酶工程制药学习.pptx

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1、第六章第六章 酶工程制药酶工程制药教学重点：教学重点：掌握固定化技术、酶的修饰、酶工程在制药工掌握固定化技术、酶的修饰、酶工程在制药工业的应用；了解酶特点及分离纯化。业的应用；了解酶特点及分离纯化。教学难点：教学难点：酶反应器酶反应器 课时：课时：6 6学时学时第1页/共87页主要内容第一节第一节 概述概述第二节第二节 酶的分离纯化酶的分离纯化第三节第三节 酶和细胞的固定化酶和细胞的固定化第四节第四节 固定化酶和固定化细胞的反应固定化酶和固定化细胞的反应器器第五章第五章 固定化酶产品介绍固定化酶产品介绍（自学）（自学）第2页/共87页概述概述一、一、酶工程简介酶工程简介二、二、酶的基础知识酶的

2、基础知识三、三、现代酶工程的主要内容现代酶工程的主要内容四、四、酶的来源和生产酶的来源和生产五、五、酶在医药领域的应用酶在医药领域的应用第3页/共87页第一节第一节 概述概述一、一、酶工程酶工程简介简介 酶工程是酶工程是酶学酶学和和工程学工程学相互渗透结合、发展而形成的一门新相互渗透结合、发展而形成的一门新的技术学科。它是从应用的目的出发研究酶、应用酶的特异催的技术学科。它是从应用的目的出发研究酶、应用酶的特异催化性能，并通过工程化将相应原料转化成有用物质的技术。化性能，并通过工程化将相应原料转化成有用物质的技术。第4页/共87页酶工程的名称出现在酶工程的名称出现在2020世纪世纪2020年代

3、，主要指自年代，主要指自然酶制剂在工业上的规模应用。然酶制剂在工业上的规模应用。19531953年，德国人提出了年，德国人提出了酶固定化技术酶固定化技术 。19691969年，日本人用固定化技术拆分了年，日本人用固定化技术拆分了DL-DL-氨基酸。氨基酸。19711971年，第一届国际酶工程会议提出酶工程的年，第一届国际酶工程会议提出酶工程的主要内容：主要内容：酶的生产、分离纯化、酶的固定化、酶的生产、分离纯化、酶的固定化、酶及固定化的反应器、酶和固定化酶的应用酶及固定化的反应器、酶和固定化酶的应用。第5页/共87页二二 、酶的基础知识、酶的基础知识（一）酶是生物催化剂（一）酶是生物催化剂酶是

4、生物细胞产生的、具有催化能力的生物催化剂。酶是生物细胞产生的、具有催化能力的生物催化剂。催化高效性催化高效性专一性：专一性：结构专一性；结构专一性；立体异构专一性立体异构专一性酶具有不稳定性酶具有不稳定性第6页/共87页7（二）酶的化学本质（二）酶的化学本质蛋白质蛋白质酶酶单纯酶单纯酶结合酶结合酶（全酶）（全酶）=酶蛋白酶蛋白+辅因子辅因子辅因子辅因子辅酶辅酶与酶蛋白结合得牢固的小分子有机物。与酶蛋白结合得牢固的小分子有机物。辅基辅基与酶蛋白结合得松散的小分子有机物。与酶蛋白结合得松散的小分子有机物。金属激活剂金属激活剂金属离子作为辅助因子。金属离子作为辅助因子。第7页/共87页8必需基团必需

5、基团：这些基团若经化学修饰使其改变，则：这些基团若经化学修饰使其改变，则酶的活性丧失。酶的活性丧失。活性部位活性部位：酶分子中直接与底物结合，并和酶：酶分子中直接与底物结合，并和酶催化作用直接有关的部位。催化作用直接有关的部位。必需基团活性部位活性部位维持酶的空间结构维持酶的空间结构结合基团结合基团催化基团催化基团专一性专一性催化性质催化性质第8页/共87页三、现代酶工程的主要内容：1.酶的分离纯化、大批量生产及新酶和酶的应用开发；2.酶和细胞的固定化及酶反应器的研究，包括酶传感器、反应检测；3.酶生产中基因工程技术的应用及遗传修饰酶的研究；4.酶的分子改造和化学修饰，结构与功能的研究；第9页

6、/共87页5.5.有机相中酶反应有机相中酶反应的研究；的研究；6.6.酶的酶的抑制剂、激活剂抑制剂、激活剂的开发与应用研究；的开发与应用研究；7.7.抗体酶抗体酶、核酸酶核酸酶的研究；的研究；8.8.模拟酶、合成酶模拟酶、合成酶及酶分子的人工设计、合成及酶分子的人工设计、合成研究。研究。第10页/共87页11四、酶的来源和生产四、酶的来源和生产（一）酶的来源（一）酶的来源 酶的生产目前多数直接从生物体中提取分离。非酶的生产目前多数直接从生物体中提取分离。非常少的是合成，基因工程。常少的是合成，基因工程。早期酶的生产：以动植物为主要原料，如早期酶的生产：以动植物为主要原料，如激肽释放激肽释放酶酶

