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1、发酵动力学实验 第1页，此课件共33页哦 发发酵酵动动力力学学是是研研究究各各种种发发酵酵过过程程变变量量在在活活细细胞胞作作用用下下的的变变化化规规律律，以以及及各各种种发发酵酵条条件件对对这这些些变变量量变变化化速速度度的的影响。影响。以以化化学学热热力力学学（研研究究反反应应的的方方向向）和和化化学学动动力力学学（研研究究反反应应的的速速度度）为为基基础础，对对发发酵酵过过程程中中各各种种物物质质的的变变化化进行描述。进行描述。一、发酵动力学研究的内容一、发酵动力学研究的内容2第2页，此课件共33页哦研研究究内内容容微生物生长动力学微生物生长动力学基质消耗动力学基质消耗动力学产物生成动力
2、学产物生成动力学3第3页，此课件共33页哦二、研究发酵动力学的方法二、研究发酵动力学的方法 发酵动力学研究的前提发酵动力学研究的前提反应器内的搅拌系统能保证理想的混合；反应器内的搅拌系统能保证理想的混合；温度、温度、pHpH等环境条件能够控制以保持稳定；等环境条件能够控制以保持稳定；细胞有固有的化学组成，不随发酵时间和某些发酵条件的变化而发生明细胞有固有的化学组成，不随发酵时间和某些发酵条件的变化而发生明显变化；显变化；各种描述发酵动态的变量对发酵条件变化的反应无明显滞后。各种描述发酵动态的变量对发酵条件变化的反应无明显滞后。4第4页，此课件共33页哦1.宏观处理法：宏观处理法：把细胞看成一个
3、均匀分布的物体，不管微观反把细胞看成一个均匀分布的物体，不管微观反应机制，只考虑各个宏观变量之间的关系，这样便得出结构模应机制，只考虑各个宏观变量之间的关系，这样便得出结构模型和非结构模型型和非结构模型2.质量平衡法：质量平衡法：根据质量守恒定律，对某一物质在过程发生前根据质量守恒定律，对某一物质在过程发生前后的质量变化进行恒算。后的质量变化进行恒算。发酵动力学研究方法发酵动力学研究方法5第5页，此课件共33页哦质量平衡式质量平衡式物质在系统中积累的速度物质在系统中积累的速度=物质进入系统的速度物质进入系统的速度+物质在系统中生成的速度物质在系统中生成的速度-物质物质排出系统的速度排出系统的速
4、度-物质在系统中消耗的速度物质在系统中消耗的速度某某物物质质在在系系统统中中的的含含量量能能够够在在线线测测量量或或估估计计，通通过过建建立立上上述述平平衡衡方方程式，就可以确定该物质在系统中变化的动力学。程式，就可以确定该物质在系统中变化的动力学。人为加入或排出和通过相界面传质进入或排出人为加入或排出和通过相界面传质进入或排出6第6页，此课件共33页哦三、发酵动力学研究步骤三、发酵动力学研究步骤获得发酵过程中能够反映发酵过程变化的多种理化参数获得发酵过程中能够反映发酵过程变化的多种理化参数寻求发酵过程变化的多种理化参数与微生物发酵代谢规律之间的相互寻求发酵过程变化的多种理化参数与微生物发酵代
5、谢规律之间的相互关系关系建立多种数学模型，描述多种理化参数随时间变化的关系建立多种数学模型，描述多种理化参数随时间变化的关系利用计算机和程序控制，反复验证多种数学模型的可行性的适用利用计算机和程序控制，反复验证多种数学模型的可行性的适用范围范围7第7页，此课件共33页哦氧需求氧需求好氧发酵好氧发酵兼性好氧发酵兼性好氧发酵厌氧发酵厌氧发酵液体表面发酵液体表面发酵液体深层发酵液体深层发酵深层发酵深层发酵操作方法操作方法分批发酵分批发酵分批补料发酵分批补料发酵连续发酵连续发酵微生物发酵动力学的研究与发酵的种类、微生物发酵动力学的研究与发酵的种类、方式密切相关方式密切相关8第8页，此课件共33页哦四、
