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1、第十章第十章第十章第十章 维生素的测定维生素的测定维生素的测定维生素的测定海南大学食品学院海南大学食品学院第一节第一节 概概 述述l 维生素是维持人体正常生命活动所必需的一类天然有维生素是维持人体正常生命活动所必需的一类天然有机化合物。其种类很多，目前已确认的有机化合物。其种类很多，目前已确认的有3030余种，其中余种，其中被认为对维持人体健康和促进发育至关重要的有被认为对维持人体健康和促进发育至关重要的有2020余种。余种。l 人人体体如如从从膳膳食食中中摄摄入入维维生生素素的的量量不不足足或或者者机机体体由由于于某某种种原原因因吸吸收收或或合合成成发发生生障障碍碍时时，就就会会引引起起各各
2、种种维维生生素素缺缺乏乏症症。近近几几年年已已经经查查明明仅仅有有少少数数几几种种维维生生素素可可以以在在体体内内合成，大多数维生素都必须由食物供给。合成，大多数维生素都必须由食物供给。维生素的分类维生素的分类1、脂溶性维生素：、脂溶性维生素：能溶于脂肪或脂溶剂，在食物中与能溶于脂肪或脂溶剂，在食物中与脂类共存的一类维生素，包括脂类共存的一类维生素，包括A、D、E、K，其共，其共同特点是摄入后存在于脂肪组织中，不能从尿中排同特点是摄入后存在于脂肪组织中，不能从尿中排除，大剂量摄入时可能引起中毒。由于可储藏在脂除，大剂量摄入时可能引起中毒。由于可储藏在脂肪中，故不需每天供给。肪中，故不需每天供给
3、。2、水溶性维生素：能溶于水，包括、水溶性维生素：能溶于水，包括B族、族、C，其共同，其共同特点是一般只存在于植物性食品中，满足组织需要特点是一般只存在于植物性食品中，满足组织需要后都能从机体排出，需要每天供给。后都能从机体排出，需要每天供给。测定食品中维生素的含量的意义测定食品中维生素的含量的意义v评价食品的营养价值；评价食品的营养价值；v寻找富含维生素的食品资源；寻找富含维生素的食品资源；v指导人们合理调整膳食结构，防止维生素缺乏症或指导人们合理调整膳食结构，防止维生素缺乏症或维生素中毒；维生素中毒；v研究维生素在食品加工、贮存等过程中的稳定性，研究维生素在食品加工、贮存等过程中的稳定性，
4、指导人们制定合理的工艺及贮存条件；指导人们制定合理的工艺及贮存条件；v监督维生素强化食品的强化剂量，防止因摄入过多监督维生素强化食品的强化剂量，防止因摄入过多而引起维生素中毒。而引起维生素中毒。第二节第二节 脂溶性维生素的测定脂溶性维生素的测定VA、VD、VE、VK与类脂物一起存于食物中。与类脂物一起存于食物中。脂溶性维生素具有以下理化性质：脂溶性维生素具有以下理化性质：1、溶解性：不溶于水，易溶于脂肪、乙醇、丙酮、氯仿、乙醚、溶解性：不溶于水，易溶于脂肪、乙醇、丙酮、氯仿、乙醚、苯等有机溶剂。苯等有机溶剂。2、耐酸碱性：、耐酸碱性：VA、VD对酸不稳定，对碱稳定，对酸不稳定，对碱稳定，VE对
5、碱不稳定，对碱不稳定，但在抗氧化剂存在下或惰性气体保护下，也能经受碱的煮沸。但在抗氧化剂存在下或惰性气体保护下，也能经受碱的煮沸。3、耐热性、耐氧化性：耐热性好，、耐热性、耐氧化性：耐热性好，VA易被氧化，光和热促进其易被氧化，光和热促进其氧化氧化；VE易被氧化，对可见光稳定但易被紫外光氧化；易被氧化，对可见光稳定但易被紫外光氧化；VK易被光、易被光、氧化剂及醇氧化。氧化剂及醇氧化。根据上述性质测定脂溶性维生素时，通常：根据上述性质测定脂溶性维生素时，通常：皂化样品皂化样品 水洗去除类脂物水洗去除类脂物 有机溶剂有机溶剂提取脂溶性维生素提取脂溶性维生素(不皂化物不皂化物)浓缩浓缩 溶于适当的溶
6、剂溶于适当的溶剂 测定。测定。在皂化和浓缩时，为防止维生素的氧化分解，在皂化和浓缩时，为防止维生素的氧化分解，常加入抗氧化剂常加入抗氧化剂(如焦性没食子酸、维生素如焦性没食子酸、维生素C C等等)。一、维生素一、维生素A A的测定的测定 维生素维生素A A存在于动物性脂肪中，主要来源于肝脏、存在于动物性脂肪中，主要来源于肝脏、鱼干油、蛋类、乳类等动物性食品中。植物性食品中鱼干油、蛋类、乳类等动物性食品中。植物性食品中不含不含V VA A，但在深色果蔬中含有胡萝卜素，它在人体内，但在深色果蔬中含有胡萝卜素，它在人体内可转变为可转变为V VA A，故称为，故称为V VA A原。原。lGB/T500