7、（胰脏）（胰脏）、菠萝蛋白酶菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶。近近1010年来，研究发展了动植物组织培养技术，但周年来，研究发展了动植物组织培养技术，但周期长、成本高。期长、成本高。工业生产一般都以微生物为主要来源。工业生产一般都以微生物为主要来源。第11页/共87页12微生物生产酶的特点微生物生产酶的特点1.1.微生物微生物种类繁多种类繁多，凡是动植物体内存在的酶，几乎，凡是动植物体内存在的酶，几乎都年从微生物中得到；都年从微生物中得到；2.2.微生物微生物繁殖快繁殖快、生、生产周期短产周期短、培养简便培养简便，并可通过，并可通过控制培养条件来提高酶的产量；控制培养条件来提高酶的产量；3.3

8、.微生物具有微生物具有较强的适应性较强的适应性，通过各种，通过各种遗传变异遗传变异的手的手段，能培育出新的高产菌株。段，能培育出新的高产菌株。第12页/共87页13（二）酶的生产菌（二）酶的生产菌1 1、对菌种的要求：、对菌种的要求：（1 1）产酶量高、酶的性质符合要求、最好是胞外酶；）产酶量高、酶的性质符合要求、最好是胞外酶；（2 2）不是致病菌；）不是致病菌；（3 3）稳定，不易产生变异退化，不易感染噬菌体；）稳定，不易产生变异退化，不易感染噬菌体；（4 4）能利用廉价的原料，发酵周期短，易于培养。）能利用廉价的原料，发酵周期短，易于培养。第13页/共87页142、生产菌的来源：1）菌种保

9、藏机构和有关研究部门，但大量的工作应是从自然界中分离筛选菌样采集、菌种分离初筛、纯化、复筛和生产性能鉴定等。2）改良（如基因突变、基因转移和基因克隆）。第14页/共87页153 3、目前常用的产酶微生物、目前常用的产酶微生物E.coliE.coli：是应用最广泛的产酶菌。是应用最广泛的产酶菌。分泌胞内酶，经细胞破碎分离得到。分泌胞内酶，经细胞破碎分离得到。在工业上用于生产谷氨酸脱羧酶、天门冬氨酸酶、在工业上用于生产谷氨酸脱羧酶、天门冬氨酸酶、青霉素酰化酶、青霉素酰化酶、-半乳糖苷酶半乳糖苷酶枯草杆菌：枯草杆菌：主要用于生产主要用于生产-淀粉酶、淀粉酶、-葡萄糖氧葡萄糖氧化酶、碱性磷酸脂酶。化酶

10、、碱性磷酸脂酶。第15页/共87页16啤酒酵母：啤酒酵母：用于酿造啤酒、酒精、饮料、面包等；用于酿造啤酒、酒精、饮料、面包等；曲酶（黑曲酶和黄曲酶）：曲酶（黑曲酶和黄曲酶）：主要生产糖化酶、蛋白主要生产糖化酶、蛋白酶、淀粉酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、氨基酰化酶酶、淀粉酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、氨基酰化酶和脂肪酶。和脂肪酶。其他产酶菌：其他产酶菌：青霉菌、木霉菌、根霉菌、链霉菌等。青霉菌、木霉菌、根霉菌、链霉菌等。第16页/共87页17五、酶在医药领域的应用五、酶在医药领域的应用1.1.在疾病诊断方面的应用在疾病诊断方面的应用由于酶具有专一性强、催化效率高、作用条件由于酶具有专一性强、催化效率高、

11、作用条件温和等催化特点，酶学诊断已经发展成为可靠、温和等催化特点，酶学诊断已经发展成为可靠、简便又快捷的诊断方法，具有广阔的应用前景。简便又快捷的诊断方法，具有广阔的应用前景。酶学诊断方法：酶学诊断方法：1 1）是根据体内）是根据体内原有酶活力的变化原有酶活力的变化来诊断某些疾病，来诊断某些疾病，2 2）利用酶来测定体内某些物质的含量利用酶来测定体内某些物质的含量，从而诊断某些疾病。，从而诊断某些疾病。第17页/共87页18根据体内酶活力的变化诊断疾病根据体内酶活力的变化诊断疾病:一般健康人体内所含有的某些酶的量是恒定在一般健康人体内所含有的某些酶的量是恒定在某一范围的。某一范围的。当人们患上

12、某些疾病时，则由于组织、细胞受当人们患上某些疾病时，则由于组织、细胞受到损伤或者代谢异常而引起体内的某种或某些到损伤或者代谢异常而引起体内的某种或某些酶的活力发生相应的变化。酶的活力发生相应的变化。故此，可以根据体内某些酶的活力变化情况，故此，可以根据体内某些酶的活力变化情况，而诊断出某些疾病。而诊断出某些疾病。胰腺癌：胰蛋白酶、胰型同工酶等升高肝炎：转氨酶升高 第18页/共87页19用酶测定用酶测定体液中体液中某些物质的变化诊断疾病：某些物质的变化诊断疾病：人体在出现某些疾病时，由于代谢异常或者某人体在出现某些疾病时，由于代谢异常或者某些组织器官受到损伤，就会引起体内某些物质些组织器官受到损

