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1、第5章 表达载体本讲稿第一页，共二十五页西南大学生物技术专业 基因工程2一、大肠杆菌表达载体的结构一、大肠杆菌表达载体的结构原核表达载体：适用于在原核细胞中表达外源基因的载体。原核表达载体：适用于在原核细胞中表达外源基因的载体。均是质粒载体，首先必然满足克隆载体的基本要求，然后增加表达均是质粒载体，首先必然满足克隆载体的基本要求，然后增加表达元件。元件。1 1、表达元件、表达元件(expression elements)(expression elements)：1 1）启动子）启动子(promoter)(promoter)：三类，即：三类，即laclac启启动动子子、trptrp启启动动子子
2、和和它它们们的的杂杂合合启启动动子子tactac或或trctrc，都都受受IPTGIPTG诱诱导。导。T T7 7噬菌体启动子噬菌体启动子噬菌体的噬菌体的P PL L启动子。启动子。第一节第一节 大肠杆菌表达载体大肠杆菌表达载体本讲稿第二页，共二十五页西南大学生物技术专业 基因工程32）终止子：依赖于）终止子：依赖于因子或不依赖于因子或不依赖于因子（遇茎环结构而终止）因子（遇茎环结构而终止）。3 3）核糖体结合位点）核糖体结合位点(ribosome binding side,RBS)(ribosome binding side,RBS)：Shine-Dalgarno Shine-Dalgarn
3、o(SD)序列，序列，ATG与与RBS之间的距离很重要，一般之间的距离很重要，一般3-11bp。2、表达形式、表达形式完整单一蛋白：单一基因的编码区表达。完整单一蛋白：单一基因的编码区表达。融合蛋白融合蛋白(fusion protein)：多个基因的编码区的串联体，但构成：多个基因的编码区的串联体，但构成一个整体的单一一个整体的单一ORF，如果融合标签蛋白有利于蛋白的定向、纯化，如果融合标签蛋白有利于蛋白的定向、纯化，如果融合多个目标蛋白，则类似于直接表达了一个多酶复合体一样，如果融合多个目标蛋白，则类似于直接表达了一个多酶复合体一样，可减少载体构建难度，而且可以偶连两个或多个相关基因的表达。
4、可减少载体构建难度，而且可以偶连两个或多个相关基因的表达。本讲稿第三页，共二十五页西南大学生物技术专业 基因工程43、表达的控制、表达的控制诱导表达系统：诱导表达系统：IPTG防渗漏表达系统：防渗漏表达系统：lacIqPL启动子受启动子受c的调控，低温的调控，低温(30)下阻抑转录，下阻抑转录，高温高温(40-45)下解除抑制。下解除抑制。二、利用二、利用T7噬菌体启动子的表达载体噬菌体启动子的表达载体pET系列，表达能力强，可控性好，只受系列，表达能力强，可控性好，只受T7噬噬菌体菌体RNA聚合酶识别，不受大肠杆菌聚合酶识别，不受大肠杆菌RNA聚聚合酶识别，可用合酶识别，可用IPTG诱导表达
5、。诱导表达。本讲稿第四页，共二十五页西南大学生物技术专业 基因工程5非融合型表达载体非融合型表达载体 主要元件主要元件：强启动子、：强启动子、SD、起始密码子、起始密码子ATG、万能终止密、万能终止密码子。码子。PSDForeign DNA非融合型表达载体非融合型表达载体非融合基因非融合基因本讲稿第五页，共二十五页西南大学生物技术专业 基因工程6非融合型表达载体非融合型表达载体-pPL-LamdaPL启动子启动子-温度诱导温度诱导插入位点插入位点-HpaI本讲稿第六页，共二十五页西南大学生物技术专业 基因工程7三、表达融合蛋白的表达载体三、表达融合蛋白的表达载体1 1、GST GST(glut