7、9.822003中第一法中第一法l高效液相色谱法测定维生素高效液相色谱法测定维生素A是近几年发展起来的方是近几年发展起来的方法，此法能快速分离、同时测定维生素法，此法能快速分离、同时测定维生素A和维生素和维生素E。l最小检出量分别为最小检出量分别为VA：0.8ng；-E：91.8ng；-E：36.6ng；-E：20.6ng。（一）（一）高效液相色谱法测定食物中高效液相色谱法测定食物中VA、VE1、原理、原理v食物中的维生素食物中的维生素A及维生素及维生素E经皂化提取以后，将经皂化提取以后，将其从不可皂化的部分提取到有机溶剂中。用其从不可皂化的部分提取到有机溶剂中。用HPLC法法测定维生素测定维
8、生素A及维生素及维生素E的含量。的含量。2、分析步骤、分析步骤v皂化皂化提取提取洗涤洗涤萃取萃取浓缩浓缩溶解溶解离心离心测测定定结果计算结果计算（1）皂化皂化v称取称取110g样品（含维生素样品（含维生素A约约3g)于皂化瓶中，加于皂化瓶中，加30mL无无水乙醇，进行搅拌，水乙醇，进行搅拌，直到颗粒物分散均匀为止。加直到颗粒物分散均匀为止。加50mL10抗抗坏血酸，苯并坏血酸，苯并e芘标准液芘标准液2.00mL，混匀。加，混匀。加10mL(1+1)氢氧化钾，氢氧化钾，混匀。于沸水浴上回馏混匀。于沸水浴上回馏30min使皂化完全。皂化后立即于水中冷却。使皂化完全。皂化后立即于水中冷却。（2）提取
9、）提取v将皂化后的样品移入分液漏斗中，用将皂化后的样品移入分液漏斗中，用50mL水分水分23次洗皂次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中。用约化瓶，洗液并入分液漏斗中。用约100mL乙醚分两次洗皂化瓶乙醚分两次洗皂化瓶及其残渣，乙醚液并入分液漏斗中。如有残渣，可将此液通过及其残渣，乙醚液并入分液漏斗中。如有残渣，可将此液通过有少许脱脂棉的漏斗滤入分液漏斗。轻轻振摇分液漏斗有少许脱脂棉的漏斗滤入分液漏斗。轻轻振摇分液漏斗2min，静置分层，弃去水层。静置分层，弃去水层。（3）洗涤）洗涤v用约用约50mL水洗分液漏斗中的乙醚层，水洗至水层不显碱性，水洗分液漏斗中的乙醚层，水洗至水层不显碱性，（最初水洗轻摇
10、，逐次振摇强度可增加）。（最初水洗轻摇，逐次振摇强度可增加）。（4）浓缩）浓缩v将乙醚提取液经过无水硫酸钠（约将乙醚提取液经过无水硫酸钠（约5g）滤入与球）滤入与球形蒸发瓶内，用约形蒸发瓶内，用约10mL乙醚冲洗分液漏斗及无水硫酸乙醚冲洗分液漏斗及无水硫酸钠钠3次，入蒸发瓶内，并将其接至旋转蒸发器上，于次，入蒸发瓶内，并将其接至旋转蒸发器上，于55C水浴中减压蒸馏并回收乙醚，待瓶中剩下约水浴中减压蒸馏并回收乙醚，待瓶中剩下约2mL乙醚时，取下蒸发瓶，立即用氮气吹掉乙醚。加入乙醚时，取下蒸发瓶，立即用氮气吹掉乙醚。加入2.00mL乙醇，充分混合，溶解提取物。将乙醇液移入乙醇，充分混合，溶解提取物
11、。将乙醇液移入一小塑料离心管中，离心一小塑料离心管中，离心5min（5000rpm)。上清液供。上清液供色谱分析。色谱分析。（5）标准曲线的制备）标准曲线的制备v将维生素将维生素A和维生素和维生素E标准品配置成标准溶液（约标准品配置成标准溶液（约1mg/mL），），制备标准曲线前用紫外分光光度法标定其准确浓度。制备标准曲线前用紫外分光光度法标定其准确浓度。v标准浓度的标定方法：取维生素标准浓度的标定方法：取维生素A和维生素和维生素E标准液若干微升，标准液若干微升，分别稀释至分别稀释至10.00mL乙醇中，并分别按给定波长测定各维生素的吸乙醇中，并分别按给定波长测定各维生素的吸光值。用比吸光系数
12、计算该维生素的浓度。光值。用比吸光系数计算该维生素的浓度。v绘制标准曲线：标准和内标物进行色谱分析，以维生素绘制标准曲线：标准和内标物进行色谱分析，以维生素A峰面峰面积与内标物峰面积之比为纵坐标，维生素积与内标物峰面积之比为纵坐标，维生素A浓度为横坐标绘制标准浓度为横坐标绘制标准曲线。曲线。（6）高效液相色谱分析）高效液相色谱分析v预柱预柱:ultrasphereODS10m,4mm4.5cml分析柱分析柱:ultrasphereODS5m,4.6mm25cml流动相流动相:甲醇甲醇:水水98:2混匀混匀,于临用前脱气于临用前脱气l紫外检测器波长：紫外检测器波长：300nml进样量：进样量：2