6、发酵动力学研究的意义四、发酵动力学研究的意义 通过对发酵反应动力学的研究，进行最佳发酵生产工艺条件的控制。发通过对发酵反应动力学的研究，进行最佳发酵生产工艺条件的控制。发酵过程中，菌体的浓度、基质浓度、温度、酵过程中，菌体的浓度、基质浓度、温度、pH值、溶解氧等工艺参数的控值、溶解氧等工艺参数的控制方案，可以在这研究的基础上进行优化。制方案，可以在这研究的基础上进行优化。设计合理的发酵过程，也必须以发酵动力学模型作为依据，利用计算设计合理的发酵过程，也必须以发酵动力学模型作为依据，利用计算机进行程序设计、模拟最合适的工艺流程和发酵工艺参数，从而使生产控机进行程序设计、模拟最合适的工艺流程和发酵
7、工艺参数，从而使生产控制达到最优化。制达到最优化。发酵动力学的研究还在为试验工厂比拟放大、为分批发酵过渡发酵动力学的研究还在为试验工厂比拟放大、为分批发酵过渡到连续发酵提供理论依据。到连续发酵提供理论依据。第9页，此课件共33页哦 发酵过程中发酵过程中，基质主要消耗在：主要消耗在：满足菌体生长消耗满足菌体生长消耗维维持微生物生存的消耗持微生物生存的消耗合成代谢产物的消耗合成代谢产物的消耗S，基质（底物）；，基质（底物）；G，菌体生长；，菌体生长；M，维持代谢；，维持代谢；P，产物合成，产物合成1、几个基本概念、几个基本概念五、发酵动力学模型五、发酵动力学模型10第10页，此课件共33页哦1.维
8、持因数维持因数(m)：单位重量的（菌体）细胞在单位时间内用单位重量的（菌体）细胞在单位时间内用于维持代谢消耗的基质的量。于维持代谢消耗的基质的量。一般来讲指维持细胞最低活性所需消耗的能量。（碳，氮，一般来讲指维持细胞最低活性所需消耗的能量。（碳，氮，氧等的维持因数氧等的维持因数mc,mn,mo）m ms:s:以基质消耗为基准以基质消耗为基准 的维持因数，的维持因数，X:X:菌体干重；菌体干重；S:S:基质量基质量t:t:发酵时间；发酵时间；M:M:表示维持。表示维持。11第11页，此课件共33页哦基质的消耗速度基质的消耗速度基质的消耗比速率基质的消耗比速率2.比速（率）比速（率）:单位时间内，
9、单位干菌体消耗基质或形成产物单位时间内，单位干菌体消耗基质或形成产物（菌体）的量（菌体）的量(消耗的基质用于维持代谢，菌体生长和产物消耗的基质用于维持代谢，菌体生长和产物合成合成)。比速率是生物反应中用于描述反应速度的常用概念比速率是生物反应中用于描述反应速度的常用概念12第12页，此课件共33页哦菌体的比生长速率菌体的比生长速率产物的比生产速率产物的比生产速率13第13页，此课件共33页哦3.生长得率：菌体的生长量相对于基质消耗量的收得生长得率：菌体的生长量相对于基质消耗量的收得率。率。YX/s:相对与基质消耗的实际生长得率系数相对与基质消耗的实际生长得率系数Yg/s:相对于基质消耗的（纯生
10、长）理论得率系数相对于基质消耗的（纯生长）理论得率系数 特定的基质及在特定环境条件下培养的特定微生物，它是一个常数，特定的基质及在特定环境条件下培养的特定微生物，它是一个常数，又称最大生长得率或生长得率常数。又称最大生长得率或生长得率常数。14第14页，此课件共33页哦4.产物得率：产物的合成相对于基质消耗量的收产物得率：产物的合成相对于基质消耗量的收得率。得率。YP/s:相对于基质消耗的实际产物得率系数相对于基质消耗的实际产物得率系数Yps:相对于基质消耗的产物理论得率系数相对于基质消耗的产物理论得率系数 理论产物得率取决于产物的生物合成途径，对于由特定基质经特定途理论产物得率取决于产物的生
