多、体系条件一样 , 表明可重复性比较强. 我也是按此行事, 算比较顺利. 2：Taq 酶问题：有文献用高保真的金牌 Taq（Platinum ）, 但我感觉只要体系正确、变性退火等条件合适 , 一般的
14、热启动酶是可以的. 我开始使用的是Takara的 LA Taq, 很好用 , 配有10 x 含 mg+ 的 LA缓冲液 . 有时候用没了 , 暂时以 Takara 的普通 Taq 酶也可以 . 如何选择 , 可以根据自己的情况.初作者还是用好一点的酶. 3：PCR的条件：变性一般都选择95 度,3min. 其余我感觉还是根据文献, 退火可以根据你的引物的退火温度在小范围内尝试. 一般和文献报道差别不大. 只是扩增片断特异性的问题. 建议根据文献 . 4： 做 PCR的 EP管最好选择进口的, 壁薄且厚度均匀, 这可以保证温度的迅速变化可以及时传递给管内的反应液,使体系真正在所设定的温度下运行.
15、 5：PCR仪：如果在某一个仪器上作出来了,最好一直用此仪器继续. 不同的仪器“脾气”也不一样 , 但 EP管必要和仪器内的插孔紧密结合方好, 留有空隙 , 我认为会影响温度的传递. 这一部分有些啰嗦, 只是个人一些不成熟经验. 有疑问处 , 请大家指出 , 交流 . 今天先到这里,现写一些内容, 比较费劲 ,总是不能一挥而就. 望见谅 . 歇息一会准备写最后蓝白斑筛选克隆这一部分 . 第五部分 PCR产物的凝胶回收这一步比较简单, 可以购买一个凝胶PCR产物回收试剂盒, 国产的就很好、价格也合理, 比如TIANGEN的产品（用过）. 把切下来的胶按说明书操作即可. 几个细节：1：PCR产物进
16、行琼脂糖凝胶电泳, 要使用新配的电泳液. 凝胶浓度1%-2% 均可 . 2： 凝胶 DNA回收时在300nm紫外灯下观察条带位置, 切取目的片断所在位置的凝胶, 尽量小 ,保证特异性 . 3：紫外照射时间不能过长, 否则对 DNA有损伤 . 4：回收后的DNA如不马上用就储存于-20 度, 在数月内是很稳定的. 第六部分 PCR产物与 T 载体的连接和转化、蓝白斑筛选1：连接 T载体（本实验使用的是Promega 的试剂盒）15ul 体系T-easy 1ul Ligase 1ul 2xbuffer 7.5ul DNA 5.5ul 4 度, 过夜 . 2：连接产物的转化1）-70 度冰箱内取出感
17、受态细菌, 融化后置于冰上；精品资料 - - - 欢迎下载 - - - - - - - - - - - 欢迎下载 名师归纳 - - - - - - - - - -第 3 页，共 4 页 - - - - - - - - - - 2）连接产物15ul 全部加入 , 至于冰上30 分钟；3）42 度 , 90 秒钟；4）冰上 2分钟；5）800ul LB培养基；6）280rpm,37 度 , 摇床 45 分钟（将管放水平了摇, 保证菌液摇匀） ；7）8000rpm,1 分钟；在超净台内去上清, 留 100-150ul ；8）涂板： 37 度孵箱过夜； （板为含有氨苄青霉素的固体LB培养基）先涂： X
18、-gar 35ul IPTG 25ul 后涂：混悬液过夜后可见板上长出很多蓝色或白色斑点, 取白色斑点 , 尤其是蓝色斑点周围的白色斑点, 此处自联率较低 . 3：取白斑 , 划种于新板上新板：先涂： X-gar 35ul IPTG 25ul 然后于板底划出分区, 进行标记 . 根据需要 , 一般一板作50 个克隆没有问题. 针头挑白斑划2 道于板上相应区域内. 37 度, 孵箱过夜 . 4：联系测序公司送测序. 一般一个克隆在35-45 元. 这一部分的细节：1：涂板要均匀, 保证 Xgar 和 IPTG 均匀分布在板面上；2：不要让蓝白斑长得太满, 否则选取克隆时容易一下挑2 个.精品资料 - - - 欢迎下载 - - - - - - - - - - - 欢迎下载 名师归纳 - - - - - - - - - -第 4 页，共 4 页 - - - - - - - - - -