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1、一、基础一、基础一、基础一、基础知识知识知识知识微生物微生物微生物微生物（一）微生物的类群微生物原核类:真核类非细胞类：蓝藻、细菌、放线菌、支原体等酵母菌、霉菌、食用菌真菌：单细胞植物：衣藻 单细胞动物：草履虫病毒特点：结构都相当简单，个体多数十分微小。通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到。第1页/共42页细菌的形态细菌第2页/共42页 单个或者少数微生物在固体培养基表面生长繁殖,可以形成肉眼可见子细胞的群体菌落菌落用途菌落用途：用于微生物：用于微生物纯化、计数、鉴定纯化、计数、鉴定第3页/共42页菌落菌落细菌的菌落特征因种而异。菌落特征是微生物鉴定的重要依据菌苔：菌落连成片 第4页/共42
2、页 有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。（抗逆性极强）第5页/共42页例如，有的细菌的芽孢，煮沸例如，有的细菌的芽孢，煮沸3 3小时以后才死亡。芽孢又小时以后才死亡。芽孢又小又轻，可以随风飘散。当环境适宜（如温度、水分适宜）小又轻，可以随风飘散。当环境适宜（如温度、水分适宜）的时候，芽孢又可以萌发，形成一个细菌的时候，芽孢又可以萌发，形成一个细菌.第6页/共42页氮源氮源无机盐无机盐液体培养基液体培养基鉴别培养基鉴别培养基PHPH氧气氧气第7页/共42页根据培养基外观的物理状态液体培养基液体培养基：液状培
3、养基需要进行通气培养、振荡培养。液状培养基需要进行通气培养、振荡培养。这种培养基常用于工业这种培养基常用于工业生产生产。固体培养基：固体培养基：在培养基中加入一定量凝固剂在培养基中加入一定量凝固剂琼脂琼脂，使其成，使其成为固体状态，分离、鉴定、活菌计数、菌种保藏等用为固体状态，分离、鉴定、活菌计数、菌种保藏等用加入琼脂的量决定培养基的物理状态。琼脂的性质：熔点：96度凝固点：40度注意：一般细菌不能利用琼脂。第8页/共42页液体培养基：表面生长表面生长均匀混浊生长均匀混浊生长沉淀生长沉淀生长backback(是否运动)固体培养基：菌落固体培养基：菌落第9页/共42页基础培养基基础培养基：含有细
4、菌生长繁殖所需的基本营养物质，可供大多数细菌生长。基础培养基是配制特殊培养基的基础，也可作为一般培养基使用。如在牛肉浸液中加入适量的蛋白胨、氯化钠、磷酸盐，调节如在牛肉浸液中加入适量的蛋白胨、氯化钠、磷酸盐，调节 pH7.2pH7.27.67.6，经灭菌处理后，即为基础液体培养基；如再加入，经灭菌处理后，即为基础液体培养基；如再加入0.3%0.3%0.5%0.5%的琼脂，则为基础半固体培养基；加入的琼脂，则为基础半固体培养基；加入1%1%2%2%的的琼脂，则为基础固体培养基。琼脂，则为基础固体培养基。根据培养基的功能鉴别培养基在培养基中加入某种指示剂或化学药品,用以鉴别不同种类的微生物,如伊红
5、和美蓝培养基上生长的大肠杆菌菌落带有金属如伊红和美蓝培养基上生长的大肠杆菌菌落带有金属光泽光泽,可以用来鉴别大肠杆菌可以用来鉴别大肠杆菌大肠杆菌分解乳糖产生大量混淆酸，可染上酸性伊红，伊红又和美大肠杆菌分解乳糖产生大量混淆酸，可染上酸性伊红，伊红又和美蓝结合，菌落被染成深紫色，从菌落外貌的发射光中还可以看到绿蓝结合，菌落被染成深紫色，从菌落外貌的发射光中还可以看到绿色金属发光色金属发光第10页/共42页选择培养基加链霉素 可抑制细菌和放线菌的生长,将真菌分离出来。（链霉素可以抑制细菌（链霉素可以抑制细菌和放线菌的生长和放线菌的生长,对酵母菌和霉菌不起作用对酵母菌和霉菌不起作用.加入一定量链霉素
6、的加入一定量链霉素的培养基可以从混杂的微生物群体中分离出酵母菌和霉菌培养基可以从混杂的微生物群体中分离出酵母菌和霉菌.）加高浓度的食盐 抑制多种细菌生长,分离到金黄色葡萄球菌。无氮培养基 可用以选择能固氮的细菌。不加含碳有机物的无碳培养基 分离自养型微生物加富培养基：是指在培养基成分的营养物质仅适合一种或一类微生物，从而使此类生物生长繁殖较快淘汰其他微生物第11页/共42页培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。培养基选择分解尿素的微生物的原理第
7、12页/共42页刚果红染色法 刚果红能与纤维素形成红色复合物刚果红能与纤维素形成红色复合物，而不与水，而不与水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。纤维素分解菌的筛选 在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基中的纤维素形成果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物红色复合物。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红-纤维素的纤维素的复合物就无法形成，培养基中就会出现复合物就无法形成，培养基中就会出现以纤维以纤维素分解菌为中心的透明圈素分解菌为中心的透明圈，这样我们就可以通，这样我们就可以通过
