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1、08 08 酶工程制药酶工程制药S1 S1 酶工程制药概述酶工程制药概述S2 S2 固定化酶与固定化细胞固定化酶与固定化细胞S3 S3 酶的化学修饰酶的化学修饰S4 S4 酶工程研究的进展酶工程研究的进展S1 S1 酶工程制药概述酶工程制药概述酶工程的概念酶工程的概念酶工程（酶工程（enzyme engineeringenzyme engineering）是是酶学酶学和和工工程学程学相互渗透发展而成的一门新的技术科相互渗透发展而成的一门新的技术科学，它是从应用的目的出发研究酶、应用学，它是从应用的目的出发研究酶、应用酶的特异性催化功能，并通过工程化将相酶的特异性催化功能，并通过工程化将相应原料
2、转化成有用物质的技术。应原料转化成有用物质的技术。S1 S1 酶工程制药概述酶工程制药概述酶工程的研究内容酶工程的研究内容（1 1）酶的分离、提纯、大批量生产及应用开发）酶的分离、提纯、大批量生产及应用开发（2 2）酶和细胞的固定化酶和细胞的固定化及酶传感器的研究及酶传感器的研究（3 3）基因工程酶、遗传修饰酶（突变酶）基因工程酶、遗传修饰酶（突变酶）（4 4）酶的分子改造与）酶的分子改造与化学修饰化学修饰、酶的结构与功能关系、酶的结构与功能关系（5 5）有机相中的酶反应有机相中的酶反应的研究的研究（6 6）酶的抑制剂、激活剂的开发及应用）酶的抑制剂、激活剂的开发及应用（7 7）抗体酶、核酶、
3、脱氧核酶抗体酶、核酶、脱氧核酶的研究的研究（8 8）模拟酶模拟酶、合成酶、酶分子的人工设计、合成、合成酶、酶分子的人工设计、合成S1 S1 酶工程制药概述酶工程制药概述酶在医药领域的应用酶在医药领域的应用n在疾病诊断方面的应用在疾病诊断方面的应用（1 1）根据体内原由酶活力的变化来诊断某些疾病）根据体内原由酶活力的变化来诊断某些疾病（如利用谷（如利用谷丙转氨酶活力升高来诊断肝炎）丙转氨酶活力升高来诊断肝炎）（2 2）用酶测定体液中某些物质的量诊断疾病）用酶测定体液中某些物质的量诊断疾病（如利用葡萄糖（如利用葡萄糖氧化酶测定血糖含量来诊断糖尿病）氧化酶测定血糖含量来诊断糖尿病）n在疾病治疗方面的
4、应用在疾病治疗方面的应用药用酶的生产药用酶的生产n在药物生产方面的应用在药物生产方面的应用酶法制药酶法制药n在分析检测方面的应用在分析检测方面的应用S1 S1 酶工程制药概述酶工程制药概述酶法制药：酶法制药：是指利用酶的催化作用而制造出是指利用酶的催化作用而制造出具有药用功效的物质的技术过程。具有药用功效的物质的技术过程。主要技术包括主要技术包括:酶的催化反应酶的催化反应 酶的固定化酶的固定化 酶的非水相催化酶的非水相催化酶法制药酶法制药药用酶的生产药用酶的生产S1 S1 酶工程制药概述酶工程制药概述青霉素酰化酶：青霉素酰化酶：制造半合成青霉素和头孢霉素制造半合成青霉素和头孢霉素11-11-羟
5、化酶：羟化酶：制造氢化可的松制造氢化可的松L-L-酪氨酸转氨酶：酪氨酸转氨酶：制造多巴制造多巴-酪氨酸酶：酪氨酸酶：制造多巴制造多巴核糖核酸酶：核糖核酸酶：生产核苷酸类物质生产核苷酸类物质蛋白酶和羧肽酶：蛋白酶和羧肽酶：将猪胰岛素转化为人胰岛素将猪胰岛素转化为人胰岛素酶法制药：酶法制药：是指利用酶的催化作用而制造出是指利用酶的催化作用而制造出具有药用功效的物质的技术过程。具有药用功效的物质的技术过程。酶法制药酶法制药药用酶的生产药用酶的生产S1 S1 酶工程制药概述酶工程制药概述酶法制药酶法制药药用酶的生产药用酶的生产S1 S1 酶工程制药概述酶工程制药概述将猪胰岛素转化为人胰岛素将猪胰岛素转
6、化为人胰岛素酶法制药酶法制药药用酶的生产药用酶的生产S1 S1 酶工程制药概述酶工程制药概述药用酶的生产：药用酶的生产：是指生产可用于预防和治是指生产可用于预防和治疗疾病的酶。疗疾病的酶。主要技术包括主要技术包括:药用酶的发酵生产药用酶的发酵生产 药用酶的分离纯化药用酶的分离纯化 药用酶的分子修饰药用酶的分子修饰酶法制药酶法制药药用酶的生产药用酶的生产S1 S1 酶工程制药概述酶工程制药概述酶法制药酶法制药药用酶的生产药用酶的生产S1 S1 酶工程制药概述酶工程制药概述酶法制药酶法制药药用酶的生产药用酶的生产S1 S1 酶工程制药概述酶工程制药概述酶法制药酶法制药药用酶的生产药用酶的生产S1