13、0Ll流速：流速：1.7mL/min（7）注意事项）注意事项v维生素维生素A极易被破坏，实验操作应在微弱光线下进行，或用棕色极易被破坏，实验操作应在微弱光线下进行，或用棕色玻璃仪器。玻璃仪器。v在皂化过程中，应每在皂化过程中，应每5分钟摇一下皂化瓶，使样品皂化完全分钟摇一下皂化瓶，使样品皂化完全v提取过程中，振摇不应太剧烈，避免溶液乳化而不易分层。提取过程中，振摇不应太剧烈，避免溶液乳化而不易分层。v洗涤时，最初水洗轻摇，逐次振摇强度可增加。洗涤时，最初水洗轻摇，逐次振摇强度可增加。v无水硫酸钠如有结块，应烘干后使用。无水硫酸钠如有结块，应烘干后使用。v在旋转蒸发时乙醚溶液不应蒸干，以免被测样
14、品含量损失。在旋转蒸发时乙醚溶液不应蒸干，以免被测样品含量损失。v用高纯氮吹干时，氮气不能开的太大，避免样品吹出瓶外结果偏用高纯氮吹干时，氮气不能开的太大，避免样品吹出瓶外结果偏低。低。lGB/T5009.822003中第二法中第二法l原理：在氯仿溶液中，原理：在氯仿溶液中，VA与三氯化锑可生成蓝色可溶性络合物，与三氯化锑可生成蓝色可溶性络合物，在在620nm波长处有最大吸收峰，其吸光度与波长处有最大吸收峰，其吸光度与VA的含量在一定的的含量在一定的范围内成正比，故可比色测定。范围内成正比，故可比色测定。l适用范围及特点：本法适用于维生素适用范围及特点：本法适用于维生素A含量较高的各种样品含量
15、较高的各种样品(高高于于510gg)，对低含量样品，因受其他脂溶性物质的干扰，对低含量样品，因受其他脂溶性物质的干扰不易比色测定：不易比色测定：l主要缺点：生成的蓝色络合物的稳定性差。比色测定必须在主要缺点：生成的蓝色络合物的稳定性差。比色测定必须在6秒秒钟内完成，否则蓝色会迅速消退，将造成极大误差。钟内完成，否则蓝色会迅速消退，将造成极大误差。（二）比色法测定（二）比色法测定VA的含量的含量l注意：注意：l维生素维生素A见光易分解，整个实验应在暗处进行，防见光易分解，整个实验应在暗处进行，防止阳光照射，或采用棕色玻璃避光。止阳光照射，或采用棕色玻璃避光。l三氯化锑腐蚀性强，不能沾在手上，三氯
16、化锑遇水三氯化锑腐蚀性强，不能沾在手上，三氯化锑遇水生成白色沉淀因此用过的仪器要先用稀盐酸浸泡后生成白色沉淀因此用过的仪器要先用稀盐酸浸泡后再清洗。再清洗。二、二、胡萝卜素的测定胡萝卜素的测定l（GB/T5009.832003）第一方法是）第一方法是HPLC；第二方；第二方法为纸层析法。法为纸层析法。l胡萝卜素是一种广泛存在于有色蔬菜和水果中的天胡萝卜素是一种广泛存在于有色蔬菜和水果中的天然色素，有多种异构体和衍生物，总称为类胡萝卜素，然色素，有多种异构体和衍生物，总称为类胡萝卜素，其中在分子结构中含有其中在分子结构中含有一紫罗宁残基的类胡萝卜素，一紫罗宁残基的类胡萝卜素，在人体内可转变为维生
17、素在人体内可转变为维生素A，故称为维生素，故称为维生素A原。如原。如、胡萝卜素，其中以胡萝卜素，其中以胡萝卜素效价最高。胡萝卜素效价最高。l胡萝卜素原只存在于植物性食品中，但以胡萝卜胡萝卜素原只存在于植物性食品中，但以胡萝卜为食物的家禽、兽类、水产动物及其加工产品，以为食物的家禽、兽类、水产动物及其加工产品，以及为着色而添加胡萝卜素的食品也含有胡萝卜素。及为着色而添加胡萝卜素的食品也含有胡萝卜素。l胡萝卜素的结构如下：胡萝卜素的结构如下：l胡萝卜素对热及酸、碱比较稳定，但紫外线和空气胡萝卜素对热及酸、碱比较稳定，但紫外线和空气中的氧可促进其氧化破坏。因系脂镕性维生素，故可用中的氧可促进其氧化破
