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1、第十三章第十三章 基因工程与基因组学概述基因工程与基因组学概述廊坊师范学院生命科学学院廊坊师范学院生命科学学院遗传学教研室遗传学教研室第一节第一节 基因工程基因工程一、基因工程概述基因工程概述二、基因工程工具酶基因工程工具酶三、基因工程的流程及相关技术四、基因工程的发展应用一、基因工程概述基因工程概述遗传工程（遗传工程（genetic engineering），），也称生也称生物工程，利用工程技术的方法改造和修饰生物工程，利用工程技术的方法改造和修饰生物体，使其产生新的性状或产品，从而改良物体，使其产生新的性状或产品，从而改良生物体的一种遗传学手段。生物体的一种遗传学手段。核心是利用重组核心是
2、利用重组DNA技术，在分子水平上技术，在分子水平上操作修饰改变生物体遗传结构。操作修饰改变生物体遗传结构。基因工程（基因工程（gene engineeringgene engineering）：）：利用人工利用人工的方法把生物的遗传物质在体外进行切割、的方法把生物的遗传物质在体外进行切割、拼接和重组，获得重组拼接和重组，获得重组DNADNA分子，然后导入宿分子，然后导入宿主细胞或个体，使受体的遗传特性得到修饰主细胞或个体，使受体的遗传特性得到修饰或改变的过程。或改变的过程。二、二、基因工程的工具酶内切核酸酶内切核酸酶内切核酸酶内切核酸酶(endonuclease)(endonuclease)(
3、endonuclease)(endonuclease)DNADNADNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶(ligase)(ligase)(ligase)(ligase)DNADNADNADNA聚合酶（聚合酶（聚合酶（聚合酶（DNA polymeraseDNA polymeraseDNA polymeraseDNA polymerase）RNARNARNARNA聚合酶（聚合酶（聚合酶（聚合酶（RNA polymeraseRNA polymeraseRNA polymeraseRNA polymerase）反转录酶（反转录酶（反转录酶（反转录酶（reverse transcriptaserevers
4、e transcriptasereverse transcriptasereverse transcriptase）最重要的工具酶是限制性核酸内切酶最重要的工具酶是限制性核酸内切酶最重要的工具酶是限制性核酸内切酶最重要的工具酶是限制性核酸内切酶（restriction endonucleaserestriction endonucleaserestriction endonucleaserestriction endonuclease），也称限制性酶），也称限制性酶），也称限制性酶），也称限制性酶(restriction enzyme),(restriction enzyme),(restri
5、ction enzyme),(restriction enzyme),能识别双链能识别双链能识别双链能识别双链DNADNADNADNA分子中一分子中一分子中一分子中一段特异的核苷酸序列，并在特定的位置将双连段特异的核苷酸序列，并在特定的位置将双连段特异的核苷酸序列，并在特定的位置将双连段特异的核苷酸序列，并在特定的位置将双连DNADNADNADNA分子切断。分子切断。分子切断。分子切断。Eco R 属名属名 种名种名 菌株名菌株名 序号序号（一）限制性核酸内切酶（一）限制性核酸内切酶（一）限制性核酸内切酶（一）限制性核酸内切酶常常见见内内切切酶酶（二）（二）DNA DNA连接酶连接酶n n连接
6、连接55磷酸和磷酸和33OHOH，形成磷酸二，形成磷酸二酯键，封闭酯键，封闭DNADNA双链上的缺刻。双链上的缺刻。如：如：Ecoli DNA Ecoli DNA连接酶连接酶 T4 DNA T4 DNA连接酶连接酶 载体载体(vector)(vector)将外源将外源DNADNA片段运送进宿主细胞片段运送进宿主细胞(host(host cell)cell)进行扩增或表达的运载工具称进行扩增或表达的运载工具称为载体。为载体。载体也是载体也是载体也是载体也是DNADNADNADNA分子。分子。分子。分子。常用的载体有细菌质粒、噬菌体、病毒等。常用的载体有细菌质粒、噬菌体、病毒等。经改造的黏粒经改造