7、S1 酶工程制药概述酶工程制药概述酶法制药酶法制药药用酶的生产药用酶的生产至至20042004年年2 2月美国月美国FDAFDA批准的生物技术药物批准的生物技术药物 产品商品名公司首次批准时间适应证Reteplase，t-PA突变体Retavase(大大肠杆菌杆菌)Centocor1996.10急性心梗Rasburicase，尿酸降解酶Elitek(酵母酵母)Sanofi-Synthelabo2002.7血浆尿酸症alteplase,tPAActivase(CHO)Genentech1987.11急性心梗，脑中风，肺栓塞urokinase，尿激酶Abbokinase(胎胎肾细胞胞)Abbott
8、2002.10肺栓塞Laronidase，粘多糖-L-艾杜糖醛酸水解酶Aldurazyme(CHO)Genzyme2003.4粘多糖贮积病Imiglucerase，葡糖脑苷脂酶Cerezyme(CHO)Genzyme1994.5Gauchers病Algasidase beta，半乳糖苷酶-Fabrazyme(CHO)Genzyme2003.4Fabrys病dornase alfa，DNA酶Pulmozyme(CHO)Genentech1993.12囊性纤维化Tenecteplase，t-PA突变体TNKase(CHO)Genentech2000.6急性心梗S2 S2 固定化酶与固定化细胞固定化
9、酶与固定化细胞n从游离酶到固定化酶从游离酶到固定化酶n固定化的方法固定化的方法n固定化酶的性质固定化酶的性质n固定化细胞固定化细胞从游离酶到固定化酶从游离酶到固定化酶均相酶反应系统的缺点：均相酶反应系统的缺点：1 1、水溶液中的、水溶液中的游离酶游离酶只能一次性使用：既只能一次性使用：既造成酶的浪费，又会增加产品分离的难造成酶的浪费，又会增加产品分离的难度和费用，影响产品的质量度和费用，影响产品的质量2 2、游离酶很不稳定，容易变性、失活、游离酶很不稳定，容易变性、失活从游离酶到固定化酶从游离酶到固定化酶固定化的方法固定化的方法固定化酶的性质固定化酶的性质固定化细胞固定化细胞从游离酶到固定化酶
10、从游离酶到固定化酶固定化酶的概念：固定化酶的概念：通过载体将酶限制或固定于特定通过载体将酶限制或固定于特定的空间位置，使之既不易随水的空间位置，使之既不易随水流失，又能发挥酶的催化作用，流失，又能发挥酶的催化作用，这样的酶制剂就称之为这样的酶制剂就称之为固定化酶固定化酶（immobilized enzymeimmobilized enzyme），制备固定化酶的过程称为制备固定化酶的过程称为酶的酶的固定化。固定化。固定化酶的最大特点：既具有固定化酶的最大特点：既具有生物催化剂生物催化剂的功能，的功能，又具有又具有固相催化剂固相催化剂的特性。的特性。从游离酶到固定化酶从游离酶到固定化酶固定化的方法
11、固定化的方法固定化酶的性质固定化酶的性质固定化细胞固定化细胞从游离酶到固定化酶从游离酶到固定化酶1 1、可以多次使用，且酶的稳定性提高、可以多次使用，且酶的稳定性提高固定化的葡萄糖异构酶：固定化的葡萄糖异构酶：60-6560-65，1000h1000h固定化黄色短杆菌的延胡索酸酶：固定化黄色短杆菌的延胡索酸酶：反应反应1 1年活力不变年活力不变2 2、酶与底物和产物易于分开：、酶与底物和产物易于分开：产物中无残留酶，易于纯化，产品质量高产物中无残留酶，易于纯化，产品质量高固定化酶的优点固定化酶的优点从游离酶到固定化酶从游离酶到固定化酶固定化的方法固定化的方法固定化酶的性质固定化酶的性质固定化细
12、胞固定化细胞3 3、反应条件易于控制：、反应条件易于控制：可实现转化反应的连续化和自动控制可实现转化反应的连续化和自动控制4 4、利用效率高：、利用效率高：单位酶催化的底物量增加，用酶量减少单位酶催化的底物量增加，用酶量减少5 5、比水溶性酶更适合于多酶反应、比水溶性酶更适合于多酶反应从游离酶到固定化酶从游离酶到固定化酶固定化酶的优点固定化酶的优点从游离酶到固定化酶从游离酶到固定化酶固定化的方法固定化的方法固定化酶的性质固定化酶的性质固定化细胞固定化细胞连续的多酶反应连续的多酶反应主要缺点主要缺点:固定化时，酶活力有损失固定化时，酶活力有损失从游离酶到固定化酶从游离酶到固定化酶固定化的方法固定
13、化的方法固定化酶的性质固定化酶的性质固定化细胞固定化细胞固定化的方法固定化的方法物理法物理法结晶法结晶法化学法化学法共价结合法共价结合法分散法分散法交联法交联法物理吸附法物理吸附法包埋法包埋法网格型网格型离子结合法离子结合法微囊型微囊型从游离酶到固定化酶从游离酶到固定化酶固定化的方法固定化的方法固定化酶的性质固定化酶的性质固定化细胞固定化细胞化学法：化学法：共价结合法共价结合法n酶与载体以共价键结合酶与载体以共价键结合 使用和报道最多的方法！使用和报道最多的方法！n载体载体 无机物（玻璃、陶瓷）无机物（玻璃、陶瓷）天然有机物（多糖、蛋白质）天然有机物（多糖、蛋白质）合成聚合物（聚酯、聚胺、尼龙
