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1、第三章生物信息的传递上转录本讲稿第一页，共六十七页 基本概念 转录起始：RNA聚合酶、启动子 转录的基本过程 转录后加工 原核生物与真核生物mRNA的特征比较 RNA合成与DNA合成异同点Contents本讲稿第二页，共六十七页RNA的分类的分类vDNA是遗传信息的载体，遗传信息的作用通常由蛋白质的功能来实现，但DNA并非蛋白质合成的直接模板，合成蛋白质的模板是RNA。正常细胞遗传信息的流向是：vRNA包括hnRNA（不均一核RNA，heterogeneous nuclear RNA)、mRNA、rRNA、tRNA、snRNA（小核RNA,small nuclear RNA）和scRNA（小胞
2、浆RNA，small cytosol RNA)，它们均与遗传信息的表达有关。vmRNA是遗传信息的携带者，其核苷酸序列决定着合成蛋白质的氨基酸序列；hnRNA是mRNA的前体，含有转录的、但不出现于成熟mRNA中的核苷酸片段(内含子)；vtRNA识别密码子，将正确的氨基酸转运至蛋白质合成位点；vrRNA是蛋白质合成机器核蛋白体的组成成分；snRNA在hnRNA向mRNA转变过程的剪接中起十分重要的作用。本讲稿第三页，共六十七页一、基本概念生物体以DNA为模板合成RNA的过程。基因表达的第一步基因表达的第一步 以以D.S.DNA中的一条单链作为转录的模板中的一条单链作为转录的模板 在在依赖依赖D
3、NA的的RNA聚合酶聚合酶的作用下的作用下 按按A U，C G 配对的原则，合成配对的原则，合成RNA分子分子.模板单链模板单链 DNA的极性方向为的极性方向为3 5,而非模板单链而非模板单链 DNA的极性方向与的极性方向与RNA链相同，均为链相同，均为5 3.转录(transcription)：本讲稿第四页，共六十七页启动子（转录促进子）启动子（转录促进子）：RNA聚合酶结合于DNA特异的转录起始区。启动子通常靠近转录起点。转录单位转录单位（transcription unit）：转录子 一段从启动子开始至终止子结束的DNA序列。转录原点记为转录原点记为+1+1，其上游记为，其上游记为负值负
4、值，下游记为，下游记为正值正值+1-10+10upstreamstart pointdownstream本讲稿第五页，共六十七页参与转录的物质参与转录的物质原料:NTP(ATP,UTP,GTP,CTP)模板:DNA酶:RNA聚合酶其他蛋白质因子RNA合成方向合成方向：5 3本讲稿第六页，共六十七页转录的不对称性：在RNA的合成中，DNA的二条链中仅有一条链可作为转录的模板，称为转录的不对称性。编码链与模板链与mRNA序列相同的那条DNA链称为编码链（有意义链或正链）；将另一条根据碱基互补原则指导mRNA合成的DNA链称为模板链(反义链或负链）。结构基因：DNADNA分子上转录出分子上转录出RN
5、ARNA的区段，称为结构基因。的区段，称为结构基因。本讲稿第七页，共六十七页转转录录RNADNA 本讲稿第八页，共六十七页 基本概念 转录起始：RNA聚合酶、启动子 转录的基本过程 转录后加工 原核生物与真核生物mRNA的特征比较 RNA合成与DNA合成异同点Contents本讲稿第九页，共六十七页二、参与转录起始的关键酶与元件（一）RNA聚合酶原核生物RNA聚合酶（大肠杆菌为例）全酶（holo enzyme）=核心酶（core enzyme）+（西格马）因子大肠杆菌RNA聚合酶由5个亚基所组成即2。全酶：大肠杆菌RNA聚合酶整个酶分子2核心酶：亚基解离后的其余部分2本讲稿第十页，共六十七页本
