《高中生物人教选修一精讲导学专题课题多聚酶链式反应扩增dna片段.pptx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《高中生物人教选修一精讲导学专题课题多聚酶链式反应扩增dna片段.pptx（39页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、第1页/共39页一、PCR的原理及反应过程1.生物体内DNA复制的条件:(1)原料:_。(2)模板:解旋后的每一条_。(3)酶:打开DNA双链的_ 和合成DNA单链的_。(4)引物:为DNA聚合酶的起始提供_末端。4种脱氧核苷酸DNA母链解旋酶DNA聚合酶3第2页/共39页2.PCR的概念和原理:(1)概念:PCR即多聚酶链式反应,是一种体外_的技术。它能以极少量的DNA为模板,在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。迅速扩增DNA片段第3页/共39页(2)原理:DNA变性:在_ 的温度范围内,DNA的_ 结构将解体,双链分开,这个过程称为变性。DNA复性:当温度缓慢降低后,两条彼此分离的DNA
2、链又会重新_,这个过程称为复性。DNA合成:DNA聚合酶从引物_ 端开始延伸DNA链,DNA的合成方向总是从子链的_ 端向_ 端延伸。80100双螺旋结合成双链353第4页/共39页(3)条件:原料:_。模板:热变性解旋后的两条_。酶:_。引物:能分别与_ 两端互补配对的两种引物,为DNA聚合酶提供3末端。其他条件:需要稳定的_ 和能自动调节温度的温控设备。四种脱氧核苷酸DNA母链耐热的DNA聚合酶两条模板链缓冲溶液第5页/共39页3.PCR的反应过程:变性:当温度上升到_以上时,双链DNA解旋,氢键断裂,变为 单链复性:当温度下降到_左右,两种引物通过_ 分别与两条单链DNA结合延伸:当温度
3、上升到_左右,溶液中的四种脱氧核苷酸 (A,T,G,C)在_ 的作用下,根据_ 原则合成新的DNA链9050碱基互补配对72DNA聚合酶碱基互补配对第6页/共39页二、PCR的实验操作1.实验用具:(1)PCR仪:该仪器能自动调控_,实现DNA的扩增。如果没有PCR仪,可用3个_ 水浴锅代替,操作时按程序在3个水浴锅中来回转移PCR反应的微量离心管。(2)微量离心管:总容积为_mL,实际上是进行PCR反应的场所。(3)微量移液器:用于向微量离心管中转移PCR配方中的液体,每吸取一种试剂后其上的一次性吸液枪头都必须更换。温度恒温0.5第7页/共39页2.实验步骤:准备:按照PCR反应需要的物质和
4、条件,将需要的试剂和仪器准 备好移液:用_ 按照配方在微量离心管中依次加入各试剂混合:盖严离心管口的盖子,用手指轻弹_,使反应液混 合均匀离心:将离心管放在离心机上,离心约10s,使反应液集中在 _反应:将离心管放入_ 中进行反应微量移液器管的侧壁离心管底部PCR仪第8页/共39页3.DNA含量的测定:(1)原理:利用DNA在_ 的紫外线波段有一强烈的吸收峰。(2)计算公式:DNA含量(g/mL)=_稀释倍数。260 nm50(260 nm的读数)第9页/共39页【思考辨析】1.判断正误(1)PCR过程中,需要解旋酶打开氢键,使DNA双链解旋为单链。()【分析】PCR的解旋过程是用热变性的原理