7、的黏粒(cosmid)(cosmid)、噬粒、噬粒(phagemid)(phagemid)都要经过人工改造。都要经过人工改造。都要经过人工改造。都要经过人工改造。细菌人工染色体（细菌人工染色体（BACBAC）、酵母菌人工染）、酵母菌人工染色体（色体（YACYAC）和人类人工染色体（）和人类人工染色体（HACHAC）噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体载体载体载体载体YACYAC（1Mb1Mb）载体的基本条件载体的基本条件有独立的复制原点有独立的复制原点(ori)(ori)，能独立地自我，能独立地自我复制，而且能带动外源复制，而且能带动外源DNADNA一起复制。一起复制。具有多种限制性酶的切点，用于连接外源
8、具有多种限制性酶的切点，用于连接外源DNA DNA 片段。片段。载体上的限制酶酶切位点对于任何一种限载体上的限制酶酶切位点对于任何一种限制酶来说只能有一个。制酶来说只能有一个。具有一个选择标记基因。具有一个选择标记基因。获得外源获得外源获得外源获得外源DNADNADNADNA片段（分）片段（分）片段（分）片段（分）限制性内切酶切割外源限制性内切酶切割外源限制性内切酶切割外源限制性内切酶切割外源DNADNADNADNA片段与载体（切）片段与载体（切）片段与载体（切）片段与载体（切）外源外源外源外源DNADNADNADNA片段与载体连接（接）片段与载体连接（接）片段与载体连接（接）片段与载体连接（
9、接）重组重组重组重组DNADNADNADNA分子转入宿主细胞（转）分子转入宿主细胞（转）分子转入宿主细胞（转）分子转入宿主细胞（转）重组子的筛选与鉴定（筛）重组子的筛选与鉴定（筛）重组子的筛选与鉴定（筛）重组子的筛选与鉴定（筛）目的基因的确认与分析目的基因的确认与分析目的基因的确认与分析目的基因的确认与分析三、基因工程的流程及相关技术三、基因工程的流程及相关技术（一）外源DNA片段的分离方法1.1.1.1.构建基因组文库分离法构建基因组文库分离法2.2.2.2.差别显示反转录差别显示反转录PCRPCR3.3.3.3.利用聚合酶链式反应技术扩增目的基因利用聚合酶链式反应技术扩增目的基因1.构建基
10、因组文库分离法构建基因组文库分离法 用克隆载体将某种生物用克隆载体将某种生物的基因组全部遗传信息储存的基因组全部遗传信息储存于一个受体菌的群体，即构于一个受体菌的群体，即构成了这种生物的基因组文库。成了这种生物的基因组文库。若只储存某生物基因组的部若只储存某生物基因组的部分遗传信息，即构成部分基分遗传信息，即构成部分基因组文库。因组文库。供体生物的基因组供体生物的基因组DNADNA切割切割成许多片段成许多片段将所有片段分别连接到载体将所有片段分别连接到载体上，构成一个重组上，构成一个重组DNADNA群体群体这个群体包含全基因组的遗这个群体包含全基因组的遗传信息。传信息。保存、筛选保存、筛选差别
11、显示分析基本流程差别显示分析基本流程2.2.差别显示反转录差别显示反转录PCRPCR（DDRT-PCRDDRT-PCR）3 3、利用聚合酶链式反应技术扩增目的基因、利用聚合酶链式反应技术扩增目的基因（1）套式）套式PCR（2）反向）反向PCR（3）不对称）不对称PCR（4）锚定）锚定PCR（5）长程）长程PCR（6）反转录）反转录PCR4 4、人工合成基因人工合成基因根根据据已已知知的的基基因因序序列列，或或根根据据氨氨基基酸酸序序列推测列推测DNADNA序列序列将将化化学学合合成成寡寡核核苷苷酸酸的的方方法法与与酶酶促促合合成成DNADNA的的方方法法结结合合起起来来，可可以以很很快快地地人
12、人工工合合成基因。成基因。通过用相同通过用相同的限制性核的限制性核酸内切酶切酸内切酶切割，连接形割，连接形成一个重组成一个重组DNA分子分子（二）、外源（二）、外源DNADNA片段与载体的切割和连接片段与载体的切割和连接（三）、重组DNA转入宿主细胞 1.1.重组重组DNADNA转入原核细胞转入原核细胞 热激转化法热激转化法热激转化法热激转化法 电穿孔转化法电穿孔转化法电穿孔转化法电穿孔转化法2.2.重组重组DNADNA转入真核细胞转入真核细胞 农杆菌转化法农杆菌转化法农杆菌转化法农杆菌转化法重组重组DNA感受态感受态细胞细胞 冰浴冰浴混合、静置混合、静置42C 热激激加入培养基加入培养基扩培