14、）合成聚合物（聚酯、聚胺、尼龙）从游离酶到固定化酶从游离酶到固定化酶固定化的方法固定化的方法固定化酶的性质固定化酶的性质固定化细胞固定化细胞化学法：化学法：共价结合法共价结合法n载体载体-反应基团反应基团 活性基团（活性基团（-SH-SH）相关基团活化（相关基团活化（-OH-OH、-COOH-COOH、-NH-NH2 2等）等）双功能试剂（戊二醛）双功能试剂（戊二醛）n酶酶-反应基团反应基团 -/-/-氨基，氨基，-/-/-/-/-羧基羧基 羟基、巯基、咪唑基、酚基等羟基、巯基、咪唑基、酚基等n优点：优点：结合牢固，酶不易脱落结合牢固，酶不易脱落n缺点：缺点：反应剧烈，酶活回收低（反应剧烈，酶
15、活回收低（30%30%）从游离酶到固定化酶从游离酶到固定化酶固定化的方法固定化的方法固定化酶的性质固定化酶的性质固定化细胞固定化细胞从游离酶到固定化酶从游离酶到固定化酶固定化的方法固定化的方法固定化酶的性质固定化酶的性质固定化细胞固定化细胞化学法：共价结合法化学法：共价结合法化学法：化学法：交联法交联法n双功能双功能/多功能试剂多功能试剂，酶，酶-酶以共价键结合酶以共价键结合（不需要载体！）（不需要载体！）n酶酶-反应基团反应基团 氨基（氨基（N N末端）、末端）、-氨基、氨基、巯基、酚基、咪唑基巯基、酚基、咪唑基n交联剂：交联剂：戊二醛戊二醛从游离酶到固定化酶从游离酶到固定化酶固定化的方法固
16、定化的方法固定化酶的性质固定化酶的性质固定化细胞固定化细胞从游离酶到固定化酶从游离酶到固定化酶固定化的方法固定化的方法固定化酶的性质固定化酶的性质固定化细胞固定化细胞化学法：交联法化学法：交联法包埋法：包埋法：网格型网格型n凝胶凝胶，细微网格，细微网格n包埋材料：包埋材料：合成高分子（聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、光敏树脂）合成高分子（聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、光敏树脂）天然高分子（淀粉、明胶、胶原、海藻胶等）天然高分子（淀粉、明胶、胶原、海藻胶等）从游离酶到固定化酶从游离酶到固定化酶固定化的方法固定化的方法固定化酶的性质固定化酶的性质固定化细胞固定化细胞包埋法：包埋法：微囊型微囊型n半透膜半透膜，颗粒，
17、颗粒n颗粒直径通常为几微米到颗粒直径通常为几微米到几百微米，几百微米，比网格型要小得多，有利比网格型要小得多，有利于底物与产物的扩散于底物与产物的扩散从游离酶到固定化酶从游离酶到固定化酶固定化的方法固定化的方法固定化酶的性质固定化酶的性质固定化细胞固定化细胞包埋法包埋法网格型、微囊型网格型、微囊型n优点：优点：1 1、酶活回收高、酶活回收高 不需要酶蛋白的氨基酸残基参与反应不需要酶蛋白的氨基酸残基参与反应2 2、适合于小分子底物和产物、适合于小分子底物和产物n缺点：缺点：酶也易失活酶也易失活 包埋时发生化学聚合反应包埋时发生化学聚合反应 但可设计反应条件改善但可设计反应条件改善从游离酶到固定化
18、酶从游离酶到固定化酶固定化的方法固定化的方法固定化酶的性质固定化酶的性质固定化细胞固定化细胞固定化酶的方法比较固定化酶的方法比较从游离酶到固定化酶从游离酶到固定化酶固定化的方法固定化的方法固定化酶的性质固定化酶的性质固定化细胞固定化细胞固定化酶的性质固定化酶的性质n固定化也是一种化学修饰固定化也是一种化学修饰，酶本身的结，酶本身的结构必然受到扰动构必然受到扰动n酶固定化后，扩散限制效应、空间障碍、酶固定化后，扩散限制效应、空间障碍、载体性质造成的分配效应等因素必然对载体性质造成的分配效应等因素必然对酶的性质产生影响酶的性质产生影响从游离酶到固定化酶从游离酶到固定化酶固定化的方法固定化的方法固定
19、化酶的性质固定化酶的性质固定化细胞固定化细胞固定化酶的性质固定化酶的性质1 1、酶活力变化：、酶活力变化：多数情况下，酶活降低多数情况下，酶活降低 Km Km增大增大与底物的亲和力下降与底物的亲和力下降2 2、酶稳定性变化、酶稳定性变化 热稳定性提高热稳定性提高最适温度最适温度 酸碱稳定性提高酸碱稳定性提高最适最适pHpH 对有机溶剂、酶抑制剂稳定性提高对有机溶剂、酶抑制剂稳定性提高 贮藏稳定性提高贮藏稳定性提高从游离酶到固定化酶从游离酶到固定化酶固定化的方法固定化的方法固定化酶的性质固定化酶的性质固定化细胞固定化细胞从游离酶到固定化酶从游离酶到固定化酶固定化的方法固定化的方法固定化酶的性质固