5、打开氢键,未用到DNA解旋酶。(2)PCR的引物是一段与DNA相配对的RNA片段。()【分析】PCR的引物可以是RNA片段,也可以是DNA片段。第10页/共39页(3)复性过程中,DNA母链与新合成的子链形成双螺旋。()【分析】复性过程是让解旋后的母链通过碱基互补配对与引物结合。(4)耐热的DNA聚合酶可以从生活在热泉的细菌中提取。()第11页/共39页2.问题思考(1)PCR反应过程中的温度控制为什么要先高温后低温然后再适当升温?请分析原因。提示：PCR过程中先高温解旋,后低温使引物与模板结合,然后再适当升温尽量达到TaqDNA聚合酶的最适温度,加快反应速度。(2)PCR过程中,经过30次循
6、环,一个DNA分子会扩增成多少个?提示：每循环1次,DNA分子数会变为原来的2倍,因此经过30次循环,会扩增成230个DNA分子。第12页/共39页一、生物体内的DNA复制与PCR反应的比较体内体内DNADNA复制复制PCRPCR反应反应不不同同点点时期时期细胞有丝分裂间期和减数第细胞有丝分裂间期和减数第一次分裂前的间期一次分裂前的间期体外随时进行体外随时进行场所场所活细胞内活细胞内细胞外细胞外酶酶解旋酶、解旋酶、DNADNA聚合酶聚合酶耐高温的耐高温的DNADNA聚合酶聚合酶(TaqDNA(TaqDNA聚合酶聚合酶)特点特点边解旋边复制边解旋边复制,半保留复制半保留复制体外迅速扩增体外迅速扩
7、增是否需是否需缓冲液缓冲液不需缓冲液不需缓冲液严格配制严格配制1010倍浓缩扩倍浓缩扩增缓冲液增缓冲液设备设备无无严格控制温度变化的严格控制温度变化的温控设备温控设备第13页/共39页体内体内DNADNA复制复制PCRPCR反应反应相相同同点点原料原料4 4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸(A(A、G G、C C、T)T)复制原理复制原理严格遵循碱基互补配对原则严格遵循碱基互补配对原则,半保留复制半保留复制模板模板以以DNADNA母链为模板母链为模板引物引物都需要分别与两条模板链相结合的两种引物都需要分别与两条模板链相结合的两种引物第14页/共39页【易错提醒】(1)解旋酶的作用是使DNA两条链的氢键
8、断开,而DNA聚合酶与DNA连接酶的作用都是催化形成磷酸二酯键。(2)DNA聚合酶是将单个核苷酸加到已有的单链片段的3端上,需要模板;而DNA连接酶连接的是两条DNA片段的缺口,不需要模板。第15页/共39页【典例训练1】PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比,主要有两点不同,它们是()PCR过程需要的引物是人工合成的单链DNA或RNAPCR过程不需要DNA聚合酶PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶,而是通过对反应温度的控制来实现的PCR过程中,DNA不需要解旋,直接以双链DNA为模板进行复制A.B.C.D.第16页/共39页【解题关键】解答本题的关键是:明确PCR过程需要人工合成的引物,利用
9、热变性的原理打开DNA的双链。第17页/共39页【解析】选C。PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比较,主要有两点不同:(1)PCR过程需要的引物是人工合成的单链DNA或RNA,长度通常为2030个核苷酸。(2)PCR过程中,DNA解旋不依赖解旋酶,而是通过对反应温度的控制来实现的。第18页/共39页【误区警示】无论DNA是在细胞内还是在体外复制的过程都需要解旋,因为只有解旋使碱基暴露,母链才能和子链配对,进行半保留复制。但在细胞内,解旋通过解旋酶完成。生物体外,利用DNA的热变性原理:80100时DNA的双螺旋结构将解体,双链分开。其结果相同,但过程不同。第19页/共39页二、PCR操作1.
