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1、实验四实验四 革兰氏染色法革兰氏染色法一、目的要求一、目的要求 n1 1 学习革兰氏染色原理，学习革兰氏染色原理，理解理解着色机理。着色机理。n2 2 掌握掌握革兰氏染色的方法，并能革兰氏染色的方法，并能正确染正确染色。色。n3 3 巩固巩固无菌操作技术无菌操作技术n4 4 巩固显微镜油镜的使用方法巩固显微镜油镜的使用方法二、基本原理二、基本原理 p是是18841884年由丹麦病理学家年由丹麦病理学家C.GramC.Gram所创立的。所创立的。p革兰氏染色法是革兰氏染色法是细菌学细菌学上最常用的鉴别染色法。上最常用的鉴别染色法。p革兰氏染色是是根据革兰氏阳性细菌、阴性细革兰氏染色是是根据革兰氏
2、阳性细菌、阴性细菌菌细胞壁结构、组成的不同细胞壁结构、组成的不同而使用一系列的染而使用一系列的染色处理使之色处理使之差别显色差别显色。p其染色方法是先将细菌分别用结晶紫和碘液初其染色方法是先将细菌分别用结晶紫和碘液初染媒染后，乙醇脱色，再经复染剂复染。最终染媒染后，乙醇脱色，再经复染剂复染。最终被染成被染成红色红色的是的是革兰氏阴性细菌革兰氏阴性细菌；被染成；被染成紫色紫色的是的是革兰氏阳性细菌革兰氏阳性细菌。革兰氏染色原理：革兰氏染色原理：n第一步：第一步：结晶紫使菌体着上紫色结晶紫使菌体着上紫色n第二步：第二步：碘和结晶紫形成大分子复合物，分子大，碘和结晶紫形成大分子复合物，分子大，能被细
3、胞壁阻留在细胞内。能被细胞壁阻留在细胞内。n第三步：第三步：酒精脱色，细胞壁成分和构造不同，出现酒精脱色，细胞壁成分和构造不同，出现不同的反应。不同的反应。nG+G+菌：菌：细胞壁细胞壁厚厚，肽聚糖含量高，交联度大，当，肽聚糖含量高，交联度大，当乙醇脱色时，肽聚糖因脱水而孔径缩小，故结晶紫乙醇脱色时，肽聚糖因脱水而孔径缩小，故结晶紫-碘复合物被阻留在细胞内，细胞不能被酒精脱色，碘复合物被阻留在细胞内，细胞不能被酒精脱色，仍呈紫色。仍呈紫色。nG G菌：菌：肽聚糖层肽聚糖层薄薄，交联松散，乙醇脱色不能使，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，因其含脂量高其结构收缩，因其含脂量高,乙醇将脂溶解，缝隙
4、乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，酒精将细胞碘复合物溶出细胞壁，酒精将细胞脱色，细胞无色，蕃红复染后呈红色。脱色，细胞无色，蕃红复染后呈红色。1234结晶紫碘液酒精复红三、实验材料三、实验材料n大肠杆菌（大肠杆菌（24h培养）斜面菌种培养）斜面菌种n枯草杆菌（枯草杆菌（12h培养）斜面菌种培养）斜面菌种四、方法步骤四、方法步骤n1涂片、干燥、固定：同简单染色。涂片、干燥、固定：同简单染色。n2初染：滴加初染：滴加结晶紫结晶紫染色染色1min，后用水冲洗。，后用水冲洗。3媒染：滴加媒染：滴加碘液碘液染色染色12min，后用水冲洗，后用水冲洗，甩尽残余水甩尽残余水n4
5、脱色：用脱色：用95%乙醇冲洗乙醇冲洗30秒秒（需要严格控需要严格控制时间和浓度制时间和浓度），然后立即用水冲洗。），然后立即用水冲洗。n5复染：用蕃红或石炭酸复红覆盖涂片进行复染：用蕃红或石炭酸复红覆盖涂片进行复染，复染，蕃红染蕃红染23min，如果，如果石炭酸复红染石炭酸复红染1min。水洗，晾干。水洗，晾干。n6镜检：先用低倍镜观察，后用镜检：先用低倍镜观察，后用油镜油镜观察观察1 革兰氏阴性杆菌革兰氏阴性杆菌革兰氏阳性杆菌革兰氏阳性杆菌n1、载玻片要洁净无油迹。涂片时，滴水不、载玻片要洁净无油迹。涂片时，滴水不要过多，挑菌量宜少，涂片要均匀，菌膜要过多，挑菌量宜少，涂片要均匀，菌膜宜薄
6、。宜薄。n2、革兰氏染色成败的关键是、革兰氏染色成败的关键是酒精脱色酒精脱色。五、注意事项五、注意事项3、染色过程中勿使染色液干涸。、染色过程中勿使染色液干涸。4、选用幼龄的细菌。、选用幼龄的细菌。实验六实验六 微生物细胞大小测定微生物细胞大小测定一、实验目的一、实验目的n学学习习用用镜镜台台测测微微尺尺校校正正目目镜镜测测微微尺尺的的方方法法n学学习习并并掌掌握握用用目目镜镜测测微微尺尺测测定定细细菌菌细细胞胞大小的方法大小的方法n巩固显微镜油镜的使用方法巩固显微镜油镜的使用方法二、实验原理n测定微生物细胞大小是在显微镜下利用测定微生物细胞大小是在显微镜下利用测微尺测微尺进行。进行。n测微尺