6、讲稿第十一页，共六十七页大肠杆菌RNA聚合酶的组成分析亚基（因子）基因相对分子量亚基数组分功能rpoA365002核心酶核心酶组装，参与全酶和启动子的牢固结合rpoB1510001核心酶催化磷酸二酯键的形成，和共同形成RNA合成的活性中心rpoC1550001核心酶碱性很强西格马 rpoD700001因子存在多种因子，用于识别不同的启动子欧米伽？110001核心酶功能不祥NusANusA蛋白1NusA因子重要本讲稿第十二页，共六十七页因子：因子：促使促使RNApol与与DNA 模板链结合模板链结合 位于前端的位于前端的因子使双链解链为单链因子使双链解链为单链 位于尾端的位于尾端的因子使单链新聚
7、合为双链因子使单链新聚合为双链 核心酶的组建因子核心酶的组建因子+2+本讲稿第十三页，共六十七页因子：因子：促进促进RNA pol+NTP RNA elongation 催化催化磷酸脂键的形成磷酸脂键的形成 与与 Rho()因子竞争因子竞争RNA 3-end 构成构成Holo Enzyme后，后，因子含有因子含有 两个位点两个位点I site(Rif S):E site(Rif R):专一性地结合专一性地结合ATP or GTP要要求高浓度的求高浓度的ATP or GTP对对 NTP 非专一性结合非专一性结合本讲稿第十四页，共六十七页 因子：因子：强碱性亚基强碱性亚基 促使促使RNA poly
8、merase与与非模板链（非模板链（sense strand）结合结合 受蛋白酶受蛋白酶K抑制抑制 本讲稿第十五页，共六十七页因子：因子：重复使用重复使用(Re-usable)使使 Holo-enzyme识别识别Sextama Box,与模板链结合与模板链结合 修饰修饰 RNApol 构型：构型：降低全酶与降低全酶与DNA的的非专一性非专一性结合力结合力增强全酶与增强全酶与R,B site的专一性结合力的专一性结合力 本讲稿第十六页，共六十七页NusA 蛋白：蛋白：一个RNA聚合酶附属因子。69 Kd,acid protein 和因子一样可以和RNA聚合酶的核心酶结合，但不是很牢固。所以在纯化
9、时，因子就取代NusA蛋白。NusA+core E Impel RNA pol.使聚合酶在终止位点停下来等待使聚合酶在终止位点停下来等待因子（Rho factor）来终止RNA转录。本讲稿第十七页，共六十七页RNA聚合酶与DNA聚合酶的区别RNA聚合酶DNA聚合酶大小(M)大，4.8105dol小，1.09105dol引物无有产物较短，游离较长，与模板以氢键相连作用方式一条链的某一段两条链同时进行外切酶活性无5 3，3 5校对合成能力 无有修复能力无有本讲稿第十八页，共六十七页（二）启动子(promoter)1.启动子定义：指能被RNA聚合酶识别、结合并启动 基因转录的一段DNA序列，本身不被
10、转录。2.分类：原核生物启动子、真核生物启动子。3.转录起点：与新生RNA链第一个核甘酸相对应DNA链上的碱基。本讲稿第十九页，共六十七页 Promoter region including：Sextama Box:RNApol.recognition site(R site)TTGACA(Sextama Box)-35 site RNApol.loosely binding sitePribnow Box:TATAAT(pribnow Box)-10 site RNApol.firmly binding site(B site)Initiation site:+1 RNA transcrip
11、tional startpoint(I site)A/G (?)-35(R)-10(B)+1(I)RNA 原核生物启动子结构本讲稿第二十页，共六十七页 R -35 B-10I+1 Sextama BoxPribnow BoxInitiation本讲稿第二十一页，共六十七页编码链AACTGTATATTA模板链TTGACATATAAT35DNA转录起始点Pr ibnow盒子启动子35 10 +1转录区53RNASextama box(PC区）TATA区：酶的紧密结合位点（富含AT碱基，利于双链打开）TTGACA区(PC区)：提供了RNA聚合酶全酶识别的信号,是 因子识别和结合的位点。距离的大小是决