13、培转化液涂含抗转化液涂含抗菌素的平板菌素的平板吸附吸附DNA摄入摄入DNA（1）热激转化法感受态细胞感受态细胞 电转仪调为电转仪调为2.5kV 25 F 脉冲控制器脉冲控制器200-400 质粒质粒DNA 混合混合加入加入培养液培养液37 中速震荡中速震荡涂板涂板（2）电穿孔转化法2.2.重组重组DNADNA转入植物细胞转入植物细胞农杆菌介导的农杆菌介导的TiTi质粒载体转化法质粒载体转化法（四（四）重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定 3.核酸杂交核酸杂交4.PCR检测检测5.测序测序6.生物学活性检测生物学活性检测1 1.插入抗性失活插入抗性失活2.2.蓝白斑蓝白斑筛选筛选1.1.插入失活
14、筛选法插入失活筛选法蓝白斑筛选重组质粒蓝白斑筛选重组质粒四、基因工程的发展应用四、基因工程的发展应用1 1、基因工程是生物科学基础研究的重要手段、基因工程是生物科学基础研究的重要手段2 2、利用转基因技术改良植物已取得很大进展并、利用转基因技术改良植物已取得很大进展并在生产上应用在生产上应用3 3、利用基因工程获得大量重组的蛋白、疫苗药、利用基因工程获得大量重组的蛋白、疫苗药物物4 4、利用基因工程进行不同物种之间的基因传递、利用基因工程进行不同物种之间的基因传递提供了可能。提供了可能。转基因动植物转基因动植物-“-“生物工厂生物工厂”5 5、疾病诊断与基因治疗、疾病诊断与基因治疗6 6、环境
15、保护、环境保护4.利用基因工程改良动物利用基因工程改良动物推荐几本参考书：1、基因工程原理与方法，孙树汉编，人民军医出版社2、基因工程原理，吴乃虎编，科学出版社（侧重原理）3、现代基因工程技术导论，陈章良编，科学出版社（侧重应用）4、分子克隆(第三版)，J.Sambrook et al.科学出版社（具体的实验方法，分子生物学研究的圣经）第二节第二节 基因组学基因组学一、一、基因组学基因组学概述概述二、基因组图谱的构建二、基因组图谱的构建三、基因组图谱的应用三、基因组图谱的应用四、后基因组学四、后基因组学基因组基因组(genome)泛泛指指一一个个有有生生命命体体、病病毒毒或或细细胞胞器器的的全
16、全部部遗遗传传物物质质；在在真真核核生生物物，基基因因组组是是指指一一套套染染色体（单倍体）色体（单倍体）DNA。一、一、基因组学概念及范畴基因组学概念及范畴基因组学基因组学(genomics)就是发展和应用就是发展和应用DNA制图、制图、测序新技术以及计算机程序，测序新技术以及计算机程序，分析生命体（包括人类）全部分析生命体（包括人类）全部基因组结构及功能。基因组结构及功能。基因组学研究的最终目标基因组学研究的最终目标n n获得生物体全部基因组序列获得生物体全部基因组序列n n鉴定所有基因的功能鉴定所有基因的功能n n明确基因之间的相互作用关系明确基因之间的相互作用关系n n阐明基因组的进化
17、规律阐明基因组的进化规律基因组学研究内容基因组学研究内容 结构基因组学结构基因组学(structural genomics)功能基因组学功能基因组学(functional genomics)比较基因组学比较基因组学(comparative genomics)结构基因组学（结构基因组学（structural genomics）基因定位基因定位 基因组作图基因组作图 测定核苷酸序列测定核苷酸序列遗传图（连锁图）遗传图（连锁图）物理图物理图转录图转录图序列图序列图二、基因组图谱的构建二、基因组图谱的构建基因组计划的第一个环节：构建基因组图谱基因组计划的第一个环节：构建基因组图谱1.1.遗传图遗传图
18、连锁图连锁图(linkage map)，是指基因标志在染色，是指基因标志在染色体上的遗传距离，即确定各基因在基因组中的体上的遗传距离，即确定各基因在基因组中的相对位置和排列顺序。相对位置和排列顺序。遗传距离通常由基因在四分体时期染色体交遗传距离通常由基因在四分体时期染色体交换过程中分离的频率厘摩（换过程中分离的频率厘摩（cM）来表示。）来表示。遗传标记（遗传标记（Genetic marker）指可识别的等位基因。它）指可识别的等位基因。它具有两个基本特征，即可遗传性和可识别性，因此生物具有两个基本特征，即可遗传性和可识别性，因此生物的任何有差异表型的基因突变型均可作为遗传标记。的任何有差异表型
19、的基因突变型均可作为遗传标记。类型：类型：形态标记（形态标记（morphological marker）细胞学标记细胞学标记(cytological marker)生化标记生化标记(biochemical marker)分子标记分子标记(molecular marker)2.2.、物理图、物理图 以已知核苷酸序列的以已知核苷酸序列的DNA片断（序列标签片断（序列标签位点位点,STS）为）为“路标路标”，以碱基对作为基本，以碱基对作为基本测量单位（图距）的基因组图测量单位（图距）的基因组图。DNADNA上两点的实际距离，即确定基因在染色上两点的实际距离，即确定基因在染色体上的实际排列顺序，从而对