13、伤，就会引起体内某些物质的量或者存在部位发生变化。的量或者存在部位发生变化。通过测定体液中某些物质的变化，可以快速、通过测定体液中某些物质的变化，可以快速、准确地对疾病进行诊断。准确地对疾病进行诊断。酶具有专一性强、催化效率高等特点，可以利酶具有专一性强、催化效率高等特点，可以利用酶来测定体液中某些物质的含量变化，从而用酶来测定体液中某些物质的含量变化，从而诊断某些疾病。诊断某些疾病。第19页/共87页202.2.在疾病治疗方面的应用在疾病治疗方面的应用-酶类制剂酶类制剂 酶可以作为药物治疗多种疾病，用于治疗疾酶可以作为药物治疗多种疾病，用于治疗疾病的酶称为病的酶称为药用酶药用酶。药用酶具有疗

14、效显著，副作用小的特点，在疾病的治疗方面的应用越来越广泛。溶菌酶：抗菌消炎和镇痛第20页/共87页211 1）消化类：）消化类：研究最早，是品种最多的一类酶研究最早，是品种最多的一类酶.在这一类酶中主要有胃蛋白酶、在这一类酶中主要有胃蛋白酶、胰酶、淀粉酶、纤维素酶、木瓜胰酶、淀粉酶、纤维素酶、木瓜酶、凝乳酶、无花果酶、菠萝酶酶、凝乳酶、无花果酶、菠萝酶等等。健美生消化酶帮助肠胃蠕动第21页/共87页222 2）抗炎净创类）抗炎净创类：目前在治疗上发展最快，用途最广的一种。目前在治疗上发展最快，用途最广的一种。多数是蛋白质水解酶，分解发炎部位纤维蛋白的多数是蛋白质水解酶，分解发炎部位纤维蛋白的凝

15、结物，消除伤口周围的坏疽、腐肉和碎屑。凝结物，消除伤口周围的坏疽、腐肉和碎屑。其中有些酶能够分解脓液中的核蛋白使成简单的其中有些酶能够分解脓液中的核蛋白使成简单的嘌呤和嘧啶，降低脓液的粘性、达到净洁创口、嘌呤和嘧啶，降低脓液的粘性、达到净洁创口、消除痴皮、排除脓液抗炎消肿的目的。消除痴皮、排除脓液抗炎消肿的目的。主要有胰蛋白酶、糜蛋白酶、双链酶，主要有胰蛋白酶、糜蛋白酶、双链酶，-淀粉淀粉酶、胰脱氧核糖核酸酶等酶、胰脱氧核糖核酸酶等。第22页/共87页233）血凝和解凝类：都是从血液中提取出来的。凝血酶的作用：促使血中纤维蛋白原变成不溶性纤维蛋白,从而促使血液凝固，防止微血管出血。例如：蛇毒抗

16、凝酶、促凝血酶原激酶。纤维蛋白溶解酶的作用：是溶解血块，为目前临床上最新的一种酶制品,治疗血栓静脉炎、冠状动脉栓塞等。例如:东菱克栓酶抑肽酶作为肽酶抑制剂：广泛应用于体外循环手术，大剂量抑肽酶可明显减少心脏外科手术后的渗血，消除因心脏外科手术后渗血而导致的死亡。第23页/共87页244 4）解毒类：）解毒类：主要作用是解除体内或因注射某种药物产生的主要作用是解除体内或因注射某种药物产生的一种有害物质。一种有害物质。主要品种有主要品种有青霉素酶青霉素酶、过氧化氢酶过氧化氢酶和和组织胺酶组织胺酶等。等。青霉素酶能够分解青霉素分子（青霉噻唑）中青霉素酶能够分解青霉素分子（青霉噻唑）中的的一内酰胺环，

17、使变成青霉素铜酸，消除因一内酰胺环，使变成青霉素铜酸，消除因注射青霉素引起的过敏反应注射青霉素引起的过敏反应。第24页/共87页255 5）抗肿瘤的药用酶：）抗肿瘤的药用酶：L-L-天冬氨酸酶是第一种用于治疗白血病的酶；天冬氨酸酶是第一种用于治疗白血病的酶；癌细胞缺乏天冬氨酸合成酶，自身生长时不能癌细胞缺乏天冬氨酸合成酶，自身生长时不能合成天冬氨酸，合成天冬氨酸，L-L-天冬氨酸酶可以切断外来天冬氨酸酶可以切断外来的天冬氨酸供给。的天冬氨酸供给。第25页/共87页263.3.在药物生产方面的应用在药物生产方面的应用利用酶的催化作用将前体物质转变为药物。这方利用酶的催化作用将前体物质转变为药物。

18、这方面的应用日益增多。面的应用日益增多。现已有不少药物包括一些贵重药物都是由酶法生现已有不少药物包括一些贵重药物都是由酶法生产的产的。4.4.在分析检测方面的应用在分析检测方面的应用酶法检测或酶法分析酶法检测或酶法分析如：如：ELISA,ELISA,免疫组织化学，免疫组织化学，Western blotWestern blot中的中的HRPHRP第26页/共87页271 1、细胞破碎、细胞破碎2 2、酶的提取、酶的提取3 3、酶的分离方法、酶的分离方法4 4、酶的组合分离纯化策略、酶的组合分离纯化策略5 5、酶的浓缩、干燥与结晶、酶的浓缩、干燥与结晶第二节第二节 酶的分离纯化酶的分离纯化第27页