18、坏。因系脂镕性维生素，故可用有机溶剂从食物中提取。有机溶剂从食物中提取。l胡萝卜素本身是一种色素，在胡萝卜素本身是一种色素，在450nm波长处有最大波长处有最大吸收，故只要能完全分离，便可定性和定量。吸收，故只要能完全分离，便可定性和定量。l在植物体内，胡萝卜素经常与叶绿素、叶黄素等共存，在植物体内，胡萝卜素经常与叶绿素、叶黄素等共存，在提取在提取一胡萝卜素时，必须将胡萝卜素与其它色素分一胡萝卜素时，必须将胡萝卜素与其它色素分开。常用的方法有纸层析、柱层析和薄层层析法。开。常用的方法有纸层析、柱层析和薄层层析法。l净化用层析介质采用氧化镁、净化用层析介质采用氧化镁、氧化铝氧化铝l避光避光三、维
19、生素三、维生素D D的测定的测定l维生素维生素D为为固醇固醇类衍生物，具抗类衍生物，具抗佝偻病佝偻病作用，其中作用，其中最重要的是最重要的是D2和和D3。植物不含维生素。植物不含维生素D，但维生素，但维生素D原原在动、植物体内都存在。植物中的麦角醇为维生素在动、植物体内都存在。植物中的麦角醇为维生素D2原，经紫外照射后可转变为维生素原，经紫外照射后可转变为维生素D2，又名麦角钙化，又名麦角钙化醇；人和动物皮下含的醇；人和动物皮下含的7-脱氢胆固醇为维生素脱氢胆固醇为维生素D3原，原，在紫外照射后转变成维生素在紫外照射后转变成维生素D3，又名胆钙化，又名胆钙化醇醇。以。以D3为最重要。为最重要。
20、l维生素维生素D2药片吃多了中毒。药片吃多了中毒。l分析方法中较好的是比色法和高效液相色谱法。分析方法中较好的是比色法和高效液相色谱法。是是AOAC选定的正式方法。选定的正式方法。维生素维生素D的结构的结构l原理原理l在三氯甲烷溶液中，维生素在三氯甲烷溶液中，维生素D与三氯化锑结合生成与三氯化锑结合生成一种黄色化合物，呈色强度与维生素一种黄色化合物，呈色强度与维生素D含量呈正比。含量呈正比。v食品中维生素食品中维生素D D含量较低，其他维生素严重干扰其测定，含量较低，其他维生素严重干扰其测定，因此测定前必须经柱层析除去干扰成分。层析介质为因此测定前必须经柱层析除去干扰成分。层析介质为硅藻土、中
21、性氧化铝硅藻土、中性氧化铝v此法测定的是维生素此法测定的是维生素D D2 2和维生素和维生素D D3 3的总量的总量（一）三氯化锑比色法（一）三氯化锑比色法（二）液相色谱法（二）液相色谱法l灵敏度较比色法高灵敏度较比色法高30倍以上，且操作简便，精度高，倍以上，且操作简便，精度高，分析速度快。是目前分析维生素分析速度快。是目前分析维生素D的最好方法。的最好方法。l试样经皂化后，用苯提取不皂化物，蒸馏除苯，先试样经皂化后，用苯提取不皂化物，蒸馏除苯，先采用反相采用反相C18柱分取维生素柱分取维生素D，除去大部分杂质。进一，除去大部分杂质。进一步采用正相色谱分离，紫外检测定量。步采用正相色谱分离，
22、紫外检测定量。l反相色谱条件反相色谱条件l色谱柱：色谱柱：NucleosilC18,7.5mm*300mml流动相：乙腈甲醇（流动相：乙腈甲醇（11）l流速：流速：2.0mL/minl紫外检测波长：紫外检测波长：254nml正相色谱条件正相色谱条件l色谱柱：正相柱色谱柱：正相柱ZorbaxSIL,4.5mm*250mml流动相：流动相：0.4%异丙酮的己烷溶液异丙酮的己烷溶液l流速：流速：1.6mL/minl紫外检测波长：紫外检测波长：254nml注意事项注意事项l1、VD2与与VD3分不开分不开l2、皂化时加入焦性没食子酸作为抗氧化剂、皂化时加入焦性没食子酸作为抗氧化剂l2、标样与试样在同样
23、条件下皂化，消除了、标样与试样在同样条件下皂化，消除了VD的热的热异性化损失。异性化损失。l3、也可用硅藻土及皂土柱层析，除去甾醇、也可用硅藻土及皂土柱层析，除去甾醇、VA、胡萝卜素的干扰。胡萝卜素的干扰。第三节第三节 水溶性维生素的测定水溶性维生素的测定l水溶性维生素水溶性维生素B1、B2和和C，广泛存在于动植，广泛存在于动植物组织中，饮食来源充足。但是由于它们本身的物组织中，饮食来源充足。但是由于它们本身的水溶性质，除满足人体生理、生化作用外，任何水溶性质，除满足人体生理、生化作用外，任何多余量都会从小便中排出。为避免耗尽，需要经多余量都会从小便中排出。为避免耗尽，需要经常由饮食来提供。常
