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1、生物学指标的测定第1页，共15页，编辑于2022年，星期一细菌总数的测定细菌总数的测定指指1ml水（或水（或1g样样品），在普通品），在普通琼琼脂培养基中脂培养基中经经37、24h培养后所生培养后所生长长的的细细菌菌群菌菌群总总数。数。评评定水体定水体污污染程度指染程度指标标之一。之一。生活生活饮饮用水用水卫卫生生标标准（准（GB5749-2006）规规定每毫升水的定每毫升水的细细菌菌总总数不得超数不得超过过100个。个。水中通常存在的水中通常存在的细细菌大致可分菌大致可分为为三三类类：天然水中存在的天然水中存在的细细菌。普通的是菌。普通的是荧荧光假光假单孢单孢杆菌、杆菌、绿绿脓脓杆菌，一般杆
2、菌，一般认为这类细认为这类细菌菌对对健康人体是非致病的。健康人体是非致病的。荧光假单胞杆菌第2页，共15页，编辑于2022年，星期一细菌分类肠肠道道细细菌。它菌。它们们生存在温血生存在温血动动物的物的肠肠道中，故道中，故粪粪便中大量存在。便中大量存在。水体中水体中发现这类细发现这类细菌，可以菌，可以认为认为已受到已受到粪粪便的便的污污染。致病性染。致病性肠肠道道细细菌有沙菌有沙门门氏杆菌（氏杆菌（伤伤寒和副寒和副伤伤寒菌）、寒菌）、B型炭疽菌、痢疾志型炭疽菌、痢疾志贺贺氏氏菌和霍乱弧菌等。菌和霍乱弧菌等。土壤土壤细细菌。当洪水菌。当洪水时时期或大雨后地表水中期或大雨后地表水中较较多。它多。它们
3、们在水在水中生存的中生存的时间时间不不长长，在水，在水处处理理过过程中容易被去除。腐程中容易被去除。腐蚀蚀水管水管的的铁细铁细菌和硫菌和硫细细菌也属此菌也属此类类。大肠杆菌铁细菌第3页，共15页，编辑于2022年，星期一平板计数法国国标规标规定的方法定的方法为为平板平板计计数法数法检验检验方法：在玻璃平皿内，接种方法：在玻璃平皿内，接种一毫升水一毫升水样样或稀或稀释释水水样样于于加加热热液化的液化的营营养养琼琼脂培养基中，冷却凝固后在脂培养基中，冷却凝固后在37C培养培养24小小时时，培养基上的菌落数或乘以水，培养基上的菌落数或乘以水样样的稀的稀释释倍数即倍数即为细为细菌菌总总数。数。精度高，
4、耗精度高，耗时长时长。为为了了简简化化检测检测程序、程序、缩缩短短检测时间检测时间，国，国内外学者内外学者进进行了大量的快速行了大量的快速检测检测方法的研究，提出了阻抗方法的研究，提出了阻抗检测检测法、法、Simplate TM全平器全平器计计数法、微菌落技数法、微菌落技术术、纸纸片片法等法等检测检测方法。方法。第4页，共15页，编辑于2022年，星期一平板计数法第5页，共15页，编辑于2022年，星期一总大肠菌群的测定总大肠菌群总大肠菌群：需氧及兼性厌氧需氧及兼性厌氧的在的在3535、48h48h之内生长时之内生长时能使乳糖发酵、产酸产气的革兰阴性无芽胞杆菌，以每升能使乳糖发酵、产酸产气的革
5、兰阴性无芽胞杆菌，以每升水样中所含有的大肠菌群的数目表示。总大肠菌群既包括水样中所含有的大肠菌群的数目表示。总大肠菌群既包括存在于人及动物粪便的大肠菌群，也包括存在于其他环境存在于人及动物粪便的大肠菌群，也包括存在于其他环境中的大肠菌群。中的大肠菌群。包括包括:大肠菌群、粪大肠菌群、大肠杆菌大肠菌群、粪大肠菌群、大肠杆菌生活饮用水卫生标准（生活饮用水卫生标准（GB5749-2006GB5749-2006）规定每）规定每100mL100mL水不得水不得检出总大肠菌群。检出总大肠菌群。第6页，共15页，编辑于2022年，星期一革兰氏染色法细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法。未经染色之细菌，由于其与周