19、/共87页一、酶的分离纯化技术路线细胞破碎酶提取酶分离纯化酶浓缩酶贮存动物、植物或微生物细胞发酵液离心分离，过滤分离，沉淀分离，层析分离，电泳分离，萃取分离，结晶分离等。第28页/共87页29二、酶的提取二、酶的提取（一）（一）细胞破碎细胞破碎许多酶存在于细胞内。许多酶存在于细胞内。为了提取这些胞内酶，为了提取这些胞内酶，首先需要对细胞进行破首先需要对细胞进行破碎处理。碎处理。1 1）机械破碎）机械破碎2 2）物理破碎）物理破碎3 3）化学破碎）化学破碎4 4）酶解破碎）酶解破碎JY92-II D超声波超声波细胞粉碎机胞粉碎机细胞胞破破碎碎珠珠高高压细胞胞破破碎碎机机DY89-I型型 电动玻璃

20、匀玻璃匀浆机机第29页/共87页301.1.采用缓冲体系：防采用缓冲体系：防PHPH大幅度变化而失活大幅度变化而失活2.2.添加保护剂：防活性基团活性中心受影响添加保护剂：防活性基团活性中心受影响3.3.抑制水解酶的作用：加酶抑制剂抑制水解酶的作用：加酶抑制剂4.4.其他保护措施：温度，其他保护措施：温度，PHPH，搅拌，光照，氧化，搅拌，光照，氧化等影响等影响为了保护目的酶的生物活性，常采取下列保护措施：第30页/共87页31（二）酶的（二）酶的抽提抽提提取方法提取方法使用的溶剂或溶液使用的溶剂或溶液提取对象提取对象盐溶液提盐溶液提取取0.020.020.5M0.5M的盐溶的盐溶液液用于提取

21、在低浓度盐溶液用于提取在低浓度盐溶液中溶解度较大的酶中溶解度较大的酶酸溶液提酸溶液提取取PH2PH26 6的水溶液的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且稳定性较好的解度大，且稳定性较好的酶酶碱溶液提碱溶液提取取PH8PH81212的水溶液的水溶液用于提取在稀碱溶液中溶用于提取在稀碱溶液中溶解度大且稳定性较好的酶解度大且稳定性较好的酶有机溶剂有机溶剂提取提取可与水混溶的有机可与水混溶的有机溶剂溶剂用于提取那些与脂质结合用于提取那些与脂质结合牢固或含有较多非极性基牢固或含有较多非极性基团的酶团的酶将酶从生物组织或细胞破碎液以溶解状态最大限度释放出来的过程。第31页/共87页

22、32(三）沉淀分离三）沉淀分离沉淀分离方法沉淀分离方法分离原理分离原理 盐析沉淀法盐析沉淀法不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同，不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同，在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀从溶液中析出沉淀等电点沉淀法等电点沉淀法两性电解质在等电点时溶解度最低，不同的两两性电解质在等电点时溶解度最低，不同的两性电解质有不同的等电点，通过调节溶液的性电解质有不同的等电点，通过调节溶液的pHpH值，使酶或杂质沉淀析出值，使酶或杂质沉淀析出有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀法法酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解度不同，添酶与其它杂质

23、在有机溶剂中的溶解度不同，添加一定量的某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析加一定量的某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出出复合沉淀法复合沉淀法在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来而沉淀下来选择性变性选择性变性沉淀法沉淀法选择一定的条件使酶液中存在的某些杂质变性选择一定的条件使酶液中存在的某些杂质变性沉淀，而不影响所需的酶沉淀，而不影响所需的酶粗提物：经细胞破碎和抽提后，得到的含目的酶的无细胞抽提物。第32页/共87页33（四）、酶的纯化（四）、酶的纯化过滤与膜分离过滤与膜分离电泳电泳离子交换层析离子交换层析第33页/共87页34第三节第三节 酶和细胞

24、的固定化酶和细胞的固定化一、固定化酶的制备一、固定化酶的制备1 1、固定化酶的定义、固定化酶的定义:指限制或固定于特定空间指限制或固定于特定空间位置的酶。具体讲是指经物理或化学方法处理，位置的酶。具体讲是指经物理或化学方法处理，使酶变成不易随水流失即运动受到限制，而又使酶变成不易随水流失即运动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂。制备固定化酶的过能发挥催化作用的酶制剂。制备固定化酶的过程称为程称为酶的固定化。酶的固定化。固定化所采用的酶，可以是纯化的酶，也可以固定化所采用的酶，可以是纯化的酶，也可以是结合在菌体（死细胞）或细胞碎片上的酶或是结合在菌体（死细胞）或细胞碎片上的酶或酶系。酶系。第3

25、4页/共87页35 2、固定化酶的特点、固定化酶的特点（1 1）可以多次使用，酶的稳定性提高；）可以多次使用，酶的稳定性提高；（2 2）反应后，酶与底物和产物易于分开，产物）反应后，酶与底物和产物易于分开，产物中无残留酶，易于纯化。中无残留酶，易于纯化。（3 3）反应条件易于控制，可实现转化反应的连）反应条件易于控制，可实现转化反应的连续化和自动控制；续化和自动控制；（4 4）酶的利用率高，单位酶催化的底物量增加，）酶的利用率高，单位酶催化的底物量增加，用酶量少；用酶量少；（5 5）比水溶性酶更适合于多酶反应。）比水溶性酶更适合于多酶反应。第35页/共87页酶和细胞的固定化方法酶和细胞的固定化