12、定启动子强度的重要因素之一。典型启动子的结构16-19bp5-9bp本讲稿第二十二页，共六十七页大肠杆菌RNA聚合酶全酶所识别的启动子区与标准启动子序列同源性愈高与标准启动子序列同源性愈高 启动强度愈大；启动强度愈大；与标准启动子序列同源性愈低与标准启动子序列同源性愈低 启动强度愈小；启动强度愈小；与标准启动子序列差异很大与标准启动子序列差异很大 由另一种由另一种因子启动因子启动本讲稿第二十三页，共六十七页Stages of transcription initiationClosed promoter complexOpen promoter complexIncorporating the
13、 first few NtsPromoter clearance本讲稿第二十四页，共六十七页 基本概念 转录起始：RNA聚合酶、启动子 转录的基本过程 转录后加工 原核生物与真核生物mRNA的特征比较 RNA合成与DNA合成异同点Contents本讲稿第二十五页，共六十七页三、转录的基本过程1、起始位点的识别：RNA聚合酶与启动子DNA双链相互作用并与之相结合的过程。2、转录起始：RNA链上第一个核甘酸键的产生3、RNA链的延伸 亚基脱落，RNApol聚合酶核心酶变构，与模板结合松弛，沿着DNA模板前移；在核心酶作用下，NTP不断聚合，RNA链不断延长。本讲稿第二十六页，共六十七页本讲稿第二十
14、七页，共六十七页 原原 核核 生生 物物 转转 录录 的的 起起 始始 与与 延延 伸伸 过过 程程本讲稿第二十八页，共六十七页 核心酶核心酶 DNA RNA RNA-DNA杂交区长度为12个碱基，当RNA链离开模板链后DNA链重新复链。DNA的解链部分约为17个碱基，与开放复合物在启动子初形成时长度相同。本讲稿第二十九页，共六十七页4、转录终止 终止子（terminator，t）强终止子内部终止子 弱终止子需要因子（Rho factor）又称为依赖性终止子Rho-dependent terminator）分类：不依赖Rho()因子的转录终止依赖Rho()因子的转录终止本讲稿第三十页，共六十七
15、页不依赖因子的终止 终止位点上游一般存在一个富含GC碱基的二重对称区，RNA形成发夹结构；在终止位点前面有一段由4-8个A组成的序列，RNA的3端为寡聚U。本讲稿第三十一页，共六十七页发夹式结构和寡聚发夹式结构和寡聚U U的共同作用使的共同作用使RNARNA从三元复合物中解离出来。从三元复合物中解离出来。本讲稿第三十二页，共六十七页 终止效率与二重对称序列和寡聚U的长短有关，长度增加，效率增加。B：发夹的形成破坏了一部分RNA-DNA杂交链，仅留下多聚U与多聚A的一段杂交链。C：多聚U与多聚A杂交物解离，转录本被释放。本讲稿第三十三页，共六十七页依赖因子的终止因子：六聚体蛋白、水解各种核甘三磷
16、酸促使新生RNA链从三元转录复合物中解离出来，从而终止转录。本讲稿第三十四页，共六十七页本讲稿第三十五页，共六十七页转录的基本过程本讲稿第三十六页，共六十七页真核生物RNA的合成酶位置转录产物相对活性 对-鹅膏蕈碱的敏感性RNA聚合酶核仁rRNA50-70%不敏感(大于10-3mol/L时轻微抑制）RNA聚合酶核质mRNA和snRNA20-40%敏感(10-9-10-8mol/L时被抑制）RNA聚合酶核质tRNA和5SrRNA约10%二者之间，存在物种特异性真核细胞的三种RNA聚合酶特征比较本讲稿第三十七页，共六十七页1、核心启动子（core promoter）定义：指保证RNA聚合酶转录正常
