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1、动物细胞培养动物细胞培养动物细胞融合动物细胞融合单克隆抗体技术单克隆抗体技术动物细胞核移植动物细胞核移植动物动物细胞细胞工程工程常用常用技术技术复习：植物细胞工程中常用的技术？复习：植物细胞工程中常用的技术？植物组织培养和植物体细胞杂交植物组织培养和植物体细胞杂交其他动物细其他动物细胞工程技术胞工程技术的基础的基础第1页/共58页 如果一个大面积烧伤的病人，自体皮肤有限，其他渠道的皮肤来源不足。如何才能获得大量的自体健康皮肤？第2页/共58页人耳鼠“人耳鼠”再出风头 2001年，一只特别的活老鼠在北京引起轰动这是有着一对红眼睛的、尾巴长长的、浑身没毛的小白鼠。值得一提的是，这只小白鼠的背上，竟
2、长着一只几乎与身子一般大小的“人耳”。这只老鼠背上的“人耳”是由上海市第九人民医院副院长、整复外科主任曹谊林教授利用组织工程技术复制出来的。在京展出的数天，尽管门票高达20元，但还是有将近20万人，心甘情愿地掏钱一睹“人耳鼠”的风采。人耳鼠的出现，透露了怎样的信息？第3页/共58页第4页/共58页一、动物细胞培养 动物细胞培养就是从动物机体中取出相关的组织,将它分散成单个细胞,然后,放在适宜的培养基中,让这些细胞生长和增殖.细胞增殖2、原理1、概念3、过程：复习：植物组织培养复习：植物组织培养 在无菌和人工控制的条件下在无菌和人工控制的条件下,将离体的植物器官、将离体的植物器官、组织、细胞，培
3、养在人工控制的培养基上，给予适组织、细胞，培养在人工控制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其产生愈伤组织、丛芽，最终宜的培养条件，诱导其产生愈伤组织、丛芽，最终形成完整的植株。形成完整的植株。第5页/共58页过程过程 幼龄动物幼龄动物取动物器官取动物器官和组织和组织剪碎组织剪碎组织胰蛋白酶处理胰蛋白酶处理细胞培细胞培养养单个细胞单个细胞动物细胞培养技术动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础是其他动物细胞工程技术的基础第6页/共58页3、过程：剪碎的动物组织块细胞悬浮液胰蛋白酶10代细胞原代培养50代细胞传代培养无限传代单个细胞加培养液动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，将细
4、胞网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织和器官。传代培养：传代培养：将原代细将原代细胞从培养瓶中取出，胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培上的培养瓶中继续培养，称为传代培养。养，称为传代培养。原代培养：从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。（分装前的细胞培养）（水解弹性纤维）（水解弹性纤维）第7页/共58页4、动物细胞生长特性悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。细胞贴壁：v培养瓶或培养皿的内表面光滑、无毒、易于贴附。要求：第8页/共58页接触抑制：细胞在贴壁生长过程中，随着细胞分裂，数量不断增加，最后形成一个单
5、层，此时细胞间相互接触，细胞分裂和生长停止，数量不再增加。50代以后失去接触抑制接触抑制第9页/共58页细胞悬浮液胰蛋白酶10代细胞原代培养50代细胞传代培养细胞株无限传代细胞系单个细胞加培养液遗传物质未改变遗传物质已改变剪碎的动物组织块传代培养的细胞一般传至10代左右细胞生长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞存活到4050代，这种传代细胞为细胞株。细胞株：细胞系：细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，容易传代培养。第10页/共58页动物胚胎或幼龄动