26、方法热处理热处理（细胞）（细胞）物理吸物理吸附法附法共价结共价结合法合法离子结离子结合法合法载体结载体结合法合法交联交联法法包埋包埋法法网格型网格型微囊型微囊型3.酶的固定化方法与技术第36页/共87页37第37页/共87页38（1 1）载体结合法）载体结合法：将酶结合于不溶性载体上的将酶结合于不溶性载体上的固定化方法。固定化方法。A.A.物理吸附法：物理吸附法：用物理方法将酶吸附于不溶性载用物理方法将酶吸附于不溶性载体上的固定化方法。活性碳体上的固定化方法。活性碳,多孔玻璃多孔玻璃,树脂等树脂等优点优点：操作简单，可选用不同电荷和不同形状的操作简单，可选用不同电荷和不同形状的载体，有可能固定

27、化和纯化过程同时实现，酶载体，有可能固定化和纯化过程同时实现，酶失活后载体仍可再用。失活后载体仍可再用。缺点：缺点：最适吸附酶量无规律可循，吸附量与酶活最适吸附酶量无规律可循，吸附量与酶活力不一定呈平行关系，酶与载体结合力不强，力不一定呈平行关系，酶与载体结合力不强，酶易于脱落，导致酶活下降并污染产物。酶易于脱落，导致酶活下降并污染产物。第38页/共87页39 B B、离子结合法：、离子结合法：酶通过离子键酶通过离子键结合于具有离子交换基的水不结合于具有离子交换基的水不溶性载体上。溶性载体上。DEAE-纤维素等纤维素等优点：优点：操作简单，处理条件温和，操作简单，处理条件温和，酶的高级结构和活

28、性中心的氨酶的高级结构和活性中心的氨基酸残基不易被破坏。基酸残基不易被破坏。缺点：缺点：载体和酶的结合力弱，易载体和酶的结合力弱，易受缓冲液种类或受缓冲液种类或pH的影响，离的影响，离子强度高时，酶易脱落。子强度高时，酶易脱落。第39页/共87页40C、共价结合法：、共价结合法：酶以共酶以共价键结合于载体上。即将价键结合于载体上。即将酶分子上非活性部位功能酶分子上非活性部位功能团与载体表面反应基团进团与载体表面反应基团进行共价结合的方法。行共价结合的方法。优点：优点：酶与载体结合牢酶与载体结合牢固，稳定性好，不易脱落固，稳定性好，不易脱落。缺点：缺点：反应条件苛刻，反应条件苛刻，操作复杂，反应

29、条件剧烈，操作复杂，反应条件剧烈，酶易失活和产生空间位阻酶易失活和产生空间位阻效应。效应。第40页/共87页41（2）交联法）交联法：用双功能或多用双功能或多功能试剂使酶与酶或细胞与功能试剂使酶与酶或细胞与细胞之间交联的方法。细胞之间交联的方法。交联法交联法交联酶法交联酶法酶与辅助蛋白交联法酶与辅助蛋白交联法吸附交联法吸附交联法载体交联法载体交联法常用的交联剂：戊二醛、双常用的交联剂：戊二醛、双重氮联苯胺重氮联苯胺-2-2、2-2-二磺酸、二磺酸、1,5-1,5-二氟二氟-2,4-2,4-二硝基苯。二硝基苯。第41页/共87页42酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联酶分子之间共价交联和与

30、水不溶性载体共价偶联酶分子；酶分子；（a a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性的固定化酶；溶性的固定化酶；（b b）酶分子被偶联到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶）酶分子被偶联到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶第42页/共87页43（3）包埋法：）包埋法：A、网格型：、网格型：将酶或细胞包埋将酶或细胞包埋在高分子凝胶细微网格中。在高分子凝胶细微网格中。常用合成高分子化合物有聚丙常用合成高分子化合物有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、光敏树脂。烯酰胺、聚乙烯醇、光敏树脂。天然高分子化合物有淀粉、明天然高分子化合物有淀粉、明胶、

31、胶原、海藻胶、角叉菜胶，胶、胶原、海藻胶、角叉菜胶，多用于固定化细胞。多用于固定化细胞。第43页/共87页44B、微囊型、微囊型：将酶或细胞将酶或细胞包埋在高分子半透膜中。包埋在高分子半透膜中。通常为直径几微米到几百微通常为直径几微米到几百微米的球状体。米的球状体。颗粒比网格型要小得多，比颗粒比网格型要小得多，比较有利于底物与产物的扩散，较有利于底物与产物的扩散，但反应条件要求高，制备成但反应条件要求高，制备成本也高。本也高。第44页/共87页45第45页/共87页46新型的酶固定化方法新型的酶固定化方法温和的条件温和的条件下进行，减少酶活力损失，提下进行，减少酶活力损失，提高固定化效率高固定