8、是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。纤维二糖C1酶、Cx酶葡萄糖苷酶葡萄糖纤维素第13页/共42页第14页/共42页三、三、培养基的营养物质培养基的营养物质1 1、水水2 2、碳源碳源（提供碳元素的物质）（提供碳元素的物质）3 3、氮源氮源（提供氮元素的物质）（提供氮元素的物质）4 4、无机物无机物（无机盐）（无机盐）5 5、生长因子生长因子（微生物生长不可缺少的微量（微生物生长不可缺少的微量有机物。如维生素、含氮碱基）有机物。如维生素、含氮碱基）第15页/共42页 碳源碳源可作为碳源的物质有可作为碳源的物质有:a.a.含碳无机物含碳无机物:b.b.含碳有机物
9、：含碳有机物：蛋白质蛋白质脂肪酸脂肪酸不同微生物所利用的碳源不同不同微生物所利用的碳源不同a.异养型微生物异养型微生物的碳源为的碳源为b.自养型微生物自养型微生物的碳源为的碳源为碳酸盐碳酸盐 碳酸氢盐碳酸氢盐二氧化碳二氧化碳糖类（主要）糖类（主要）含碳有机物（有机碳）含碳有机物（有机碳）含碳无机物（无机碳）含碳无机物（无机碳）第16页/共42页氮源氮源可作为氮源的物质有可作为氮源的物质有:a.a.含氮无机物：含氮无机物：b.b.含氮有机物：含氮有机物：蛋白胨蛋白胨牛肉膏牛肉膏尿素尿素氮气氮气氨气氨气硝酸盐硝酸盐铵盐铵盐注意：蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、麦芽汁注意：蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、麦芽汁等天
10、然营养物质中既含有碳源又同时含有等天然营养物质中既含有碳源又同时含有氮源、生长因子等营养要素氮源、生长因子等营养要素第17页/共42页第18页/共42页化学药剂消毒化学药剂消毒外来杂菌外来杂菌干热灭菌干热灭菌高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌第19页/共42页无菌操作无菌操作1 1、获得纯净培养物的关键：、获得纯净培养物的关键：2 2、无菌操作、无菌操作 避免杂菌感染操作对象的操作过程避免杂菌感染操作对象的操作过程3 3、哪些地方有菌可能导致菌体感染？、哪些地方有菌可能导致菌体感染？操作者操作者 培养基、接种工具、器皿培养基、接种工具、器皿 空间空间 防止外来杂菌的入侵防止外来杂菌的入侵第20页/共42
11、页第21页/共42页称量称量灭菌灭菌平板划线法平板划线法稀释涂布平板法稀释涂布平板法甘油管藏法甘油管藏法第22页/共42页无菌操作无菌操作1 1、获得纯净培养物的关键：、获得纯净培养物的关键：2 2、无菌操作、无菌操作 避免杂菌感染操作对象的操作过程避免杂菌感染操作对象的操作过程3 3、哪些地方有菌可能导致菌体感染？、哪些地方有菌可能导致菌体感染？操作者操作者 培养基、接种工具、器皿培养基、接种工具、器皿 空间空间 防止外来杂菌的入侵防止外来杂菌的入侵第23页/共42页倒平板操作第24页/共42页答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以倒平板了。2.为什么
12、需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。问题讨论1.培养基灭菌后，需要冷却到50 左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？第25页/共42页3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？答：既可以避免培养基表面的水分过快挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。答：不能用，因为空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生 第26页/共42页（二）、分离纯化大肠杆菌通常把无菌条件下将微生物接入培养基的操作过程叫做接种。1.方法：微生物的接种的
13、常用接种方法有：平板划线法和稀释涂布平板法。平板划线法：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。稀释涂布平板法：将骏业进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。第27页/共42页2 稀释涂布平板法分离微生物的原理：将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂平板表面，经过培养，在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将分散成单个细胞，在培养皿表面形成单个菌落。纯化大肠杆菌n1 平板划线法分离微生物的原理：连续划线。由于划线后，线条末端的细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端