10、PCR解旋与复旋的原理:DNA热变性与复性：第20页/共39页2.PCR的反应过程(如图):第21页/共39页3.PCR扩增的计算与DNA含量的测定:(1)理论上DNA呈指数方式扩增。若开始只有一个DNA提供模板,则循环n次后有2n个DNA;若开始有N0个DNA提供模板,则循环n次后获得的子代DNA数目为N02n个。第22页/共39页(2)DNA含量的测定:DNA在260 nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰,峰值的大小与DNA含量有关。可以利用DNA的这一特点进行DNA含量的测定,具体方法如下:第23页/共39页第24页/共39页【易错提醒】(1)PCR过程中无解旋酶,需要升高温度才能打开氢键,
11、但此时的温度还不能破坏磷酸二酯键,因此,热变性后是DNA单链,并未分解成单体。(2)复性时只是在引物和DNA单链之间形成氢键,两条单链之间并未形成氢键,因此复性后,无双链DNA分子形成。第25页/共39页【典例训练2】PCR(多聚酶链式反应)技术是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术,下图表示合成过程,请据图分析回答:第26页/共39页(1)A过程高温使DNA变性解旋,对该过程的原理叙述,正确的是 ()A.该过程用到耐高温的解旋酶破坏氢键B.该过程用到限制酶破坏磷酸二酯键C.该过程不需要解旋酶的作用D.该过程与人体细胞的过程完全相同第27页/共39页(2)C过程要用到的酶是。这种酶在
12、高温下仍保持活性,因此在PCR扩增时可以加入。PCR反应除提供酶外,还需要满足的基本条件有:_。(3)如果把模板DNA的两条链用15N标记,游离的脱氧核苷酸不做标记,控制“955572”温度循环3次,则在形成的子代DNA中含有15N标记的DNA占。第28页/共39页(4)如果模板DNA分子共有a个碱基对,其中含有胞嘧啶m个,则该DNA复制10次,需要加入胸腺嘧啶脱氧核苷酸个。(5)PCR中由碱基错配引起的变异属于。假设对一个DNA进行扩增,第一次循环时某一条模板链上发生碱基错配,则扩增若干次后检测所有DNA的扩增片段,与原DNA相应片段相同的占。第29页/共39页【解题关键】首先要明确DNA复
13、制的特点:半保留复制,其次掌握DNA的复制是呈“指数”增长的。此外还要理解DNA复制原则:碱基互补配对原则。第30页/共39页【解析】(1)高温所起的作用类似于解旋酶,使双链DNA解聚为单链。(2)C过程为PCR技术的延伸阶段,当系统温度上升至72左右时,溶液中的四种脱氧核苷酸在TaqDNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。TaqDNA聚合酶是耐热的,高温下不变性,所以一次性加入即可。PCR即为体外DNA复制,所需条件与体内DNA复制基本相同,都需要模板、原料、能量、酶,只不过为了便于控制DNA复制过程,通过设置高温解旋代替了解旋酶的作用,省掉了解旋酶作用过程中所需能量的供应,同时,加入了与模板
14、链相结合的引物作为子链延伸的起点,省掉了切除引物的过程,使PCR过程更简洁。(3)PCR技术遵循半保留复制的特点。经过3次第31页/共39页循环,共产生23个DNA分子,其中有2个DNA分子含有15N标记。(4)在一个双链DNA分子中,(C+T)占碱基总数的一半,故T的数目为a-m,复制10次,相当于新增加了(210-1)个DNA分子,故需补充T的数目为(210-1)(a-m)。(5)基因中的碱基对改变属于基因突变。对一个DNA进行扩增,第一次循环时某一条模板链上发生碱基错配,以后按正常配对方式进行扩增,错配链作模板扩增的都是错误的DNA分子,原正常链扩增得到的DNA分子都是正常的DNA分子,
15、故若干次后检测所有DNA的扩增片段,与原DNA相应片段相同的占75%。第32页/共39页答案:(1)C(2)TaqDNA聚合酶一次DNA模板,分别与两条模板链相结合的两种引物,四种脱氧核苷酸,同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行(3)25%(4)(210-1)(a-m)(5)基因突变75%第33页/共39页【变式训练】“X基因”是DNA分子上一个有遗传效应的片段,若要用PCR技术特异性地拷贝“X基因”,需在PCR反应中加入两种引物,两种引物及其与模板链的结合位置如图1所示。经4次循环后产物中有5种不同的DNA分子,如图2所示,其中第种DNA分子有几个()第34页/共39页A.2 B.4 C.6 D.8第35页/共39页【解析】选D。PCR技术扩增时,由两种引物决定所扩增的片段的特定序列,上一次循环的产物为下一次循环的模板。第一次循环形成和,第二次循环形成4个DNA,以此类推,4次循环后共形成16个DNA,其中各1个,各3个,共8个。第36页/共39页第37页/共39页第38页/共39页感谢您的观看！第39页/共39页