6、物的组织或器官分裂旺盛，分化程度低，易培养第11页/共58页P44思考1、用胰蛋白酶分散细胞，由此可说明细胞间的物质主要是什么成分？2、胰蛋白酶能将细胞消化掉吗？那将动物组织分散成单个细胞时要注意什么问题呢？3、能够用胃蛋白酶代替胰蛋白酶吗？为什么？主要是蛋白质(胶原蛋白等)。能，应注意时间的控制不能，因为动物细胞培养适宜的PH为，此环境下胃蛋白酶（）没有活性，而胰蛋白酶(7.2-8.4)的活性较高。第12页/共58页多细胞动物和人体的细胞都生活在内环境中，根据你所学的内环境的知识，讨论以下问题：1.体外培养细胞时需要提供哪些物质？2.体外培养的细胞需要什么样的环境条件？5、动物细胞培养的条件
7、P46【讨论】充足的营养供给、适宜的温度、适宜的pH和气体环境。无菌、无毒的环境。第13页/共58页1、无菌、无毒的环境2、营养（与体内基本相同）3、温度和PH 4、气体环境：保证细胞顺利的生长增殖无菌处理、添加一定量的抗生素，定期更换培养液葡萄糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素、维生素、动物血清、血浆等。36.5+（-）度O2:细胞代谢所必须CO2：主要维持培养液的PH（95%空气和5%CO2）5、动物细胞培养的条件第14页/共58页合成合成培养基培养基合成培养基成分已知，便于对实验条件的控制。但与天然培养基相比，有些天然的未知成分尚无法用已知的化学成分所替代，因此，细胞培养中使用的基
8、础合成培养基还必须加入一定量的天然培养基成分，以克服合成培养基的不足。最普遍的作法是加入小牛血清。第15页/共58页天然天然培养基培养基 直接采用取自动物体液或从组织中提取的成分作培养液，主要有血清、组织提取液、鸡胚汁等。使用最普遍的天然培养基是血清，基本以小牛血清最普遍。血清由于含有多种细胞生长因子、促贴附因子及其多活性物质。与合成培养基合用，能使细胞顺利增殖生长。第16页/共58页P46 为什么对动物细胞进行培养时通常要添加血清？血清中含有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等，其中蛋白质主要为白蛋白和球蛋白。氨基酸有多种，是细胞合成蛋白质的基本成分，其中有些氨基酸动物细胞本身不能合成（称为必需氨
9、基酸），必须由培养液提供。血清激素有胰岛素、生长激素等及多种生长因子；血清还含有多种未知的促细胞生长因子、促贴附因子及其他活性物质，能促进细胞的生长、增殖和贴附。因此，细胞培养时，要保证细胞能够顺利生长和增殖，一般需添加10%20%的血清。第18页/共58页 超净工作台CO2培养箱冰箱冰箱第19页/共58页第20页/共58页6、动物细胞培养技术的应用生产蛋白生物制品：病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体等健康细胞培养：如获得大量自身的皮肤细胞，用于植皮。用于检测有毒物质用于生理、病理、药理等方面的研究，为治疗和预防疾病提供理论依据第21页/共58页植物组织培养和动物细胞培养的比较比较项目比较项目植物组
10、织培养植物组织培养动物细胞培养动物细胞培养原理原理培养基性质培养基性质培养基特有成分培养基特有成分培养结果培养结果培养目的培养目的细胞的全能性细胞的全能性细胞增殖细胞增殖固体培养基固体培养基液体培养基液体培养基蔗糖蔗糖 植物激素植物激素葡萄糖葡萄糖 动物血清动物血清植物体植物体细胞株、细胞系细胞株、细胞系快速繁殖、培育无快速繁殖、培育无病毒植株病毒植株获得细胞或细胞分获得细胞或细胞分泌蛋白泌蛋白第22页/共58页将动物的一个细胞的细胞核，移入一个将动物的一个细胞的细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新的胚胎最终
11、发育成动物成一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育成动物个体。个体。用核移植的方法得到的动物称为克隆动物用核移植的方法得到的动物称为克隆动物核移植核移植（难度高）（难度高）受体细胞：受体细胞：M期的卵期的卵母细胞母细胞胚胎细胞核移植：胚胎细胞核移植：体细胞核移植：体细胞核移植：细胞分化程度低，恢复细胞分化程度低，恢复全能性容易全能性容易二、动物体细胞核移植技术和克隆动物 1、概念：2、分类：第24页/共58页3、过程供体细胞（供核）细胞培养体细胞卵母细胞（M中期：供质）去核无核卵母细胞注入细胞融合杂种细胞构建重组胚胎胚胎移植代孕母体新个体(与母体基本相同的个体)杂种细胞核移植胚胎移植第27页/共5