32、化效率光偶联法：光偶联法：光敏性单体聚合物包埋固定化光敏性单体聚合物包埋固定化酶或带光敏性基团的载体共价固定化酶酶或带光敏性基团的载体共价固定化酶无载体固定化酶：无载体固定化酶：直接用交联剂交联直接用交联剂交联用交联剂交联溶解酶、晶体酶、物理聚集用交联剂交联溶解酶、晶体酶、物理聚集酶、酶、和喷雾干燥酶等四种无载体酶体系，和喷雾干燥酶等四种无载体酶体系，。第46页/共87页47无载体固定化酶无载体固定化酶优点如下：优点如下：1.催化活性高，成本低催化活性高，成本低2.具备较高的催化剂比表面具备较高的催化剂比表面3.可加入多种酶可加入多种酶4.底物扩散受限制少底物扩散受限制少5.极端条件下稳定性高

33、极端条件下稳定性高第47页/共87页二、二、固定化细胞的制备固定化细胞的制备1 1、固定化细胞：、固定化细胞：将细胞限制或定位于特定空间将细胞限制或定位于特定空间位置的方法称为细胞固定化技术。被限制或定位置的方法称为细胞固定化技术。被限制或定位于特定空间位置的细胞称为固定化细胞，它位于特定空间位置的细胞称为固定化细胞，它与固定化酶同被称为固定化生物催化剂。与固定化酶同被称为固定化生物催化剂。固定化细胞主要利用细胞内酶及酶系固定化细胞主要利用细胞内酶及酶系比固定化酶更普遍。比固定化酶更普遍。如今该技术已扩展至动植物细胞，甚至线粒体、如今该技术已扩展至动植物细胞，甚至线粒体、叶绿体及微粒体等细胞器

34、的固定化。叶绿体及微粒体等细胞器的固定化。第48页/共87页2 2、固定化细胞的特点、固定化细胞的特点为什么要固定化？为什么要固定化？E E颗粒小、难于截流或定颗粒小、难于截流或定位，而固定化细胞不仅兼具细胞特性、生物催位，而固定化细胞不仅兼具细胞特性、生物催化功能及固相催化剂特点。化功能及固相催化剂特点。特点：特点：无需进行酶的分离纯化；无需进行酶的分离纯化；细胞保持酶的原始状态，故酶活回收率高；细胞保持酶的原始状态，故酶活回收率高；细胞内酶比固定化酶稳定性更高；细胞内酶比固定化酶稳定性更高；细胞内酶的辅因子可以自动再生；细胞内酶的辅因子可以自动再生；细胞本身含多酶体系，可催化一系列反应；细

35、胞本身含多酶体系，可催化一系列反应；抗污染能力强。抗污染能力强。第49页/共87页3 3、固定化细胞的制备技术、固定化细胞的制备技术固定化酶主要适用于细胞内酶，固定化酶主要适用于细胞内酶，底物和产物易底物和产物易于透过细胞膜，于透过细胞膜，细胞内不存在产物分解系统及细胞内不存在产物分解系统及其它副反应。其它副反应。固定化细胞技术主要有载体结合法、包埋法、固定化细胞技术主要有载体结合法、包埋法、交联法及无载体法。这些技术与前面提到的相交联法及无载体法。这些技术与前面提到的相关固定化酶的技术类似关固定化酶的技术类似。第50页/共87页51三、固定化方法的选择依据三、固定化方法的选择依据1.1.固定

36、化方法的选择固定化方法的选择（1 1）固定化酶应用的安全性固定化酶应用的安全性：要按照药物和食品领域的检：要按照药物和食品领域的检验标准作必要的检查。所用试剂是否有毒性和残留。尽可验标准作必要的检查。所用试剂是否有毒性和残留。尽可能选择无毒性试剂。能选择无毒性试剂。（2 2）固定化酶在操作中的稳定性固定化酶在操作中的稳定性：在选择固定化方法时要：在选择固定化方法时要求固定化酶在操作过程中十分稳定，能长期反复使用，在求固定化酶在操作过程中十分稳定，能长期反复使用，在经济上有极强的竞争力。经济上有极强的竞争力。（3 3）固定化的成本固定化的成本：包括酶、载体、试剂的费用，也包括：包括酶、载体、试剂

37、的费用，也包括水、电、气、设水、电、气、设 备和劳务投资等备和劳务投资等。第51页/共87页522 2、载体的选择、载体的选择一般是为了工业化生产，因此性能好、价格便宜是一项一般是为了工业化生产，因此性能好、价格便宜是一项重要的指标。如聚乙烯醇、卡拉胶、海藻胶等。离子交重要的指标。如聚乙烯醇、卡拉胶、海藻胶等。离子交换树脂、金属氧化物及不锈钢碎屑等都是有应用前途的换树脂、金属氧化物及不锈钢碎屑等都是有应用前途的载体。载体。载体的选择要考虑底物的性质，如当底物为大分子时，载体的选择要考虑底物的性质，如当底物为大分子时，只能用可溶性固定化酶，不能用包埋型；只能用可溶性固定化酶，不能用包埋型；若底物