11、物合成途径，对于由特定基质经特定途径产生的特定产物来说，它是一个常数，不因菌株和发酵条件的不同而径产生的特定产物来说，它是一个常数，不因菌株和发酵条件的不同而异。异。15第15页，此课件共33页哦16第16页，此课件共33页哦：菌体的生长比速：菌体的生长比速 s：单一限制性基质浓度：单一限制性基质浓度 Ks：半饱和常数：半饱和常数max:最大比生长速率最大比生长速率s1.Monod方程式方程式2、微生物生长动力学、微生物生长动力学mm/2ks17第17页，此课件共33页哦F莫诺方程成立的假设条件：莫诺方程成立的假设条件：菌体生长为均衡型非结构式生长，细胞成分只需要用一菌体生长为均衡型非结构式生
12、长，细胞成分只需要用一个参数即菌体浓度表示；个参数即菌体浓度表示；只有一种底物是生长限制性底物，并且没有反馈抑制性产物只有一种底物是生长限制性底物，并且没有反馈抑制性产物出现；出现；微生物生长没有动态滞后性。微生物生长没有动态滞后性。18第18页，此课件共33页哦 Monod方方程程中中单单一一限限制制性性基基质质可可以以是是培培养养基基中中任任何何一一种种与与微微生生物物生生长长有有关关的的营营养养物物，只只要要该该基基质质相相对对缺缺乏乏，就就成成为为限限制制性性生生长长因因子子。实实际际过过程程中中，可可能能出出现现多多种种限限制制性性基基质质和和抑制性物抑制性物质质，影响了，影响了Mo
13、nod方程的适用性。方程的适用性。19第19页，此课件共33页哦u Ks，微生物微生物对对基基质质的的饱饱和常数和常数,当当=1/2max，s=Ksu 当当s Ks，基质浓度较高时，基质浓度较高时，与与s无关，零级反应。无关，零级反应。u 当当s趋近于无穷大时，趋近于无穷大时，=max.max是理论上最大的生长潜力。是理论上最大的生长潜力。mm/2kss20第20页，此课件共33页哦米氏方程米氏方程mm/2kss莫诺方程莫诺方程21第21页，此课件共33页哦莫莫诺诺方程与米氏方程方程与米氏方程 二者形式相同，但微生物生二者形式相同，但微生物生长长是是细细胞群体生命活胞群体生命活动动的的综综合表
14、合表现现，机理非常复，机理非常复杂杂。Monod方程与米氏方程的区方程与米氏方程的区别别与与联联系是：系是：Monod方程是方程是对实验现对实验现象的象的总结总结，是，是经验经验方程（方程（empirical model）；）；米氏方程是根据米氏方程是根据酶酶反反应应机理推机理推导导得出，是机理方程（得出，是机理方程（mechanistic model）。）。22第22页，此课件共33页哦 由于微生物的代谢产物，特别是次级代谢产物的合成途径特由于微生物的代谢产物，特别是次级代谢产物的合成途径特别复杂，其动力学过程不仅受菌体自身基因型的限制，还与其别复杂，其动力学过程不仅受菌体自身基因型的限制，
15、还与其生活的外部条件有密切关系。目前整个动态变化过程的规律仍生活的外部条件有密切关系。目前整个动态变化过程的规律仍不是十分清楚，大多数研究只是限于宏观变量的非结构模型。不是十分清楚，大多数研究只是限于宏观变量的非结构模型。3、微生物的产物生成动力学、微生物的产物生成动力学23第23页，此课件共33页哦根据细胞生长与产物形成是否偶联进行分类根据细胞生长与产物形成是否偶联进行分类 Luedeking-Piret模型是一常见的分批发酵产物合成动力学模型是一常见的分批发酵产物合成动力学模型，它把产物生成速率看作是菌体生长速率和菌体浓模型，它把产物生成速率看作是菌体生长速率和菌体浓度的函数，用数学式表示