20、定化酶的性质固定化细胞固定化细胞固定化酶的性质固定化酶的性质固定化细胞固定化细胞n固定化细胞：固定化细胞：受物理、化学等因素，被受物理、化学等因素，被限制自由移动的细胞，保留催化活性，限制自由移动的细胞，保留催化活性，并可反复或连续使用。并可反复或连续使用。在固定化酶的基础在发展而来在固定化酶的基础在发展而来基因工程菌基因工程菌从游离酶到固定化酶从游离酶到固定化酶固定化的方法固定化的方法固定化酶的性质固定化酶的性质固定化细胞固定化细胞S3 S3 酶的化学修饰酶的化学修饰n从天然酶到修饰酶从天然酶到修饰酶n酶的化学修饰的方法酶的化学修饰的方法n化学修饰酶的药用价值化学修饰酶的药用价值n化学修饰酶
21、的局限性化学修饰酶的局限性从天然酶到修饰酶从天然酶到修饰酶n工业用酶稳定性问题工业用酶稳定性问题 对热、酸碱、重金属、抑制剂、有机溶剂等对热、酸碱、重金属、抑制剂、有机溶剂等 使用寿命短，工艺成本高使用寿命短，工艺成本高n 药用酶：药用酶：体内半衰期（最适体内半衰期（最适pHpH等因素）等因素）抗原性抗原性改造天然酶的策略改造天然酶的策略1 1、遗传修饰、遗传修饰 突变酶突变酶蛋白质工程技术蛋白质工程技术2 2、化学修饰、化学修饰 化学修饰酶化学修饰酶化学修饰试剂化学修饰试剂主要依据：主要依据：1 1、氨基酸残基侧链及修饰剂的反应性、氨基酸残基侧链及修饰剂的反应性 2 2、结构与功能的关系、结
22、构与功能的关系化学修饰的种类化学修饰的种类1 1、酶的表面修饰、酶的表面修饰2 2、酶的分子内部修饰、酶的分子内部修饰3 3、与辅助因子相关的修饰、与辅助因子相关的修饰1 1）大分子修饰）大分子修饰2 2）小分子修饰）小分子修饰3 3）交联修饰）交联修饰4 4）固定化修饰）固定化修饰大分子修饰大分子修饰n大分子修饰：大分子修饰：一些可溶性大分子可通过共价一些可溶性大分子可通过共价键连接到酶分子表面，形成覆盖层，对于提高键连接到酶分子表面，形成覆盖层，对于提高药用酶的稳定性、延长体内半衰期、降低或消药用酶的稳定性、延长体内半衰期、降低或消除抗原性具有重要意义。除抗原性具有重要意义。对修饰剂的要求
23、：对修饰剂的要求：1 1、具有较大分子量、具有较大分子量2 2、良好的生物相容性和水溶性、良好的生物相容性和水溶性3 3、无毒性、无毒性4 4、无免疫原性、无免疫原性常用大分子修饰剂常用大分子修饰剂1 1、高分子聚合物、高分子聚合物 聚乙二醇（聚乙二醇（PEGPEG）、聚乙烯吡咯烷酮（、聚乙烯吡咯烷酮（PVPPVP）、）、聚乙烯醇（聚乙烯醇（PVAPVA）、聚丙烯（、聚丙烯（PAAPAA）、聚赖氨酸）、聚赖氨酸2 2、天然生物大分子、天然生物大分子 肝素、肝素、人血清白蛋白人血清白蛋白3 3、糖类及衍生物、糖类及衍生物 右旋糖苷及右旋糖苷硫酸酯、右旋糖苷及右旋糖苷硫酸酯、糖肽、聚乳糖糖肽、聚乳
24、糖常用大分子修饰剂常用大分子修饰剂产品商品名公司首次批准时间适应证human somatropin人生长激素ProtropinSOMAVERT(PEG化化)GenentechNektar/Pfizer1985.102003.3矮小症肢端肥大症rhG-CSF粒细胞集落刺激因子NeupogenNeulasta(PEG化化)AmgenAmgen1991.22002.1白细胞减少interferon-2a干扰素-2aRoferon-APegasys(PEG化化)RocheRoche/Nektar 1986.62002.10乙肝、丙肝、白血病Kaposis肉瘤等Interferon-2b干扰素-2bIn
25、tron APEG-Intron(PEG化化)Schering-PloughSchering-Plough 1986.62001.8乙、丙肝、白血病、Kaposis肉瘤等聚乙二醇（聚乙二醇（PEGPEG）具有良好的水溶性和生物相容性，具有良好的水溶性和生物相容性，FDAFDA认证：体内无毒性、无残留、无免疫原性认证：体内无毒性、无残留、无免疫原性至至20042004年年2 2月，月，FDAFDA批准的生物技术药物有批准的生物技术药物有4 4个经个经PEGPEG修饰修饰化学修饰酶的药用价值化学修饰酶的药用价值n提高热稳定性提高热稳定性工业用酶工业用酶n改善酶学性质改善酶学性质工业用酶工业用酶n改
26、变最适改变最适pHpH值值工业用酶工业用酶/药用酶药用酶 n提高对各类失活因子的抵抗力提高对各类失活因子的抵抗力 工业用酶工业用酶/药用酶药用酶 n消除抗原性消除抗原性药用酶药用酶 n延长体内半衰期延长体内半衰期药用酶药用酶 n改变组织分布能力改变组织分布能力药用酶药用酶改变最适改变最适pHpH值值酶酶修饰剂修饰剂天然酶天然酶修饰酶修饰酶猪肝尿酸酶猪肝尿酸酶白蛋白白蛋白10.510.57.4-8.57.4-8.5糜蛋白酶糜蛋白酶肝素肝素8.08.09.09.0吲哚吲哚-3-3-链烷链烷羟化酶羟化酶聚丙烯酸聚丙烯酸3.53.54.5-5.54.5-5.5猪肝尿酸酶猪肝尿酸酶PEGPEG8.28.