20、基因定位。体上的实际排列顺序，从而对基因定位。3 3、转录图、转录图 以以ESTEST（expressed sequence tag expressed sequence tag，表达序，表达序列标签）为标记，根据转录顺序的位置和距离绘列标签）为标记，根据转录顺序的位置和距离绘制的图谱。制的图谱。4.4.、序列图、序列图 序列图是指整个人类基因组的核苷酸序列图，序列图是指整个人类基因组的核苷酸序列图，也是最详尽的物理图，既包括可转录序列，也包也是最详尽的物理图，既包括可转录序列，也包括非转录序列，是转录序列、调节序列和功能未括非转录序列，是转录序列、调节序列和功能未知序列的总和。知序列的总和。
21、这是人类基因组计划最繁重、耗时最多的工作。这是人类基因组计划最繁重、耗时最多的工作。CREDIT:JOE SUTLIFF Science,Vol 291:1221.Fishing in a More Effective Way!人类基因组计划人类基因组计划1990，美国国立卫生研究所和能源部投资30亿，启动了人类基因组计划，预计15年时间完成人类基因组全部序列的测定1996，完成标记密度为0.6cM的人类基因组遗传图谱，100kb的物理图谱2000，完成草图2001年2月，公布人类基因组图谱的修订版2002，完成测序工作国际人类基因组测序协作组（公共计划组）国际人类基因组测序协作组（公共计划组
22、）由由6个国家、个国家、20个研究中心的个研究中心的2000多位科学工多位科学工作者组成。作者组成。国家国家国家国家承担的测序任务承担的测序任务承担的测序任务承担的测序任务美国美国美国美国54%54%英国英国英国英国33%33%日本日本日本日本7%7%法国法国法国法国2.8%2.8%德国德国德国德国2.2%2.2%中国中国中国中国1%1%1999 1999年年9 9月月 中国获准加入人类基因组中国获准加入人类基因组计划，负责测定人类基因组全部序列的计划，负责测定人类基因组全部序列的1%1%，负责第，负责第3 3号染色体号染色体3 3千万核苷酸的序列测千万核苷酸的序列测定工作。中国是继美、英、日
23、、德、法之定工作。中国是继美、英、日、德、法之后第后第6 6个国际人类基因组计划参与者，也是个国际人类基因组计划参与者，也是参与这一计划的唯一发展中国家。参与这一计划的唯一发展中国家。人类基因组计划1%测序中国实验室2000年年6月月26日日 科学家公布科学家公布人类基因组工作草图，标志人类基因组工作草图，标志着人类在解读自身着人类在解读自身“生命之生命之书书”的路上迈出了重要一步。的路上迈出了重要一步。HGP对人类基因面貌的新发现对人类基因面貌的新发现1.基因数量少得惊人基因数量少得惊人2.人类基因组中存在人类基因组中存在“热点热点”和大片和大片“荒荒漠漠”3.三分之一为三分之一为“垃圾垃圾
24、”DNA4.种族歧视毫无根据种族歧视毫无根据5.男性基因突变比例更高男性基因突变比例更高 2000 2000年是基因组之年，完成了人类基年是基因组之年，完成了人类基因组的工作框架图，完成了一系列模式生因组的工作框架图，完成了一系列模式生物和微生物的基因组序列分析。物和微生物的基因组序列分析。2000 年 12 月美、英等国科学家宣布绘出拟南芥基因组的完整图谱，这是人类首次全部破译出一种植物的基因序列。三、后基因组学（postgenomics)完成一个生物体全部基因组测序后即进入功完成一个生物体全部基因组测序后即进入功能基因组学阶段，也称能基因组学阶段，也称后基因组阶段后基因组阶段详详尽分析序列
25、，描述基因组所有基因的功能，尽分析序列，描述基因组所有基因的功能，包括研究基因的表达及其调控模式。包括研究基因的表达及其调控模式。基因的识别、鉴定、克隆基因的识别、鉴定、克隆 基因结构、功能及其相互关系基因结构、功能及其相互关系 基因表达调控的研究基因表达调控的研究（一）鉴定（一）鉴定DNA序列中的基因序列中的基因 ORF（二）（二）同源搜索同源搜索设计基因功能设计基因功能 （三）实验性设计基因功能（三）实验性设计基因功能 clon,knock-out,knock-in,clon,knock-out,knock-in,反义反义反义反义RNA,RNAiRNA,RNAi（四）描述基因表达模式（四）描述基因表达模式 主要具体内容包括以下方面主要具体内容包括以下方面:功能基因组学研究策略及主要内容功能基因组学研究策略及主要内容演讲完毕，谢谢观看！