6、ahione(glutahione S-transferase,S-transferase,谷谷胱胱苷苷肽肽S-S-转转移移酶酶)表表达达载载体体：如如AmershammAmershamm公公司司的的pGEXpGEX系系列列，其其GSTGST来来自自于于血血吸吸早早虫虫，融融合合蛋蛋白白下下保保持持酶酶学学活活性性，对对谷谷胱胱苷苷肽肽有有很很强强的的结结合合能能力力，融融合合蛋蛋白白纯纯化化出出来来后后用用凝凝血血蛋蛋白酶切割可得到纯的目的蛋白。白酶切割可得到纯的目的蛋白。2 2、组组氨氨酸酸标标签签表表达达载载体体：如如NovagenNovagen公公司司的的pETpET系系列列，可可在在
7、目目标标蛋蛋白白的的N-N-端端或或C-C-端端加加上上6 6个个组组氨氨酸酸的的标标签签和和XaXa因因子子酶酶工工位位点点，能能与与镍镍等等二二价价金金属属离离子子结结合合，纯纯化化目目的的蛋蛋白白，用用XaXa因子处理可得到纯的目的蛋白。因子处理可得到纯的目的蛋白。本讲稿第七页，共二十五页西南大学生物技术专业 基因工程83 3、内内含含肽肽表表达达载载体体：如如NEBNEB公公司司的的Impact-TwinImpact-Twin系系统统，将将目目的的蛋蛋白白放放在在两两个个可可自自裂裂解解的的内内含含肽肽(intein)(intein)中中间间，在在得得到到融融合合蛋蛋白白以以后后不不通
8、通过过蛋蛋白白酶酶消消解解、只只需需要要调调节节pHpH值等条件就将标签蛋白切除。值等条件就将标签蛋白切除。4 4、分分泌泌表表达达载载体体：产产物物可可跨跨膜膜分分泌泌至至胞胞周周间间隙隙，可可避避免免受受细细胞胞内内蛋蛋白白酶酶的的降降解解，或或使使其其正正确确折折叠叠，或或去去除除N-N-端甲硫氨酸，以维护活性。端甲硫氨酸，以维护活性。信信号号肽肽(signal(signal peptide)peptide)有有碱碱性性磷磷酸酸酶酶信信号号肽肽、蛋蛋白白质质A A信号肽（如信号肽（如AmershamAmersham公司的公司的pEZZ18pEZZ18系统）。系统）。本讲稿第八页，共二十五
9、页西南大学生物技术专业 基因工程9 融合型表达载体融合型表达载体PSDForeign DNA融合型表达载体融合型表达载体融合基因融合基因本讲稿第九页，共二十五页西南大学生物技术专业 基因工程10技术关键技术关键：克隆基因可插入标签肽序列的：克隆基因可插入标签肽序列的3 3或或5 5端，但必须维持正确的端，但必须维持正确的ORFORF。选择合适酶切位点选择合适酶切位点加人工合成的加人工合成的DNA接头接头构建位相载体构建位相载体本讲稿第十页，共二十五页西南大学生物技术专业 基因工程11-ATG-AAC CTG GAA TTC CTA GGT-TAC-TTG GAC CTT AAG GAT CCA
10、-EcoRIBamHIAAT CGG AAG AAT TCA GAC CTA GGTTTA GCC TTC TTA AGT CTG GCT CCA 载体部分序列载体部分序列DNA序列序列本讲稿第十一页，共二十五页西南大学生物技术专业 基因工程12位相载体位相载体-含有含有3种读码框的系列载体种读码框的系列载体本讲稿第十二页，共二十五页西南大学生物技术专业 基因工程13优点：优点：表达效率高表达效率高产物稳定产物稳定 易易鉴鉴定定：融融合合蛋蛋白白分分子子量量大大，电电泳泳可可鉴鉴定定易纯化：利用融合原核多肽的特性易纯化：利用融合原核多肽的特性本讲稿第十三页，共二十五页西南大学生物技术专业 基因