27、29.09.0改变最适改变最适pHpH值值提高抗失活能力提高抗失活能力消除抗原性消除抗原性延长体内半衰期延长体内半衰期改变组织分布能力改变组织分布能力提高抗失活能力提高抗失活能力n失活因子主要是水解酶和酶抑制剂失活因子主要是水解酶和酶抑制剂过氧化氢酶：过氧化氢酶：PEGPEG修饰，抗胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶水解修饰，抗胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶水解的能力明显提高的能力明显提高尿激酶：尿激酶：白蛋白修后，抗胃蛋白酶水解和抗胎盘抑制剂白蛋白修后，抗胃蛋白酶水解和抗胎盘抑制剂的能力都增加的能力都增加n可能机制：可能机制：修饰剂产生空间屏蔽，有效地阻挡了水解修饰剂产生空间屏蔽，有效地阻挡了水解酶或抑制剂的进
28、攻，或者酶分子中对水解酶或抑制剂酶或抑制剂的进攻，或者酶分子中对水解酶或抑制剂发敏感基团被修饰而起到了保护作用。发敏感基团被修饰而起到了保护作用。改变最适改变最适pHpH值值提高抗失活能力提高抗失活能力消除抗原性消除抗原性延长体内半衰期延长体内半衰期改变组织分布能力改变组织分布能力消除抗原性消除抗原性酶酶修饰剂修饰剂抗原性抗原性精氨酸酶精氨酸酶PEGPEG消除消除尿酸酶尿酸酶PEGPEG消除消除SODSOD人血清白蛋白人血清白蛋白消除消除-葡萄糖苷葡萄糖苷酶酶人血清白蛋白人血清白蛋白消除消除L-AsnL-Asn酶酶PEGPEG消除消除链激酶链激酶PEGPEG降低降低改变最适改变最适pHpH值值
29、提高抗失活能力提高抗失活能力消除抗原性消除抗原性延长体内半衰期延长体内半衰期改变组织分布能力改变组织分布能力消除抗原性消除抗原性改变最适改变最适pHpH值值提高抗失活能力提高抗失活能力消除抗原性消除抗原性延长体内半衰期延长体内半衰期改变组织分布能力改变组织分布能力PFGPFG和人血清白蛋白：和人血清白蛋白：在消除酶的抗原性上效果比较在消除酶的抗原性上效果比较明显，这是目前比较公认的；明显，这是目前比较公认的；PVPPVP修饰酶：修饰酶：在重复用于体内后，会诱导机体产生抗在重复用于体内后，会诱导机体产生抗体而使酶失活；体而使酶失活；糖类物质（包括右旋糖苷）：糖类物质（包括右旋糖苷）：亦不容易消除
30、酶的抗亦不容易消除酶的抗原性，在体内仍可诱发过敏反应。原性，在体内仍可诱发过敏反应。修饰酶的抗原性与修饰剂有关：修饰酶的抗原性与修饰剂有关：延长体内半衰期延长体内半衰期酶酶修饰剂修饰剂天然酶天然酶修饰酶修饰酶精氨酸酶精氨酸酶右旋糖苷右旋糖苷1.4h1.4h12h12h尿酸酶尿酸酶白蛋白白蛋白4h4h20h20hSODSOD白蛋白白蛋白6min6min4h4h腺苷酸脱氢酶腺苷酸脱氢酶PEGPEG30min30min28h28hL-AsnL-Asn酶酶PEGPEG2h2h24h24h改变最适改变最适pHpH值值提高抗失活能力提高抗失活能力消除抗原性消除抗原性延长体内半衰期延长体内半衰期改变组织分布
31、能力改变组织分布能力改变组织分布能力改变组织分布能力n一些酶经化学修饰后，对组织的分布能一些酶经化学修饰后，对组织的分布能力就有所改变，能在血液中被靶器官选力就有所改变，能在血液中被靶器官选择性地吸收，使更多的酶择性地吸收，使更多的酶达到靶器官达到靶器官，更好地发挥药物的治疗效果。更好地发挥药物的治疗效果。-葡萄糖苷酶：葡萄糖苷酶：白蛋白修饰，有利于肝细胞摄入白蛋白修饰，有利于肝细胞摄入辣根过氧化物酶：辣根过氧化物酶：聚赖氨酸修饰，细胞的摄入量增聚赖氨酸修饰，细胞的摄入量增加，对细胞的穿透能力能够增加加，对细胞的穿透能力能够增加100100倍倍改变最适改变最适pHpH值值提高抗失活能力提高抗失
32、活能力消除抗原性消除抗原性延长体内半衰期延长体内半衰期改变组织分布能力改变组织分布能力脂质体包埋脂质体包埋n脂质体包埋脂质体包埋属于酶的属于酶的固定化修饰固定化修饰之一之一1 1、酶的表面修饰、酶的表面修饰2 2、酶的分子内部修饰、酶的分子内部修饰3 3、与辅助因子相关的修饰、与辅助因子相关的修饰1 1）大分子修饰）大分子修饰2 2）小分子修饰）小分子修饰3 3）交联修饰）交联修饰4 4）固定化修饰）固定化修饰改变最适改变最适pHpH值值提高抗失活能力提高抗失活能力消除抗原性消除抗原性延长体内半衰期延长体内半衰期改变组织分布能力改变组织分布能力脂质体包埋脂质体包埋n脂质体脂质体：天然脂类和：天