14、开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能 得到由单个细菌繁殖而来的菌落。第28页/共42页（1）平板划线操作：一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；同时存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。（二）、分离纯化大肠杆菌1.方法：第29页/共42页第30页/共42页问题讨论1.1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？2.2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后
15、再进行划线？在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？答：以免接种环温度太高，杀死菌种。答：以免接种环温度太高，杀死菌种。3.3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？末端开始划线？答：答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。第一次灼烧每
16、次划线之前灼烧划线结束灼烧目的避免接种环上可能存在的微生物污染培养基杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染或感染操作者第31页/共42页（2）稀释涂布平板的操作方法（二）、分离纯化大肠杆菌1.方法：第32页/共42页（2）稀释涂布平板的操作方法（二）、分离纯化大肠杆菌1.方法：第33页/共42页（二）、分离纯化大肠杆菌2.培养、鉴定：将接种后的培养基和一个未接种的培养基（对照组）都放入到37恒温箱中，培养12h和24h后，分别观察并记录结果。最适pH 细菌：6.5-7.5 放线菌：7.5-8.5 真菌：5.0-6.0培养温度和时间细菌：30-37 1-2d放线
17、菌：25-28 5-7d真菌：25-28 3-4d3.菌种保存：接种到固体斜面培养基，菌落长成后置于4冰箱保存。长期保存：甘油管藏法临时保藏：第34页/共42页1、显微镜直接计数：利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。微生物计数：不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；缺点第35页/共42页2.间接计数法（活菌计数法）原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。常用方法：稀释涂布平板法。每克样品中的菌落数(CV)M其中，C代表某一稀释度下平板
18、上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。第36页/共42页注意事项为了保证结果准确，一般选择菌落数在30300的平板上进行计数。为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出菌落平均数。统计的菌落往往比活菌的实际数目低。答：当两个或多个细菌细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。第37页/共42页如果得到了2个或2个以上菌落数目在30300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。第38页/共42页课外延伸 在以尿素为唯一氮源的培养基
19、中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到滤膜放到 伊红美蓝伊红美蓝 培养基上培养，大肠杆菌培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现黑色菌落呈现黑色，通过记述得出水样，通过记述得出水样中大肠杆菌的数量。中大肠杆菌的数量。第39页/共42页 为了确定分离得到的是纤维素分解菌，还需要进行为了确定分离得到的是纤维素分解菌，还需要进行_实实验，纤维素酶的发酵方法有验，纤维素酶的发酵方法有_ _ 发酵和发酵和_ _ 发酵。纤维素酶测
20、定方法是对发酵。纤维素酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸等纤维素所产生的纤维素酶分解滤纸等纤维素所产生的_ _ 含量进行定量测定。含量进行定量测定。发酵产纤维素酶 液体 固体 葡萄糖 课题延伸第40页/共42页分解分解纤维纤维素的素的微生微生物的物的分离分离纤维素酶纤维素酶种类、作用、催化活力种类、作用、催化活力刚果红染色刚果红染色筛选原理筛选原理实实验验设设计计土壤取样土壤取样选择培养选择培养纯化纯化培养培养鉴别鉴别培养培养前置染色法前置染色法后置染色法后置染色法富含纤维素土壤富含纤维素土壤增大分解菌含量增大分解菌含量染色鉴别染色鉴别分离出分解菌分离出分解菌课堂总结第41页/共42页感谢您的观看！第42页/共42页