24、由饮食来提供。l水溶性维生素都易溶于水，而不溶于苯、乙醚、氯仿水溶性维生素都易溶于水，而不溶于苯、乙醚、氯仿等大多数有机溶剂。在酸性介质中很稳定，既使加热等大多数有机溶剂。在酸性介质中很稳定，既使加热也不破坏；但在碱性介质中不稳定，易于分解，特别也不破坏；但在碱性介质中不稳定，易于分解，特别在碱性条件下加热，可大部分或全部破坏。它们易受在碱性条件下加热，可大部分或全部破坏。它们易受空气、光、热、酶、金属离子等的影响；空气、光、热、酶、金属离子等的影响；l维生素维生素B2对光，特别是紫外线敏感，易被光对光，特别是紫外线敏感，易被光线破坏；维生素线破坏；维生素C对氧、铜离子敏感，易被氧化。对氧、铜
25、离子敏感，易被氧化。l根据上述性质，测定水溶性维生素时，一般都在酸性根据上述性质，测定水溶性维生素时，一般都在酸性溶液中进行前处理。溶液中进行前处理。l维生素维生素Bl、B2盐酸水解盐酸水解酶解酶解提取提取纯化纯化l维生素维生素C通常采用草酸、草酸通常采用草酸、草酸醋酸、偏磷酸醋酸、偏磷酸醋醋酸溶液直接提取。在一定浓度的酸性介质中，可以消酸溶液直接提取。在一定浓度的酸性介质中，可以消除某些还原性杂质对维生素除某些还原性杂质对维生素C的破坏作用。草酸价廉，的破坏作用。草酸价廉，使用方便，对维生素使用方便，对维生素C有很好有很好淀粉酶淀粉酶木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶活性人造浮石活性人造浮石硅镁吸附剂硅镁
26、吸附剂一、维生素一、维生素B B1 1的测定的测定l维生素维生素B1又名硫胺素、抗神经炎素，通常以游离又名硫胺素、抗神经炎素，通常以游离态，或以焦磷酸酯形式存在于自然界。在酵母、米态，或以焦磷酸酯形式存在于自然界。在酵母、米糠、麦胚、花生、黄豆以及绿色蔬菜和牛乳、蛋黄糠、麦胚、花生、黄豆以及绿色蔬菜和牛乳、蛋黄中含量较为丰富。中含量较为丰富。l分析方法：分析方法：GB/T5009.842003中唯一的方法是中唯一的方法是荧光计法荧光计法l此法检出限此法检出限0.05g1、原理、原理v硫胺素在碱性铁氰化钾溶液中被氧化成硫色素（噻硫胺素在碱性铁氰化钾溶液中被氧化成硫色素（噻嘧色素），在紫外线下，硫
27、色素发出荧光。在给定的条嘧色素），在紫外线下，硫色素发出荧光。在给定的条件下，以及没有其他物质干扰时，此荧光强度与硫色素件下，以及没有其他物质干扰时，此荧光强度与硫色素量成正比，即与溶液中硫胺素量成正比。从而测定其含量成正比，即与溶液中硫胺素量成正比。从而测定其含量。量。2、分析步骤、分析步骤v制样制样水解水解净化净化氧化氧化干燥干燥测定测定结果计算结果计算（1）提取）提取l精确称取一定量试样精确称取一定量试样520g（硫胺素含量约为（硫胺素含量约为1030ug）置于）置于100mL三角瓶中，加入三角瓶中，加入5075mL0.1mol/L或或0.3mol/L盐酸使其溶解，瓶口加盖小烧杯后放入高
28、压锅中盐酸使其溶解，瓶口加盖小烧杯后放入高压锅中加热水解加热水解10.3104Pa30min,凉后取出。凉后取出。l用用2mol/L乙酸钠调其乙酸钠调其pH值为值为4.5（以（以0.04%溴甲酚绿为指溴甲酚绿为指示剂）示剂）l按每克试样加入按每克试样加入20mg淀粉酶的比例加入淀粉酶。于淀粉酶的比例加入淀粉酶。于4550温箱过夜保温（约温箱过夜保温（约16h）。）。l冷至室温，定容至冷至室温，定容至100mL，然后混匀过滤，即为提取液，然后混匀过滤，即为提取液（2）净化）净化v用少许脱脂棉铺于层析柱的底部，加水将棉纤维中气泡排出，再用少许脱脂棉铺于层析柱的底部，加水将棉纤维中气泡排出，再加约加
29、约1g活性人造沸石使之达到交换柱的三分之一高度。保持层析柱活性人造沸石使之达到交换柱的三分之一高度。保持层析柱中液面始终高于活性人造沸石。中液面始终高于活性人造沸石。v用移液管加入提取液用移液管加入提取液2080mL（使通过活性人造沸石的硫胺素（使通过活性人造沸石的硫胺素总量约为总量约为25g）l加入约加入约10mL热水冲洗交换柱，弃去洗液。如此热水冲洗交换柱，弃去洗液。如此重复三次。重复三次。l加入加入25酸性氯化钾（温度为酸性氯化钾（温度为90左右）左右）20mL，收集此液于，收集此液于25mL刻度试管内，冷至室温，用刻度试管内，冷至室温，用25酸性氯化钾定容至酸性氯化钾定容至25mL,即