6、围环境折光率差别甚小，故在显微镜下极难观察。染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，而用以分类鉴定。革兰氏染色属复染法。革兰氏染色法能够把细菌分为两大类，革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。染色的差异主要由阴性与阳性细菌细胞壁的差异引起。第7页，共15页，编辑于2022年，星期一革兰氏染色法先用龙胆紫（亦称结晶紫）来染细菌，所有细菌都染成了紫色涂以革兰氏碘液，来加强染料与菌体的结合用95%的酒精来脱色2030秒钟，有些细菌不被脱色，仍保留紫色，有些细菌被脱色变成无色用番红或沙黄复染1分钟，结果已被脱色的细菌被染成红色，未脱色的细菌仍然保持紫色，不再着色
7、凡被染成紫色的细菌称为革兰氏阳性菌（G+菌）；染成红色的称为革兰氏阴性菌（G-菌）。常见的革兰氏阳性菌：葡萄球菌、链球菌、肺炎双球菌、炭疽杆菌、白喉杆常见的革兰氏阳性菌：葡萄球菌、链球菌、肺炎双球菌、炭疽杆菌、白喉杆菌、破伤风杆菌等；菌、破伤风杆菌等；常见的革兰氏阴性菌：痢疾杆菌、伤寒杆菌、大肠杆菌、变形杆菌、绿脓杆常见的革兰氏阴性菌：痢疾杆菌、伤寒杆菌、大肠杆菌、变形杆菌、绿脓杆菌、百日咳杆菌及霍乱弧菌等。菌、百日咳杆菌及霍乱弧菌等。第8页，共15页，编辑于2022年，星期一多管发酵法配制培养基在密封瓶中的脱水培养基成品要存放在大气湿度低、温度低于 30的暗处，存放时应避免阳光直接照射，并且
8、要避免杂菌侵入和液体蒸发。当培养液颜色变化，或体积变化明显时废弃不用。初步发酵试验水样分别接种到盛有乳糖蛋白胨培养液的发酵管中。在 370.5下培养24h2h。产酸和产气的发酵管表明试验阳性。如在倒管内产气不明显，可轻拍试管，有小气泡升起的为阳性。第9页，共15页，编辑于2022年，星期一多管发酵法复发酵试验微振荡初发酵试验阳性结果的发酵管，用 3mm接种环或灭菌棒将培养物转接到 EC 培养液中。在 44.50.5温度下培养 24h2h（水浴箱的水面应高于试管中培养基液面）。接种后所有发酵管必须在 30min 内放进水浴中。培养后立即观察，发酵管产气则证实为粪大肠菌群阳性。第10页，共15页，
9、编辑于2022年，星期一多管发酵法结果计算第11页，共15页，编辑于2022年，星期一滤膜法滤膜是一种微孔性薄膜。将水样注入已灭菌的放有滤膜（孔径 0.45m）的滤器中，经过抽滤，细菌即被截留在膜上，然后将滤膜贴于品红亚硫酸钠培养基上，37温度下进行培养，计数滤膜上生长的此特性的菌落数，计算出每 1L 水样中含有大肠菌群数。第12页，共15页，编辑于2022年，星期一滤膜法将滤膜放入烧杯中，加入蒸馏水，置于沸水浴中煮沸灭菌三次，每次 15min。前两次煮沸后需更换水洗涤 23 次，以除去残留溶剂。也可用 121灭菌 10min，10min 一到，迅速将蒸汽放出，这样可以尽量减少滤膜上凝集的水分
10、。滤器、接液瓶和垫圈分别用纸包好，在使用前先经 121高压蒸汽灭菌 30min。滤器灭菌也可用点燃的酒精棉球火焰灭菌。以无菌操作把滤器装置装好。过滤：用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘，将粗糙面向上，贴放在已灭菌的滤床上，稳妥地固定好滤器。将适量的水样注入滤器中，加盖，开动真空泵即可抽滤除菌。第13页，共15页，编辑于2022年，星期一滤膜法由滤膜上生长的大肠菌群菌落综述和所取过滤水样量，按下式计算1L水中总大肠菌群数：第14页，共15页，编辑于2022年，星期一其他细菌的测定生活饮用水卫生标准（GB5749-2006）规定每100mL水不得检出总大肠菌群、耐热大肠菌群、大肠埃希氏菌。粪大肠菌群多管发酵法或滤膜法，培养温度44.5沙门氏菌属滤膜法浓缩水样-培养和平板分离-生物化学和血清学鉴定链球菌进入水体后，在水中不再自行繁殖。根据大肠菌群与链球菌菌数的比值不同，可以推测粪便污染的来源第15页，共15页，编辑于2022年，星期一