38、不完全溶解或黏度大，宜采用密度高的不锈钢屑若底物不完全溶解或黏度大，宜采用密度高的不锈钢屑或陶瓷材料制备固定化酶，以便实现转化反应和回收固或陶瓷材料制备固定化酶，以便实现转化反应和回收固定化酶。定化酶。3.常用的固定化酶载体材料（自学）第52页/共87页四、固定化酶（细胞）的性状和性质四、固定化酶（细胞）的性状和性质1 1、固定化酶的形状、固定化酶的形状（1 1）颗粒状：）颗粒状：包括酶珠、酶块、酶片、酶粉。每种固定化包括酶珠、酶块、酶片、酶粉。每种固定化方法均可制备颗粒状，方法简单，比表面积大，转化效率方法均可制备颗粒状，方法简单，比表面积大，转化效率高，适用各种反应器。如酵母酶珠。高，适用

39、各种反应器。如酵母酶珠。（2 2）纤维状：）纤维状：三醋酸纤维素用适当的溶剂溶解后与酶混合，三醋酸纤维素用适当的溶剂溶解后与酶混合，再用喷丝的方法就可制成酶纤维。比表面积大，转化效率再用喷丝的方法就可制成酶纤维。比表面积大，转化效率高，但只适用于填充床反应器。此外，纤维酶可以织成酶高，但只适用于填充床反应器。此外，纤维酶可以织成酶布用于填充床反应器。布用于填充床反应器。第53页/共87页54（3 3）膜状固定化酶：）膜状固定化酶：可通过共价结合的方法将酶偶可通过共价结合的方法将酶偶联在滤膜上。也可用其他方法制膜酶。酶膜比表面积大，联在滤膜上。也可用其他方法制膜酶。酶膜比表面积大，渗透阻力小，可

40、用于酶电极，破碎后也可用于填充床。渗透阻力小，可用于酶电极，破碎后也可用于填充床。目前已有木瓜酶、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、脲酶等目前已有木瓜酶、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、脲酶等酶膜酶膜。（4 4）管状固定化酶：）管状固定化酶：又称酶管，利用管状载体如尼又称酶管，利用管状载体如尼龙、聚氯苯乙烯和聚丙烯酰胺，经活化后与酶偶联得酶龙、聚氯苯乙烯和聚丙烯酰胺，经活化后与酶偶联得酶管。酶管的机械强度大，切断后可用于填充床反应器，管。酶管的机械强度大，切断后可用于填充床反应器，也可组装成列管式反应器。目前已制备出糖化酶、转化也可组装成列管式反应器。目前已制备出糖化酶、转化酶、脲酶酶、脲酶 等酶管。等酶管

41、。第54页/共87页2、固定化酶的性质 （1）酶活力的变化：酶经过固定化之后活力大都下降。其原因主要是酶活性中心的重要氨基酸与载体发生结合，酶的空间结构发生变化或酶与底物结合时存在空间位阻效应。包埋法中还有底物与产物扩散阻力增大。（2）酶稳定性的变化：包括对温度、pH、蛋白酶变性剂和抑制剂的耐受程度。固定化后，稳定性提高，有效寿命延长。其原因是限制了酶分子之间的相互作用，阻止了其自溶，增加了酶构型的牢固程度。操作稳定性；贮藏稳定性；对蛋白酶的稳定性。第55页/共87页（3）酶学特性的变化 A、底物专一性：对底物的专一性下降。B、最适pH：最适pH可能变大，也可能变小；pH-酶活曲线可能发生变化

42、，其变化与酶蛋白和载体的带电性质有关。C、最适温度：一般升高。原因是固定化后空间结构更为稳定。D、最大反应速度（Vm）：变化很小或不变。第56页/共87页57五、评价固定化酶（细胞）的指标五、评价固定化酶（细胞）的指标1.1.固定化酶活力测定固定化酶活力测定活力回收率活力回收率=固定化酶总活力固定化酶总活力/加入酶的总活力加入酶的总活力相对活力固定化酶总活力相对活力固定化酶总活力/（加入酶的总活力上清（加入酶的总活力上清液中未偶联的酶活力）液中未偶联的酶活力）2.2.偶联率及相对活力的测定偶联率及相对活力的测定第57页/共87页第四节第四节 固定化酶和固定化细胞的反应固定化酶和固定化细胞的反应

43、器器用于酶进行催化反应的容器及其附属设备称为酶反应器。酶催化反应过程示意图过程调控过程调控生物反应器生物反应器 消消毒毒原料原料预处理预处理 产物分产物分离提纯离提纯 产产品品生物催化生物催化剂制备剂制备空气空气除菌除菌能量能量热量热量第58页/共87页59常见的酶反应器类型（了解）l按结构区分搅拌罐式反应器（Stirred Tank Reactor,STR）鼓泡式反应器(bubble column reactor,BCR)填充床式反应器(packed column reactor,PCR)流化床式反应器(Fluidized Bed Reactor,FBR)膜反应器(Membrane Reac

44、tor,MR)l按操作方式区分分批式反应(batch)连续式反应(continuous)流加分批式反应(feeding batch)l混合形式连续搅拌罐反应器（Continuous Stirred Tank Reactor,CSTR）分批搅拌罐反应器（Batch Stirred Tank Reactor,BSTR）第59页/共87页60一、反应器的类型和特点一、反应器的类型和特点1.间歇式搅拌罐反应器间歇式搅拌罐反应器用于游离酶反应后随即放料。用于游离酶反应后随即放料。又称为批量反应器。又称为批量反应器。特点特点：底物与酶一次性投入反应器底物与酶一次性投入反应器内，产物一次性取出；反应完成之后