33、然脂类和/或类固醇组成的微或类固醇组成的微球体；酶分子包埋其中后，可通过细胞球体；酶分子包埋其中后，可通过细胞的膜融合或内吞作用而进入细胞内的膜融合或内吞作用而进入细胞内 n应用应用：药用酶（如：药用酶（如SODSOD、溶菌酶等）、溶菌酶等）半衰期短，免疫原性半衰期短，免疫原性化学修饰化学修饰 不易进入人体细胞不易进入人体细胞脂质体包埋脂质体包埋改变最适改变最适pHpH值值提高抗失活能力提高抗失活能力消除抗原性消除抗原性延长体内半衰期延长体内半衰期改变组织分布能力改变组织分布能力化学修饰酶的局限性化学修饰酶的局限性1 1、某种修饰剂对某一氨基酸侧链的化学修饰专某种修饰剂对某一氨基酸侧链的化学修
34、饰专一性是相对的一性是相对的2 2、化学修饰酶的构象或多或少都有一些改变、化学修饰酶的构象或多或少都有一些改变在结构与功能研究中不利在结构与功能研究中不利3 3、酶的化学修饰只能在具有极性的氨基酸残基、酶的化学修饰只能在具有极性的氨基酸残基侧链上进行，但非极性侧链在维持酶的空间构侧链上进行，但非极性侧链在维持酶的空间构象方面也有重要作用象方面也有重要作用S4 S4 酶工程研究的进展酶工程研究的进展n基因工程酶基因工程酶n核酶与脱氧核酶核酶与脱氧核酶n抗体酶抗体酶n人工模拟酶人工模拟酶n有机相酶反应有机相酶反应基因工程酶基因工程酶酶的来源酶的来源n早期酶的生产多以动植物为主要原料（至今仍用）早期
35、酶的生产多以动植物为主要原料（至今仍用）植物：蛋白酶、淀粉酶、氧化酶等植物：蛋白酶、淀粉酶、氧化酶等 动物：胰蛋白酶、脂肪酶、凝乳酶、溶菌酶等动物：胰蛋白酶、脂肪酶、凝乳酶、溶菌酶等生产周期长，受到季节、气候等限制生产周期长，受到季节、气候等限制n目前工业上应用的酶大多采用微生物发酵来生产目前工业上应用的酶大多采用微生物发酵来生产 随着酶制剂应用范围的日益扩大，使得单纯依赖动随着酶制剂应用范围的日益扩大，使得单纯依赖动植物来源的酶已远远不能满足要求。植物来源的酶已远远不能满足要求。n基因工程酶：基因工程酶：DNADNA重组技术，蛋白质工程技术重组技术，蛋白质工程技术基因工程酶基因工程酶核酶与脱
36、氧核酶核酶与脱氧核酶抗体酶抗体酶有机相酶反应有机相酶反应人工模拟酶人工模拟酶基因工程酶基因工程酶n基因工程酶基因工程酶是酶学和以是酶学和以DNADNA重组技术为主重组技术为主的现代分子生物学相结合的产物。其构的现代分子生物学相结合的产物。其构建主要包括三个方面：建主要包括三个方面：基因工程酶基因工程酶核酶与脱氧核酶核酶与脱氧核酶抗体酶抗体酶有机相酶反应有机相酶反应人工模拟酶人工模拟酶1 1、酶基因的克隆和表达、酶基因的克隆和表达利用基因工程菌生产药用酶利用基因工程菌生产药用酶2 2、酶基因的遗传修饰、酶基因的遗传修饰突变酶突变酶3 3、酶的遗传设计、酶的遗传设计合成自然界中没有的酶合成自然界中
37、没有的酶蛋白质工程蛋白质工程核酶与脱氧核酶核酶与脱氧核酶基因工程酶基因工程酶核酶与脱氧核酶核酶与脱氧核酶抗体酶抗体酶有机相酶反应有机相酶反应人工模拟酶人工模拟酶核酶与脱氧核酶核酶与脱氧核酶锤头型锤头型核酶核酶基因工程酶基因工程酶核酶与脱氧核酶核酶与脱氧核酶抗体酶抗体酶有机相酶反应有机相酶反应人工模拟酶人工模拟酶核酶与脱氧核酶核酶与脱氧核酶发夹型发夹型核酶核酶基因工程酶基因工程酶核酶与脱氧核酶核酶与脱氧核酶抗体酶抗体酶有机相酶反应有机相酶反应人工模拟酶人工模拟酶核酶与脱氧核酶核酶与脱氧核酶脱氧核酶脱氧核酶基因工程酶基因工程酶核酶与脱氧核酶核酶与脱氧核酶抗体酶抗体酶有机相酶反应有机相酶反应人工模拟
38、酶人工模拟酶核酶与脱氧核酶核酶与脱氧核酶基因工程酶基因工程酶核酶与脱氧核酶核酶与脱氧核酶抗体酶抗体酶有机相酶反应有机相酶反应人工模拟酶人工模拟酶核酶与脱氧核酶核酶与脱氧核酶基因工程酶基因工程酶核酶与脱氧核酶核酶与脱氧核酶抗体酶抗体酶有机相酶反应有机相酶反应人工模拟酶人工模拟酶抗体酶抗体酶n机体免疫系统可产生机体免疫系统可产生10108 8-10-101010不同的抗体分子，抗不同的抗体分子，抗体分子多样性赋予它体分子多样性赋予它几乎无限的识别能力几乎无限的识别能力，因此，因此将抗体开发成适合特定用途的酶很有意义将抗体开发成适合特定用途的酶很有意义n19691969年，年，JencksJenck