30、为即为试样净化液。试样净化液。l将将20mL硫胺素标准使用液加入交换柱以代替样品提取液，即得硫胺素标准使用液加入交换柱以代替样品提取液，即得到标准净化液。到标准净化液。（3）氧化）氧化v将将5mL试样净化液分别加入试样净化液分别加入A、B两个反应瓶。两个反应瓶。v在避光暗环境中将在避光暗环境中将3mL15%氢氧化钠加入反应瓶氢氧化钠加入反应瓶A，振摇约，振摇约15s，然后加入，然后加入10mL正丁醇；将正丁醇；将3mL碱性铁氰化钾溶液加入反应碱性铁氰化钾溶液加入反应瓶瓶B,振摇约振摇约15s，然后加入，然后加入10mL正丁醇；将正丁醇；将A、B两个反应瓶同时两个反应瓶同时用力振摇，准确计时用力
31、振摇，准确计时1.5min。v重复重复12，用标准净化液代替试样净化液。，用标准净化液代替试样净化液。v用黑布遮盖用黑布遮盖A、B反应瓶，静置分层后下层碱性溶液，加入反应瓶，静置分层后下层碱性溶液，加入23g无水硫酸钠使溶液脱水。无水硫酸钠使溶液脱水。（4）荧光强度的测定）荧光强度的测定l荧光测定条件：荧光测定条件：l激发波长激发波长365nm；狭缝；狭缝5nm.l发射波长发射波长435nm；狭缝；狭缝5nm.l依次测定下列荧光强度：依次测定下列荧光强度：l试样空白荧光强度（试样反应瓶试样空白荧光强度（试样反应瓶A）；）；l标准空白荧光强度（标准反应瓶标准空白荧光强度（标准反应瓶A）；）；l试
32、样荧光强度（试样反应瓶试样荧光强度（试样反应瓶B）；）；l标准荧光强度（标准反应瓶标准荧光强度（标准反应瓶B）。）。二、维生素二、维生素B B2 2的测定的测定l维生素维生素B2即核黄素，在食品中以游离形式或磷酸酯即核黄素，在食品中以游离形式或磷酸酯等结合形式存在。膳食中的主要来源是各种动物性食品，等结合形式存在。膳食中的主要来源是各种动物性食品，其中以肝、肾、心、蛋、奶含量最多，其次是植物性食其中以肝、肾、心、蛋、奶含量最多，其次是植物性食品的豆类和新鲜绿叶蔬菜。品的豆类和新鲜绿叶蔬菜。l分析方法：分析方法：lGB/T5009.852003中第一法为荧光法；第二法为中第一法为荧光法；第二法为
33、微生物法。微生物法。1、原理、原理v核黄素在核黄素在440-500nm波长光照射下发生黄绿色荧光，波长光照射下发生黄绿色荧光，在稀溶液中，荧光强度与核黄素浓度成正比。在波长在稀溶液中，荧光强度与核黄素浓度成正比。在波长525nm下测定其荧光强度。试液再加入低亚硫酸钠下测定其荧光强度。试液再加入低亚硫酸钠(Na2S2O4),将核黄素还原成无荧光的物质，然后再测定将核黄素还原成无荧光的物质，然后再测定试液中残余荧光杂质的荧光强度，两者之差即为食品中试液中残余荧光杂质的荧光强度，两者之差即为食品中核黄素所产生的荧光强度。核黄素所产生的荧光强度。2、操作步骤、操作步骤v样品均制样品均制水解水解过滤定容
34、过滤定容氧化去杂质氧化去杂质净化净化测定测定结果计算结果计算（1）水解）水解:v称取称取2-10g样品（约含样品（约含10-200ug核黄素）于核黄素）于100ml三角瓶中，三角瓶中，加入加入50mL0.1mol/L盐酸，搅拌直至颗粒分散均匀。用盐酸，搅拌直至颗粒分散均匀。用40mL瓷坩瓷坩埚为盖扣住瓶口埚为盖扣住瓶口,置于高压锅内高压水解，置于高压锅内高压水解，10.3X104Pa(15lb/in2)30min。水解液冷却后，滴加。水解液冷却后，滴加1mol/L氢氧化氢氧化钠，取少许水解液，用钠，取少许水解液，用0.04%溴甲酚绿检验呈草绿（溴甲酚绿检验呈草绿（pH为为4.5）（2）酶解）酶
35、解:v含有淀粉的水解液：加入含有淀粉的水解液：加入3ml10%淀粉酶溶淀粉酶溶液液,于于37-40保温保温16h。含高蛋白的水解液：加。含高蛋白的水解液：加入入3ml10%木瓜蛋白酶溶液木瓜蛋白酶溶液,于于37-40保温保温16h。过滤上述酶解液定容至过滤上述酶解液定容至100mL,用干滤纸过滤。用干滤纸过滤。此提取液在此提取液在4C冰箱中保存一周。冰箱中保存一周。（3）氧化去杂质）氧化去杂质v视样品中核黄素的含量取一定体积的样品提取液及视样品中核黄素的含量取一定体积的样品提取液及核黄素标准使用液（约含核黄素标准使用液（约含1-10ug核黄素）分别于核黄素）分别于20mL的带刻度试管中，加水至