16、为：度的函数，用数学式表示为：式中：式中：与生长偶联的产物形成系数与生长偶联的产物形成系数 非生长偶联的相关系数非生长偶联的相关系数 24第24页，此课件共33页哦偶联型：偶联型：产物生成速率与细胞生长速率有紧密联系，合产物生成速率与细胞生长速率有紧密联系，合成的产物通常是分解代谢的直接产物，如葡萄糖厌氧发成的产物通常是分解代谢的直接产物，如葡萄糖厌氧发酵生成乙醇，或者好气发酵生成中间代谢物酵生成乙醇，或者好气发酵生成中间代谢物(氨基酸或氨基酸或维生素维生素)。这类初级代谢产物的生产速率与生长直接。这类初级代谢产物的生产速率与生长直接有关。式有关。式中中00，0 0混合型：混合型：生长与产物生
17、成相关生长与产物生成相关(如乳酸、柠檬酸、谷如乳酸、柠檬酸、谷氨酸等的发酵氨酸等的发酵)，发酵产物生成速率可由，发酵产物生成速率可由Luedeking-Luedeking-PiretPiret模型数学式描述，模型数学式描述，式中式中00，00。该混合型模型该混合型模型复杂的形成是将常数复杂的形成是将常数、作为变数，它们在分批发酵作为变数，它们在分批发酵的四个时期分别具有特定的数值。的四个时期分别具有特定的数值。根据细胞生长与产物形成是否偶联进行分类根据细胞生长与产物形成是否偶联进行分类 25第25页，此课件共33页哦非生长偶联型：非生长偶联型：在生长和产物无关联的发酵模式中，细胞在生长和产物无
18、关联的发酵模式中，细胞生长时，无产物，但细胞停止生长后，则有大量产物积累，产生长时，无产物，但细胞停止生长后，则有大量产物积累，产物的形成速率只与细胞积累量有关。产物合成发生在细胞生长物的形成速率只与细胞积累量有关。产物合成发生在细胞生长停止之后停止之后(即产生于次级生长即产生于次级生长)，故习惯上把这类与生长，故习惯上把这类与生长无关联的产物称为次级代谢产物，但不是所有次级无关联的产物称为次级代谢产物，但不是所有次级代谢产物一定是与生长无关联的。大多数抗生素和代谢产物一定是与生长无关联的。大多数抗生素和微生物毒素的发酵都是非生长偶联的例子，非偶联微生物毒素的发酵都是非生长偶联的例子，非偶联型
19、发酵的生产速率只与已有的菌体量有关，而比生型发酵的生产速率只与已有的菌体量有关，而比生产速率产速率 为一常数，与比生长速率为一常数，与比生长速率 没有直接关系。因此，没有直接关系。因此，其产率和产物浓度高低取决于细胞生长期结束时的生物量。其产率和产物浓度高低取决于细胞生长期结束时的生物量。式式中中 0 0，00根据细胞生长与产物形成是否偶联进行分类根据细胞生长与产物形成是否偶联进行分类 26第26页，此课件共33页哦4、微生物的基质消耗动力学、微生物的基质消耗动力学假设发酵过程没有中间代谢产物积累，则含碳基质的质量平衡算式为：消耗的含碳基消耗的含碳基质质=维维持代持代谢谢消耗量消耗量+菌体生菌
20、体生长长消耗量消耗量+产产物合成消耗量物合成消耗量 即：27第27页，此课件共33页哦微分后：微分后：式中：式中：ms维持系数，即单位菌体、单位时间内用于菌体维持生命活动的基质量单纯用于合成单位菌体所消耗的基质量单纯用于合成单位产物所消耗的基质量上式反映了基质消耗与菌体生长及产物生成之间的关上式反映了基质消耗与菌体生长及产物生成之间的关系。因此，当生长动力学模型和产物生成动力学模型系。因此，当生长动力学模型和产物生成动力学模型确定后，基质消耗动力学模型即可确定。确定后，基质消耗动力学模型即可确定。28第28页，此课件共33页哦六、发酵动力学实验设计六、发酵动力学实验设计1.实验材料实验材料菌种