39、s根据根据PaulingPauling的化学反应过渡态理的化学反应过渡态理论预言，如果找到论预言，如果找到针对某个反应过渡态的抗体针对某个反应过渡态的抗体，将其加入到该反应体系中，就可观察到这个抗体将其加入到该反应体系中，就可观察到这个抗体对相应化学反应的催化效应对相应化学反应的催化效应基因工程酶基因工程酶核酶与脱氧核酶核酶与脱氧核酶抗体酶抗体酶有机相酶反应有机相酶反应人工模拟酶人工模拟酶抗体酶抗体酶n19751975年，年，单克隆抗体单克隆抗体制备技术的出现为抗体酶制备制备技术的出现为抗体酶制备技术的开发铺平了道路技术的开发铺平了道路n19861986年，美国加州年，美国加州LernerLe
40、rner和和SchultzSchultz领导的研究小领导的研究小组同时报道了成功制备出具有催化能力的单克隆抗组同时报道了成功制备出具有催化能力的单克隆抗体体催化抗体（催化抗体（catalytic antibodycatalytic antibody），也叫，也叫抗抗体酶（体酶（abzymeabzyme）n迄今已成功地开发出天然酶所催化的迄今已成功地开发出天然酶所催化的6 6大类酶促反大类酶促反应和数十种类型的常规反应的抗体酶应和数十种类型的常规反应的抗体酶基因工程酶基因工程酶核酶与脱氧核酶核酶与脱氧核酶抗体酶抗体酶有机相酶反应有机相酶反应人工模拟酶人工模拟酶抗体酶抗体酶n抗体酶具有双重功能：抗
41、体酶具有双重功能：识别抗原靶目标及特识别抗原靶目标及特定的催化功能定的催化功能，在医疗上有着广泛的应用：，在医疗上有着广泛的应用：1 1、设计抗体酶杀死特殊的病原体、设计抗体酶杀死特殊的病原体2 2、抗体酶活化处于靶部位的药物前体，抗体酶活化处于靶部位的药物前体，以降低药物毒性，增加其在体内的稳定性以降低药物毒性，增加其在体内的稳定性基因工程酶基因工程酶核酶与脱氧核酶核酶与脱氧核酶抗体酶抗体酶有机相酶反应有机相酶反应人工模拟酶人工模拟酶抗体酶抗体酶例例1 1：LandryLandry等获得可催化可卡因降解的单等获得可催化可卡因降解的单克隆抗体，可用于戒毒，阻断可卡因上瘾克隆抗体，可用于戒毒，阻
42、断可卡因上瘾基因工程酶基因工程酶核酶与脱氧核酶核酶与脱氧核酶抗体酶抗体酶有机相酶反应有机相酶反应人工模拟酶人工模拟酶抗体酶抗体酶例例2 2：抗癌药物：抗癌药物5FdU5FdU（5-5-氟脱氧尿嘧啶氟脱氧尿嘧啶 ）不但抑制肿瘤细胞的不但抑制肿瘤细胞的DNADNA合成，也抑制正合成，也抑制正常细胞的常细胞的DNADNA合成，毒性很大，然而合成，毒性很大，然而5FdU5FdU的前体化合物却是无毒的。的前体化合物却是无毒的。当当5FdU5FdU的前体化合物遇到识别肿瘤细胞的的前体化合物遇到识别肿瘤细胞的抗体酶抗体酶，才会释放出有毒的，才会释放出有毒的5FdU5FdU，杀死该，杀死该部位的肿瘤细胞。部位
43、的肿瘤细胞。基因工程酶基因工程酶核酶与脱氧核酶核酶与脱氧核酶抗体酶抗体酶有机相酶反应有机相酶反应人工模拟酶人工模拟酶抗体酶抗体酶5FdU5FdU前体前体5FdU5FdU基因工程酶基因工程酶核酶与脱氧核酶核酶与脱氧核酶抗体酶抗体酶有机相酶反应有机相酶反应人工模拟酶人工模拟酶有机相酶反应有机相酶反应基因工程酶基因工程酶核酶与脱氧核酶核酶与脱氧核酶抗体酶抗体酶有机相酶反应有机相酶反应人工模拟酶人工模拟酶有机相酶反应有机相酶反应可以用来制备手性药物可以用来制备手性药物n手性化合物，光学活性化合物手性化合物，光学活性化合物 具有旋光性质具有旋光性质n生物体内的手性环境生物体内的手性环境 氨基酸、蛋白质：
44、氨基酸、蛋白质：L-L-多糖、核酸中的糖类：多糖、核酸中的糖类：D-D-n手性药物：手性药物：进入人体后，药理和生理作用与体内进入人体后，药理和生理作用与体内靶分子之间的手性匹配和分子识别能力有关。靶分子之间的手性匹配和分子识别能力有关。基因工程酶基因工程酶核酶与脱氧核酶核酶与脱氧核酶抗体酶抗体酶有机相酶反应有机相酶反应人工模拟酶人工模拟酶有机相酶反应有机相酶反应60%40%10%90%基因工程酶基因工程酶核酶与脱氧核酶核酶与脱氧核酶抗体酶抗体酶有机相酶反应有机相酶反应人工模拟酶人工模拟酶有机相酶反应有机相酶反应基因工程酶基因工程酶核酶与脱氧核酶核酶与脱氧核酶抗体酶抗体酶有机相酶反应有机相酶反