36、的带刻度试管中，加水至15mL。各管加。各管加0.5mL冰乙酸，冰乙酸，混匀。加混匀。加3%高锰酸钾溶液高锰酸钾溶液5mL，混匀，放置，混匀，放置2min，使，使氧化去杂质。滴加氧化去杂质。滴加3%双氧水溶液数滴，直到高锰酸钾双氧水溶液数滴，直到高锰酸钾颜色褪掉。剧烈震摇此管，使多余的氧气逸出。颜色褪掉。剧烈震摇此管，使多余的氧气逸出。（4）核黄素的吸附与洗脱）核黄素的吸附与洗脱l核黄素吸附柱：核黄素吸附柱：l硅镁吸附剂约硅镁吸附剂约1g用湿法装入柱，占柱长用湿法装入柱，占柱长1/2-2/3（约（约5cm）为宜（吸附柱下端用一团脱脂棉垫上），勿使柱）为宜（吸附柱下端用一团脱脂棉垫上），勿使柱内
37、产生气泡，调节流速为内产生气泡，调节流速为60滴滴/min。l过柱与洗脱：过柱与洗脱：l将全部氧化后的央液及标准液通过吸附柱后，用约将全部氧化后的央液及标准液通过吸附柱后，用约20mL的热水洗去样液中的杂质，然后用的热水洗去样液中的杂质，然后用5.0mL洗脱液洗脱液（丙酮：冰乙酸：水（丙酮：冰乙酸：水5：2：9）将样品中核黄素洗脱）将样品中核黄素洗脱并收集于一带盖并收集于一带盖10mL刻度试管中，再用水洗吸附柱，刻度试管中，再用水洗吸附柱，收集洗出液并定容至收集洗出液并定容至10mL，混匀后待测荧光。，混匀后待测荧光。（5）测定）测定v于激发波长于激发波长440nm，发射波长，发射波长525n
38、m，测量，测量样品管及标准管的荧光值。样品管及标准管的荧光值。v待测品及标准的荧光值测定后，在各管的剩待测品及标准的荧光值测定后，在各管的剩余液（约余液（约5-7mL）中加）中加0.1mL20%次亚硫酸钠次亚硫酸钠溶液，立即混匀，在溶液，立即混匀，在20s内测出各管的荧光值，内测出各管的荧光值，作为各自的空白值作为各自的空白值（6）计算）计算X=(A-B/C-D)S/mf100/1000式中：式中：X样品中含核黄素的量样品中含核黄素的量,mg/100gA样品管荧光值样品管荧光值B样品管空白荧光值样品管空白荧光值C标准管荧光值标准管荧光值D标准管空白管荧光值标准管空白管荧光值f稀释倍数稀释倍数m
39、样品的质量，样品的质量，gS标准管中核黄素的含量标准管中核黄素的含量,g100/1000将样品中核黄素量由将样品中核黄素量由g/g折算折算mg/100g的折算系数的折算系数三、维生素三、维生素C C的测定的测定l维生素维生素C是一种己糖醛基酸，有抗坏血病的作用，是一种己糖醛基酸，有抗坏血病的作用，所以又称作抗坏血酸。维生素所以又称作抗坏血酸。维生素C广泛存在于植物组织中，广泛存在于植物组织中，新鲜的水果、蔬菜，特别是枣、辣椒、苦瓜、柿子叶、新鲜的水果、蔬菜，特别是枣、辣椒、苦瓜、柿子叶、猕猴桃、柑桔等食品中含量尤丰富。猕猴桃、柑桔等食品中含量尤丰富。l维生素维生素C具有较强的还原性，对光敏感，
40、氧化后的具有较强的还原性，对光敏感，氧化后的产物称为脱氢抗坏血酸，仍然具有生理活性。进一步水产物称为脱氢抗坏血酸，仍然具有生理活性。进一步水解则生成解则生成2，3-二酮古乐糖酸，失去生理作用。二酮古乐糖酸，失去生理作用。l根据它具有的还原性质可以测定维生素根据它具有的还原性质可以测定维生素C的含量。常的含量。常用的测定方法有：用的测定方法有：l（1）2，6-二氯靛酚法二氯靛酚法（还原型（还原型VC）l（2）2，4-二硝基苯肼法二硝基苯肼法（总（总VC）l（3）碘酸法）碘酸法l（4）碘量法）碘量法l（5）荧光分光光度法）荧光分光光度法（一）（一）2，6二氯靛酚滴定法二氯靛酚滴定法1、原理、原理v
41、还原型抗坏血酸可以还原染料还原型抗坏血酸可以还原染料2，6-二氯靛酚。该二氯靛酚。该染料在酸性溶液中呈粉红色染料在酸性溶液中呈粉红色(在中性或碱性溶液中呈蓝在中性或碱性溶液中呈蓝色色)，被还原后颜色消失。，被还原后颜色消失。v还原型抗坏血酸还原染料后，本身被氧化成脱氢抗还原型抗坏血酸还原染料后，本身被氧化成脱氢抗坏血酸。在没有杂质干扰时，一定量的样品提取液还坏血酸。在没有杂质干扰时，一定量的样品提取液还原标准染料液的量，与样品中抗坏血酸含量成正比。原标准染料液的量，与样品中抗坏血酸含量成正比。2、试剂、试剂l1%草酸溶液：称取草酸溶液：称取10g草酸，加水至草酸，加水至1000mL；l2%草酸