11、工程14Ptac：IPTG诱导诱导GST融合蛋白融合蛋白直接纯化直接纯化产物，切割方便：产物，切割方便：pGEX-1 T凝血酶凝血酶 pGEX-2T-凝血酶凝血酶 pGEX-3T-X因子因子位相载体位相载体融合型载体融合型载体-pGEX系列系列本讲稿第十四页，共二十五页西南大学生物技术专业 基因工程15分泌型融合表达载体分泌型融合表达载体-pEZZ18本讲稿第十五页，共二十五页西南大学生物技术专业 基因工程16分泌型表达载体分泌型表达载体-pINIII-ompA1本讲稿第十六页，共二十五页西南大学生物技术专业 基因工程17四、表达产物的纯化四、表达产物的纯化1 1、包包涵涵体体(inclusi
12、on(inclusion body)body)的的纯纯化化：许许多多情情况况下下表表达达产产物物在在细细胞胞内内形形成成不不溶溶的的颗颗粒粒状状包包涵涵体体，可可通通过过机机械械法法、冻冻融融法法、超超声声波波处处理理等等破破碎碎细细胞胞，离离心心收收集集包包涵涵体体，洗洗涤涤去去除除杂杂蛋蛋白白，用用盐盐酸酸胍、尿素和胍、尿素和SDSSDS溶解包涵体，再通过一定的法使蛋白质折叠。溶解包涵体，再通过一定的法使蛋白质折叠。有有的的经经上上法法得得到到后后仍仍然然有有活活性性，有有的的蛋蛋白白一一旦旦形形成成包包涵涵体体后后就就没没有有活活性性了，但可作为抗原。了，但可作为抗原。2、可可溶溶性性蛋
13、蛋白白的的纯纯化化：表表达达的的蛋蛋白白可可以以细细胞胞内内呈呈可可溶溶状状态态，也也有有少少量量进进入入细细胞胞周周质质区区。将将细细胞胞裂裂解解物物的的上上清清部部分分用用于于纯纯化化目目标标蛋蛋白白，甚甚至可直接作为粗酶液进行生化反应。至可直接作为粗酶液进行生化反应。本讲稿第十七页，共二十五页西南大学生物技术专业 基因工程18穿穿梭梭载载体体(shuttle(shuttle vector)vector)：能能够够在在两两类类不不同同的的宿宿主主中中复复制制、增增殖殖和和选选择择的的载载体体，主主要要是是质质粒粒，它它们们至至少少有有两两套套复复制单元和两套选择标记，相当于两个载体的联合。
14、制单元和两套选择标记，相当于两个载体的联合。只只要要涉涉及及大大肠肠杆杆菌菌以以外外的的细细胞胞，绝绝大大多多数数载载体体都都装装有有大大肠肠杆杆菌质粒载体的基本元件，都可看作穿梭载体。菌质粒载体的基本元件，都可看作穿梭载体。第二节第二节 穿梭载体穿梭载体本讲稿第十八页，共二十五页西南大学生物技术专业 基因工程19一一、大大肠肠杆杆菌菌/革革兰兰氏氏阳阳性性菌菌穿穿梭梭载载体体：如如向向枯枯草草芽芽孢孢杆杆菌菌的穿梭。的穿梭。二二、大大肠肠杆杆菌菌/酵酵母母菌菌穿穿梭梭载载体体：主主要要用用于于遗遗传传学学和和真真核核表表达达研研究究，尤尤其其是是当当蛋蛋白白需需要要进进行行真真核核修修饰饰时
15、时，如如磷磷酸酸化化、糖基化等。糖基化等。三三、其其它它穿穿梭梭载载体体：如如动动物物病病毒毒载载体体、植植物物转转化化的的TiTi质质粒粒、昆虫杆状病毒等，更为复杂一些。昆虫杆状病毒等，更为复杂一些。本讲稿第十九页，共二十五页西南大学生物技术专业 基因工程20本讲稿第二十页，共二十五页西南大学生物技术专业 基因工程21整整合合载载体体(integration(integration vector)vector)：用用于于将将某某个个基基因因或或某某些些基基因因插插入入到到宿宿主主的的染染色色体体中中去去工工作作，按按整整合合方方式式可可分分为为定定点点整整合合和和随随机机整整合合两两类类，按
16、按作作用用可可分分为为目目的的基基因因的的插插入入/敲除或随机突变体库的构建。敲除或随机突变体库的构建。一、基因插入一、基因插入/基因敲除基因敲除同同源源重重组组整整合合载载体体最最为为常常用用，不不仅仅含含有有大大肠肠杆杆菌菌克克隆隆载载体的骨架，还有一段便于同源重组的重组体的骨架，还有一段便于同源重组的重组DNADNA片段。片段。第三节第三节 整合载体整合载体本讲稿第二十一页，共二十五页西南大学生物技术专业 基因工程22二、随机插入突变载体二、随机插入突变载体用于功能基因组研究中基因突变材料的创造。用于功能基因组研究中基因突变材料的创造。随随机机突突变变体体库库是是指指标标记记基基因因在在