45、应人工模拟酶人工模拟酶有机相酶反应有机相酶反应n许多手性药物的对映体具不同的药理作用许多手性药物的对映体具不同的药理作用n19921992年，年，FDAFDA明确提出对手性药物的要求明确提出对手性药物的要求n单一对映体手性药物研究单一对映体手性药物研究 新药中单一对映体占绝大多数新药中单一对映体占绝大多数 II/III II/III临床临床80%80%为手性药物为手性药物基因工程酶基因工程酶核酶与脱氧核酶核酶与脱氧核酶抗体酶抗体酶有机相酶反应有机相酶反应人工模拟酶人工模拟酶人工模拟酶人工模拟酶n对热敏感、稳定性差和来源有限等缺点对热敏感、稳定性差和来源有限等缺点限制了酶的应用，限制了酶的应用，
46、1980S1980S以来，研究和开以来，研究和开发新催化剂发新催化剂人工模拟酶人工模拟酶n人工模拟酶（人工模拟酶（enzymes of artificial enzymes of artificial imitationimitation），简称，简称人工酶人工酶或或模拟酶模拟酶，就，就是根据酶的作用机理，用人工方法合成是根据酶的作用机理，用人工方法合成的具有的具有催化活性催化活性（底物结合部位和催化（底物结合部位和催化中心）中心）的非蛋白质结构的化合物。的非蛋白质结构的化合物。基因工程酶基因工程酶核酶与脱氧核酶核酶与脱氧核酶抗体酶抗体酶有机相酶反应有机相酶反应人工模拟酶人工模拟酶人工模拟酶人
47、工模拟酶成功的例子：成功的例子：丝氨酸蛋白水解酶丝氨酸蛋白水解酶已可以用小分子化合物已可以用小分子化合物来模拟；来模拟；在合成的聚乙烯亚胺上引入十二烷基和在合成的聚乙烯亚胺上引入十二烷基和咪唑基，所形成的咪唑基，所形成的芳香硫酸酯酶芳香硫酸酯酶比天然比天然酶活力高酶活力高100100倍。倍。基因工程酶基因工程酶核酶与脱氧核酶核酶与脱氧核酶抗体酶抗体酶有机相酶反应有机相酶反应人工模拟酶人工模拟酶人工模拟酶人工模拟酶n环糊精（环糊精（cyclodextrincyclodextrin，简称，简称CDCD），它是由，它是由多个多个D-D-葡萄糖葡萄糖1 1，4-4-糖苷键结合而成的一类糖苷键结合而成的
48、一类环状低聚糖，略呈锥形的圆筒，其伯羟基和环状低聚糖，略呈锥形的圆筒，其伯羟基和仲羟基分别位于圆筒较小和较大开口端。仲羟基分别位于圆筒较小和较大开口端。外侧亲水：外侧亲水：羟基可与多种客体形成氢键羟基可与多种客体形成氢键内侧疏水性：内侧疏水性：C3C3，C5C5上的氢原子和糖苷氧原子组成上的氢原子和糖苷氧原子组成疏水性疏水性空腔，能包结多种客体分子，很类似酶对底空腔，能包结多种客体分子，很类似酶对底物的识别。物的识别。基因工程酶基因工程酶核酶与脱氧核酶核酶与脱氧核酶抗体酶抗体酶有机相酶反应有机相酶反应人工模拟酶人工模拟酶人工模拟酶人工模拟酶在在CDCD的两面引入催化基团的两面引入催化基团人工模
49、拟酶人工模拟酶基因工程酶基因工程酶核酶与脱氧核酶核酶与脱氧核酶抗体酶抗体酶有机相酶反应有机相酶反应人工模拟酶人工模拟酶人工模拟酶人工模拟酶基因工程酶基因工程酶核酶与脱氧核酶核酶与脱氧核酶抗体酶抗体酶有机相酶反应有机相酶反应人工模拟酶人工模拟酶人工模拟酶人工模拟酶基因工程酶基因工程酶核酶与脱氧核酶核酶与脱氧核酶抗体酶抗体酶有机相酶反应有机相酶反应人工模拟酶人工模拟酶人工模拟酶人工模拟酶基因工程酶基因工程酶核酶与脱氧核酶核酶与脱氧核酶抗体酶抗体酶有机相酶反应有机相酶反应人工模拟酶人工模拟酶人工模拟酶人工模拟酶nPaullingPaulling就试图解释抗体产生的原因，基本点是抗体就试图解释抗体产生
50、的原因，基本点是抗体在形成时其二维结构尽可能地同抗原形成多重作用点，在形成时其二维结构尽可能地同抗原形成多重作用点，抗原作为一种模板就会被抗原作为一种模板就会被“铸造铸造”在抗体的结合部位。在抗体的结合部位。“克隆选择克隆选择”理论否定了理论否定了PaullingPaulling的抗体形成学说，的抗体形成学说，但这种学说却为分子印迹奠定了理论基础。但这种学说却为分子印迹奠定了理论基础。n分子印迹（分子印迹（molecular imprintingmolecular imprinting）就是制备对某一就是制备对某一化合物具有选择性的聚合物的过程。这个化合物叫化合物具有选择性的聚合物的过程。这个