7、可分为测微尺可分为目镜测微尺目镜测微尺和和镜台测微尺镜台测微尺。n目镜测微尺目镜测微尺是特制的圆形玻片，中央有一刻度尺（是特制的圆形玻片，中央有一刻度尺（100等分等分），可放入目镜镜筒内，用于测定细胞大小。），可放入目镜镜筒内，用于测定细胞大小。n镜台测微尺镜台测微尺为一载玻片，上贴有圆形盖片，中央有总为一载玻片，上贴有圆形盖片，中央有总长度为长度为1mm(100等分等分)，每小格长，每小格长0.01mm(10m)。n目镜测微尺每小格大小随显微镜放大倍数不同而改变，目镜测微尺每小格大小随显微镜放大倍数不同而改变，使用目镜测微尺进行测量之前必须用镜台测微尺标定使用目镜测微尺进行测量之前必须用镜
8、台测微尺标定，以求出在某一放大倍数下目镜测微尺每小格所代表的以求出在某一放大倍数下目镜测微尺每小格所代表的长度，然后用标定好的目镜测微尺进行测量。长度，然后用标定好的目镜测微尺进行测量。三、三、实验材料实验材料n枯草杆菌标本片枯草杆菌标本片四、实验方法步骤四、实验方法步骤1）用镜台测微尺标定目镜测微尺。）用镜台测微尺标定目镜测微尺。2）用目镜测微尺测定枯草杆菌大小。）用目镜测微尺测定枯草杆菌大小。（1）用镜台测微尺标定目镜测微尺。）用镜台测微尺标定目镜测微尺。n放置目尺放置目尺：取出目镜，旋开接目镜，将目尺放：取出目镜，旋开接目镜，将目尺放在目镜镜筒的中间隔板上（有刻度的一面朝下）在目镜镜筒的
9、中间隔板上（有刻度的一面朝下），旋上接目镜，并插入镜筒。，旋上接目镜，并插入镜筒。n放置台尺放置台尺：将台尺放置于显微镜的载物台上，：将台尺放置于显微镜的载物台上，使刻度面朝上。使刻度面朝上。n标定目尺标定目尺：先用低倍镜观察，找到台尺刻度，：先用低倍镜观察，找到台尺刻度，转动目镜使目尺与台尺的刻度轴线相平行，移转动目镜使目尺与台尺的刻度轴线相平行，移动台尺使目尺与台尺某一区间的两对刻度线完动台尺使目尺与台尺某一区间的两对刻度线完全重合，然后计数出两重合线间各自所占格数，全重合，然后计数出两重合线间各自所占格数，通过如下公式计算：通过如下公式计算：n数数n标定低倍镜目尺每小格所代表的实际长度标
10、定低倍镜目尺每小格所代表的实际长度目尺每小格长度（目尺每小格长度（um）=两对重合刻度线之间台尺所占格数两对重合刻度线之间台尺所占格数10两对重合刻度线之间目尺所占格数两对重合刻度线之间目尺所占格数（2）用目镜测微尺测定枯草杆菌大小）用目镜测微尺测定枯草杆菌大小n取下台尺，将染色片放在载物台上，先取下台尺，将染色片放在载物台上，先用低倍镜观察，后换油镜观测，计量细用低倍镜观察，后换油镜观测，计量细菌菌长和宽长和宽所占小格数，将测得格数乘以所占小格数，将测得格数乘以已标定的目尺每小格长，即得菌体实际已标定的目尺每小格长，即得菌体实际大小。大小。n分别选择分别选择5 5个大的和个大的和5 5个小的
11、菌体，并测个小的菌体，并测量其长、宽数值，求出平均值，以正确量其长、宽数值，求出平均值，以正确格式表示细菌大小。格式表示细菌大小。n将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净：将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净：na.先用擦镜纸将油镜头上的油擦去，擦先用擦镜纸将油镜头上的油擦去，擦1次。次。nb.用擦镜纸沾少许擦镜液将镜头擦用擦镜纸沾少许擦镜液将镜头擦1次。次。nc.再用干净的擦镜纸将镜头擦再用干净的擦镜纸将镜头擦1次。次。n注意擦镜头时向一个方向擦拭。注意擦镜头时向一个方向擦拭。n将显微镜小心轻拿，按号放入显微镜柜中。将显微镜小心轻拿，按号放入显微镜柜中。n 观察后的染色玻片用废纸将香柏油擦干净，观察后的染色玻片用废纸将香柏油擦干净，放入回收容器内。放入回收容器内。实验完毕后的处理实验完毕后的处理 实验报告实验报告：（1）目镜测微尺标定结果记录）目镜测微尺标定结果记录（2 2）在油镜下测量枯草杆菌大小结果记录在油镜下测量枯草杆菌大小结果记录下次实验：实验七、八、九下次实验：实验七、八、九