17、载载体体的的携携带带下下通通过过DNADNA重重组组事事件件随随机插入到基因组中而形成的众多基因突变体的集合。机插入到基因组中而形成的众多基因突变体的集合。1 1、微生物插入突变体库：如、微生物插入突变体库：如pEG922pEG922，需要借助转座子。，需要借助转座子。2 2、构建植物突变体库所用的载体：、构建植物突变体库所用的载体：根根癌癌农农杆杆菌菌(Agrobacterium Agrobacterium tumefacienstumefaciens)介介导导的的T-DNAT-DNA插插入入或或植植物物转转座座子子(transposon)(transposon)标标签签是是植植物物基基因因
18、功功能能研研究究中中常常用用的的产产生生突变体的方法突变体的方法本讲稿第二十二页，共二十五页西南大学生物技术专业 基因工程231 1）T-DNAT-DNA插插入入突突变变体体：植植物物转转基基因因过过程程中中T-DNAT-DNA区区段段如如果果插插入入到到一一个个功功能能基基因因中中，会会导导致致该该基基因因插插入入失失活活而而产产生性状变化，形成突变体。生性状变化，形成突变体。还还可可以以在在T-DNAT-DNA区区段段构构建建基基因因激激活活标标签签、基基因因陷陷阱阱(gene(gene trap)trap)、启启动动子子陷陷阱阱(promoter(promoter trap)trap)或
19、或增增强强子子陷陷阱阱(enhancer(enhancer trap)trap)，用用于于直直接接克克隆隆靶靶基基因因编编码码区区、启动子、增强子等。启动子、增强子等。对对于于突突变变基基因因，只只需需要要采采用用反反向向PCRPCR或或锚锚定定PCRPCR扩扩增增或或通通过过筛选文库，就可以直接克隆得到其序列。筛选文库，就可以直接克隆得到其序列。本讲稿第二十三页，共二十五页西南大学生物技术专业 基因工程242 2）植植物物Ac-DsAc-Ds转转座座子子双双因因子子插插入入突突变变：玉玉米米Ac Ac(activator)(activator)因因子子是是一一个个转转座座子子，含含有有完完整
20、整的的转转座座酶酶，Ds Ds(dissociation)(dissociation)是是AcAc缺缺失失转转座座酶酶基基因因的的缺缺失失体体，但但具两端的反向重复序列。具两端的反向重复序列。分分别别构构建建含含AcAc和和DsDs的的质质粒粒载载体体载载体体并并分分别别转转化化植植物物，转转基基因因植株杂交植株杂交(AcDs)(AcDs)后代中会发生转座事件而产生突变体。后代中会发生转座事件而产生突变体。利用利用Ac-DsAc-Ds序列作探针或引物克隆目标基因。序列作探针或引物克隆目标基因。本讲稿第二十四页，共二十五页西南大学生物技术专业 基因工程253 3）构建动物随机突变体库常用载体：用基因陷阱。）构建动物随机突变体库常用载体：用基因陷阱。基基因因陷陷阱阱的的基基本本原原理理是是通通过过携携带带有有报报告告基基因因的的载载体体随随机机整整合合到到动动物物或或其其它它生生物物染染色色体体，干干扰扰内内源源基基因因的的功功能能，并并标标记记被被插插入入的的基基因因，然然后后克克隆隆之之，方方法法同同前前面面的的植植物物的的方方法法一一样。样。动动物物的的转转化化方方法法与与植植物物不不同同，一一般般采采用用电电转转化化、反反转转录录病病毒毒转染等。转染等。本讲稿第二十五页，共二十五页