45、，内，产物一次性取出；反应完成之后，固定化酶（细胞）用过滤法或超滤法回固定化酶（细胞）用过滤法或超滤法回收，再转入下一批反应。收，再转入下一批反应。第60页/共87页优点优点：装置较简单，造价较低：装置较简单，造价较低缺点缺点：固定化酶经反复回收使用时，易失去活：固定化酶经反复回收使用时，易失去活性，故在工业生产中，间歇式酶反应器很少用性，故在工业生产中，间歇式酶反应器很少用于固定化酶，但常用于游离酶于固定化酶，但常用于游离酶。第61页/共87页62 连续流动搅拌罐反应器连续流动搅拌罐反应器连续进料、连续出料连续进料、连续出料连续搅拌釜式反应器连续搅拌釜式反应器。向反应器。向反应器投入固定化酶

46、和底物溶液，不断投入固定化酶和底物溶液，不断搅拌，反应达到平衡之后，再以搅拌，反应达到平衡之后，再以恒定的流速连续流入底物溶液，恒定的流速连续流入底物溶液，同时，以相同流速输出反应液同时，以相同流速输出反应液（含产物）。（含产物）。底物溶液进口底物溶液进口 反应液出口反应液出口 第62页/共87页优点优点：混合良好，各部分组成相同，并与输出成分一致。：混合良好，各部分组成相同，并与输出成分一致。缺点缺点：搅拌浆剪切力大，易打碎磨损固定化酶颗粒。：搅拌浆剪切力大，易打碎磨损固定化酶颗粒。第63页/共87页3.鼓泡式反应器用于游离酶和固定化酶的催化反应。在使用鼓泡式反应器进行固定化酶的催化反应时，

47、反应系统中存在固、液、气三相，又称为三相流化床式反应器。鼓泡式反应器的结构简单，操作容易,剪切力小，物质与热量的传递效率高，是有气体参与的酶催化反应中常用的一种反应器。例如氧化酶催化反应需要供给氧气，羧化酶的催化反应需要供给二氧化碳等。第64页/共87页4.4.喷射式反应器喷射式反应器利用高压蒸汽的喷射作用，实现酶与底物的混利用高压蒸汽的喷射作用，实现酶与底物的混合，进行高温短时催化的反应器合，进行高温短时催化的反应器喷射罐和维持罐组成喷射罐和维持罐组成一般用于耐高温酶的催化一般用于耐高温酶的催化第65页/共87页5.膜反应器膜反应器是将酶催化反应与半透膜的分离作用组合在一起而成的反应器。可以

48、用于游离酶的催化反应，也可以用于固定化酶的催化反应。用于固定化酶催化反应的膜反应器是将酶固定在具有一定孔径的多孔薄膜中，而制成的一种生物反应器。膜反应器可以制成平板型、螺旋型、管型、中空纤维型、转盘型等多种形状。常用的是中空纤维反应器。第66页/共87页67第67页/共87页6.填充床反应器固定化酶添充于床层内。反应器内的流体的流动形态为平推流形。底物以恒定流速通过反应床.第68页/共87页69优点：优点：高效率、易操作、结构简单等，是高效率、易操作、结构简单等，是目前工业生目前工业生产及研究中应用最为普遍的反应器产及研究中应用最为普遍的反应器。它适用于各种形状。它适用于各种形状的固定化酶和不

49、含固体颗粒、黏度不大的底物溶液，以的固定化酶和不含固体颗粒、黏度不大的底物溶液，以及有产物抑制的转化反应。及有产物抑制的转化反应。缺点：缺点：传质系数和传热系数相对较低。当底物溶度含传质系数和传热系数相对较低。当底物溶度含固体颗粒或黏度很大时，不宜采用填充床反应器固体颗粒或黏度很大时，不宜采用填充床反应器第69页/共87页特点：底物溶液以足够大的流速，从反应器底部向上通过固定化酶柱床时，便能使固定化酶颗粒始终处于流化状态,达到混合的目的。7.流化床反应器第70页/共87页71各种反应器的示意图各种反应器的示意图第71页/共87页72各种酶反应器的特点反应器类型反应器类型适用的操作方式适用的操作

50、方式适用的酶适用的酶特点特点搅拌罐式反应器搅拌罐式反应器分批式分批式,流加分批式流加分批式连续式连续式,游离酶游离酶固定化酶固定化酶反应比较完全，反应反应比较完全，反应条件容易调节控制。条件容易调节控制。填充床式反应器填充床式反应器连续式连续式固定化酶固定化酶密度大，可以提高酶密度大，可以提高酶催化反应的速度。在催化反应的速度。在工业生产中普遍使用。工业生产中普遍使用。流化床反应器流化床反应器分批式分批式流加分批式流加分批式连续式连续式固定化酶固定化酶流化床反应器具有混流化床反应器具有混合均匀，传质和传热合均匀，传质和传热效果好，温度和效果好，温度和pHpH值值的调节控制比较容易，的调节控制比