17、起始所必需的、最少的DNA序列，包括转录起始位点及转录起始位点上游TATA区TATA 常在-25bp左右，相当于原核的-10序列T T8585A A9797T T9393A A8585A A6363A A8383A A5050作用：选择正确的转录起始位点，保证精确起始2、上游启动子元件（upstream promoter element，UPE）包括CAAT盒（CCAAT）和GC盒（GGGCGG）等。CAAT：-70-80bp GGGCGG：-80-110bp作用：控制转录起始频率。真核生物启动子本讲稿第三十八页，共六十七页本讲稿第三十九页，共六十七页 转录因子 转录复合体TBPTAFsTFI
18、IATFIIB TFIIF Pol IITFIIE RNA pol 的转录起始 真核生物转录起始复合物本讲稿第四十页，共六十七页真核生物真核生物RNARNA聚合酶聚合酶转录过程所需的蛋白质因子转录过程所需的蛋白质因子vTBP：专门识别TATA盒vTFA：稳定TBP、TFB对启动子的结合vTFB：结合与TBP，组装pol-TFF复合物vRNA聚合酶：催化RNA合成，12亚基。vTFF：结合RNApol-TFB，防止RNApol结合于 非特异DNA顺序vTFE：组装TFF，ATP酶和解旋酶活性。vTFH：DNA解旋酶活性、RNApol磷酸化（转录开始）、组装核苷酸本讲稿第四十一页，共六十七页真核生
19、物真核生物RNARNA合成的起始、延伸、终止和释放合成的起始、延伸、终止和释放v起始：转录开始，在RNA最初60-70个核苷酸残基的合成期间，首先是TFE被释放；然后是TFH被释放。v延伸：TFF一直和RNApol相结合，RNApol与延长因子结合，活性大大增强。v终止：机制不祥。v释放：RNApol脱磷酸化，并重新进入循环，准备进入另一次转录起始。本讲稿第四十二页，共六十七页 基本概念 转录起始：RNA聚合酶、启动子 转录的基本过程 转录后加工 原核生物与真核生物mRNA的特征比较 RNA合成与DNA合成异同点Contents本讲稿第四十三页，共六十七页四、转录后加工本讲稿第四十四页，共六十
20、七页原核生物RNA的转录后加工原核生物原核生物tRNAtRNA前体的加工前体的加工 1）tRNA 5端：RNA核酸内切酶RNase P RNase P：蛋白质和RNA（能单独切断5端序列）为 tRNA 5端成熟酶。2）tRNA 3端：RNA核酸内切酶RNase F从靠近3端切断前体分子；RNA核酸外切酶RNase D从前体3切去附加的序列，直至tRNA 3端。RNase D：有严格的选择活性，是tRNA的3端成熟酶。3）在tRNA 3端加胞苷酸-胞苷酸-腺苷酸（-CCAOH）：成熟tRNA 3端都有-CCAOH。添加CCA：tRNA核苷酰转移酶 4）核苷酸的修饰异构化：tRNA甲基化酶、tRN
21、A 假尿嘧啶核苷合成酶本讲稿第四十五页，共六十七页原核生物原核生物rRNArRNA前体的加工：前体的加工：甲基化修饰，除5SrRNA无修饰成分不进行甲基化修饰外，其他r RNA均有多个修饰成分。原核生物原核生物mRNAmRNA前体的加工：前体的加工：mRNA大多数不用加工。单顺反子mRNA：只编码一个蛋白质的mRNA。多顺反子mRNA：编码多个蛋白质的mRNA。少数多顺反子mRNA需通过核酸内切酶切成较小单位后才能进行翻译。本讲稿第四十六页，共六十七页真核生物RNA的转录后加工v5端加帽v3端加尾vRNA的拼接vRNA的编辑本讲稿第四十七页，共六十七页 5端的一个核苷酸总是7-甲基鸟核苷三磷酸
22、（m7Gppp）。mRNA5端的这种结构称为帽子（cap）。帽子结构功能：能被核糖体小亚基识别，促使mRNA和核糖体的结合；m7Gppp结构能有效地封闭mRNA 5末端，以保护mRNA免受5核酸外切酶的降解，增强mRNA的稳定。1、在5端加帽本讲稿第四十八页，共六十七页m7Gppp鸟甘酸转移酶本讲稿第四十九页，共六十七页2、3端加尾：RNA末端腺苷酸转移酶多聚腺苷酸尾巴：提高了mRNA在细胞质中的稳定性。AAUAAA：准确切割加poly（A）本讲稿第五十页，共六十七页本讲稿第五十一页，共六十七页3、RNA的拼接：去除插入部分（内含子Intron),使编码区（外显子Exon）成为连续序列）。使一