42、溶液：称草酸溶液：称20g草酸，加水至草酸，加水至1000mL；l维生素维生素C标准液：准确称标准液：准确称20mgVC溶于溶于1%草酸中，并稀释至草酸中，并稀释至100mL，吸，吸5mL于于50mL容量瓶中，加入容量瓶中，加入1%草酸至刻度，此溶液草酸至刻度，此溶液每毫升含有每毫升含有0.02mgVC；l0.02%2，6-二氯靛酚溶液：称取二氯靛酚溶液：称取2，6-二氯靛酚二氯靛酚50mg，溶于，溶于200mL含有含有52mg碳酸氢钠的热水中，冷却后，稀释至碳酸氢钠的热水中，冷却后，稀释至250mL，过，过滤于棕色瓶中，贮存于冰箱内，应用过程中每星期标定一次。滤于棕色瓶中，贮存于冰箱内，应用
43、过程中每星期标定一次。3、样品测定、样品测定l提取：称样提取：称样50g加加2%草酸草酸100mL入捣碎机中处理入捣碎机中处理过滤过滤颜色若深可加白陶土颜色若深可加白陶土l滴定：吸滴定：吸5mL样液样液于三角瓶于三角瓶用染料滴定至粉红色用染料滴定至粉红色15秒内秒内不褪色不褪色l计算：计算：VC（mg/100g）=（VT）/W100lV-消耗染料体积（消耗染料体积（mL）lT-1mL染料所能氧化维生素染料所能氧化维生素C的毫克数的毫克数lW-滴定时所有滤液中含有样品的克数滴定时所有滤液中含有样品的克数4、注意事项、注意事项l所有试剂的配制最好都用重蒸馏水；所有试剂的配制最好都用重蒸馏水；l样品
44、进入实验室后，应浸泡在已知量的样品进入实验室后，应浸泡在已知量的2%草酸液中，以草酸液中，以防氧化，损失维生素防氧化，损失维生素C；l整个操作过程中要迅速，避免还原型抗坏血酸被氧化；整个操作过程中要迅速，避免还原型抗坏血酸被氧化；l在处理各种样品时，如遇有泡沫产生，可加入数滴辛醇在处理各种样品时，如遇有泡沫产生，可加入数滴辛醇消除；消除；l测定样液时，需做空白对照，样液滴定体积扣除空白体测定样液时，需做空白对照，样液滴定体积扣除空白体积积l样品中如含有还原性的铁离子物质、铜离子或亚锡离样品中如含有还原性的铁离子物质、铜离子或亚锡离子等物质时，会使结果偏高。在提取过程中，可加入子等物质时，会使结
45、果偏高。在提取过程中，可加入EDTA等螯合物。等螯合物。l贮存过久的罐头食品，可能含有大量的低铁离子贮存过久的罐头食品，可能含有大量的低铁离子（Fe2+），要用），要用8%的醋酸代替的醋酸代替2%草酸。这时如用草草酸。这时如用草酸，低铁离子可以还原酸，低铁离子可以还原2，6-二氯靛酚，使测定数字增二氯靛酚，使测定数字增高，使用醋酸可以避免这种情况的发生；高，使用醋酸可以避免这种情况的发生；lGB/T5009.862003蔬菜、水果及其制品中总抗蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸坏血酸含量测定方法含量测定方法第二法第二法l可测总抗坏血酸，总抗坏血酸包括还原型、脱氢型可测总抗坏血酸，总抗坏血酸包括还原
46、型、脱氢型和二酮古乐糖酸型。此法是将样品的还原型抗坏血酸和二酮古乐糖酸型。此法是将样品的还原型抗坏血酸氧化为脱氢型抗坏血酸，然后与氧化为脱氢型抗坏血酸，然后与2，4-二硝基苯肼作用，二硝基苯肼作用，生成红色的脎。脎的量与总抗坏血酸含量成正比，将生成红色的脎。脎的量与总抗坏血酸含量成正比，将红色脎溶于硫酸后进行比色，由标准曲线计算样品中红色脎溶于硫酸后进行比色，由标准曲线计算样品中总总VC。（二）（二）2，4二硝基苯肼比色法二硝基苯肼比色法（1）原理）原理v总抗坏血酸包括还原型、脱氢型和二酮古乐糖酸，试总抗坏血酸包括还原型、脱氢型和二酮古乐糖酸，试样中还原型抗坏血酸经活性炭氧化为脱氢抗坏血酸，再样中还原型抗坏血酸经活性炭氧化为脱氢抗坏血酸，再与与2,4-二硝基苯肼作用生成红色脎，根据肼在硫酸溶液中二硝基苯肼作用生成红色脎，根据肼在硫酸溶液中的含量与抗坏血酸含量成正比，进行比色定量。的含量与抗坏血酸含量成正比，进行比色定量。（三）荧光法（三）荧光法（1 1）原理）原理 还原性抗坏血酸还原性抗坏血酸 脱氢抗坏血酸脱氢抗坏血酸 荧光化合物荧光化合物 荧光强度与脱氢抗坏血酸的浓度在一定条件下荧光强度与脱氢抗坏血酸的浓度在一定条件下成正比。成正比。氧化氧化邻苯二胺苯二胺演讲完毕，谢谢观看！