21、：菌种：雅致放射毛霉AS3.2778培养基：培养基：斜面培养基 种子培养基 发酵培养基（参考实验指导）试剂：试剂：DNS试剂2.实验步骤实验步骤菌种斜面培养：菌种斜面培养：配制PDA培养基100ml，分装试管，灭菌后摆成斜面，将雅致放射毛霉接种于斜面上，25 培养48h。种子培养：种子培养：斜面菌种在25恒温培养48h 后，转接于500mL 摇瓶，装液量为150 mL，160 r/min 25，摇床培养16h为种液。29第29页，此课件共33页哦发酵培养发酵培养:5 L 发酵罐中装入3.5 L 的发酵培养基，培养基在在121 下灭菌30 min，温度降至30 时，接入种液，接种量为4%控制适宜
22、的通气比、保持罐压为0.05 MPa、发酵温度30、搅拌速度160 r/min条件下发酵84h每12 h 取样1 次进行菌体生长量、还原糖产量、蔗糖糖消耗测定结果为3 次重复。3.分析方法分析方法菌体生物量的测定菌体生物量的测定：采用比浊法，发酵液以蒸馏水稀释，5000 r/min 离心10 min，除去上清液，菌体沉淀用生理盐水洗2-3次再离心去上清液，用生理盐水重悬并进行适当稀释，测定其OD600nm。30第30页，此课件共33页哦还原糖的测定：还原糖的测定：（1）在碱性条件下，还原糖与3、5二硝基水杨酸共热，3、5二硝基水杨酸被还原为3氨基5硝基水杨酸（棕红色物质），还原糖则被氧化成糖酸
23、及其它物质。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度呈一定的比例关系，可在722型分光光度计540nm波长测定棕红色物质的吸光度值。查标准曲线计算，可求出发酵液中还原糖的含量。（2）取取4支干燥试管支干燥试管,编号编号,按下表所示的量按下表所示的量,精确加入待测液和试剂精确加入待测液和试剂(ml):管号管号项目项目 空白空白 还原糖还原糖 0 1 2 3样品量样品量 0 0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0蒸馏水蒸馏水 3.5 3.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.53 3、5 5二硝基二硝基水杨酸试剂水杨酸试剂 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1
24、.5 1.5 1.5总体积总体积 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.031第31页，此课件共33页哦加完试剂后,将各管摇匀，戴上小漏斗，在沸水浴中加热5分钟，立即用冷水冷却至室温，再向各管中加入蒸馏水20.0ml，用橡皮塞塞住管口，颠倒混匀。切勿用力振摇，引入气泡。在540nm波长下，以0号管为空白，在分光光度计上测定出各管溶液的吸光度值。（3）以管1、2、3的吸光度值的平均值在标准曲线上查出相应的还原糖毫克数，按下式计算样品中还原糖的百分含量：还原糖32第32页，此课件共33页哦蔗糖测定：蔗糖测定：蔗糖经6mol/L盐酸水解转化为还原糖，再按还原糖测定。水解前后还原糖的差值为蔗糖含量。根据实际情况选择模型方程，由所测得不同时间的菌根据实际情况选择模型方程，由所测得不同时间的菌体生长、基质消耗量和产物形成量画出动力学曲线和体生长、基质消耗量和产物形成量画出动力学曲线和计算出动力学方程。计算出动力学方程。33第33页，此课件共33页哦