23、个基因产生多种基因产物。本讲稿第五十二页，共六十七页 5.AAGUAAGU.CURAY.(10-40)(U/C)11NCAGG.3 IntronexonexonPolyprimidine生物体内内含子的主要类型：GU-AG、AU-AC、类内含子、类内含子参与RNA剪接的物质：snRNA（核内小分子RNA）snRNP（与snRNA结合的核蛋白）本讲稿第五十三页，共六十七页HeLa cell-globinEEIRNA剪接的分子证据本讲稿第五十四页，共六十七页类内含子的自我剪接1th414Nt2ed15+399Nt3rd4+395Nt(L19)Intron的剪接经过的剪接经过3次转酯反应次转酯反应
24、本讲稿第五十五页，共六十七页类内含子的自我剪接本讲稿第五十六页，共六十七页4、RNA的编辑v编编辑辑（editing）是指转录后的RNA在编码区发生碱基的突变、加入或丢失等现象。Editing 的生物学意义的生物学意义形成形成/删除删除AUG,UAA,UAG,UGA 改变改变codon信息信息 扩大编码的遗传信息量扩大编码的遗传信息量 mRNA editing 较大程度地改变了较大程度地改变了DNA的遗传信息，的遗传信息，使该基因的使该基因的DNA序列仅是一串序列仅是一串简略意义模糊的简略意义模糊的序序 列（列（abbreviated）或称为）或称为隐秘基因、模糊基因隐秘基因、模糊基因cryp
25、tic gene,cryptogene）中心法则的发展中心法则的发展本讲稿第五十七页，共六十七页C变为U碱基的突变Cytidinedeaminase氧化脱氨氧化脱氨CUorTrans-glycosylation转糖酰基作用转糖酰基作用本讲稿第五十八页，共六十七页尿苷酸的缺失和添加v1986.R.Benne在研究锥虫线粒体mRNA转录加工时发现mRNA的多个编码位置上加入或丢失尿苷酸，1990年在高等动物和病毒中也发现了编辑现象。本讲稿第五十九页，共六十七页 锥虫coxII 基因的编辑本讲稿第六十页，共六十七页本讲稿第六十一页，共六十七页 基本概念 转录起始：RNA聚合酶、启动子 转录的基本过程
26、 转录后加工 原核生物与真核生物mRNA的特征比较 RNA合成与DNA合成异同点Contents本讲稿第六十二页，共六十七页五、原核生物与真核生物mRNA的特征比较1、原核生物mRNA的特征 半衰期短 多以多顺反子的形式存在 5 端无“帽子”结构，3 端没有或只有较短的poly（A）结构。SD序列：mRNA中用于结合原核生物核糖体的序列。2、真核生物mRNA的特征 5 端存在“帽子”结构多数mRNA 3 端具有poly(A)尾巴(组蛋白除外）以单顺反子的形式存在本讲稿第六十三页，共六十七页原核生物和真核生物mRNA结构的比较本讲稿第六十四页，共六十七页 基本概念 转录起始：RNA聚合酶、启动子
27、 转录的基本过程 转录后加工 原核生物与真核生物mRNA的特征比较 RNA合成与DNA合成异同点Contents本讲稿第六十五页，共六十七页六、RNA合成与DNA合成异同点相同点：1、都以DNA链作为模板2、合成的方向均为53 3、聚合反应均是通过核苷酸之间形成的3,5-磷酸二酯键，使核苷酸链延长。本讲稿第六十六页，共六十七页不同点：复制复制转录转录模板模板两条链均复制两条链均复制模板链转录模板链转录（不对称转录）（不对称转录）原料原料dNTPdNTPNTPNTP酶酶DNADNA聚合酶聚合酶RNARNA聚合酶聚合酶产物产物子代双链子代双链DNADNA（半保留复制）（半保留复制）mRNAmRNA，tRNA tRNA，rRNA rRNA配对配对A-TA-T；G-CG-CA-UA-U；T-AT-A；G-CG-C引物引物RNARNA引物引物无无本讲稿第六十七页，共六十七页