12、8页动物体细胞核移植过程：第28页/共58页P49【讨论2】1.在体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞之前，为什么必须先去掉受体卵母细胞的核？为使核移植动物的主要遗传物质全部为使核移植动物的主要遗传物质全部来自有利用价值的动物提供的细胞。来自有利用价值的动物提供的细胞。第29页/共58页2.用于核移植的供体细胞一般都选用传代10代以内的细胞，想一想，这是为什么？10代以内的细胞一般保持正常二倍体代以内的细胞一般保持正常二倍体的核型，未发生突变的核型，未发生突变第30页/共58页3.你认为用上述体细胞核移植方法生产的克隆动物，是对体细胞供体动物进行了100%的复制吗？为什么？克隆动物绝大部分DNA来
13、自于供体细胞核，但其核外还有少量的DNA，即线粒体中的DNA是来自于受体卵母细胞。此外，即便动物的遗传基础完全相同，还与所处环境有很大关系.第31页/共58页卵细胞母绵羊母绵羊乳腺细胞细胞质细胞核细胞核移植细胞核移植早期胚胎卵裂卵裂C母绵羊子宫胚胎移植胚胎移植多莉羊分娩分娩妊娠妊娠4、多多莉莉羊羊的的培培育育过过程程融合后的卵细胞第32页/共58页克隆羊的成功证明了什么？1、动物体细胞核具有全能性；2、细胞质具有调控细胞核发育的作用。第33页/共58页（1）对比多莉羊和高产奶牛的克隆过程，）对比多莉羊和高产奶牛的克隆过程，找出操作过程的不同点？找出操作过程的不同点？多莉克隆过程的受体细胞是多莉
14、克隆过程的受体细胞是去核去核卵卵细胞细胞，而高产奶牛的克隆过程的受体细胞是而高产奶牛的克隆过程的受体细胞是去核去核卵母卵母细胞细胞；多莉克隆过程是将供体；多莉克隆过程是将供体细胞核细胞核注入受体细胞，而高产奶牛的克隆过程是注入受体细胞，而高产奶牛的克隆过程是将供体将供体细胞细胞注入受体细胞。注入受体细胞。思考题思考题第34页/共58页（2）讨论分析上述哪一种措施更科学？）讨论分析上述哪一种措施更科学？并说明理由？并说明理由？卵母细胞当中的细胞周期蛋白含量、活性卵母细胞当中的细胞周期蛋白含量、活性比卵细胞高，用它作受体更容易成功比卵细胞高，用它作受体更容易成功 将供体细胞注入受体细胞，使克隆动物
15、更将供体细胞注入受体细胞，使克隆动物更像供体动物，操作也方便像供体动物，操作也方便 高产奶牛的克隆过程更科学高产奶牛的克隆过程更科学第35页/共58页5、体细胞核移植技术的应用前景 1、在畜牧业中可以加速家畜遗传改良的进程2、保护濒危物种3、利用转基因克隆动物生产医用蛋白质4、用于器官移植的的供体。5、使人类深入了解胚胎发育及衰老过程6、追踪研究疾病的发展过程和治疗疾病第36页/共58页第37页/共58页6 6、体细胞核移植技术存在的问题 1、成功率低2、存在健康问题（如异常肥胖、发育困难、脏器缺陷、免疫失调等）3、克隆动物食品的安全性也存在争议4、克隆动物的各个环节也有待改进第38页/共58
16、页可以利用卢辛达的体细胞克隆的奶牛其遗传物质基本上全部来自该奶牛。3、（1）能利用体细胞核移植技术克隆高产奶牛卢辛达吗？请说明理由。思考题思考题第41页/共58页首先从卢辛达耳朵上剪取一小块组织，在体外培养获得该组织的细胞。从屠宰场取废弃的牛卵巢，抽取卵母细胞体外培养成熟。用显微针去除卵母细胞的核，再将耳细胞注入卵母细胞，用电刺激方法使卵母细胞与体细胞融合，这时供体核就进入了受体卵母细胞，再用电刺激或化学物质激活注入了体细胞核的卵母细胞，使其完成细胞分裂和发育过程。核移植胚胎在体外短时间培养后，挑选正常卵裂的胚胎植入经同期发情处理的受体母牛体内。2）如果将克隆高产奶牛卢辛达的任务交给你，你将如
17、何对它进行克隆？第42页/共58页在研究方面，克隆动物基因组重新编程的机制尚不清楚，克隆技术效率低，克隆动物畸形率高、死亡率高、易出现早衰等问题。这些问题尚在研究中。在应用上，生产克隆动物费用昂贵，距大规模应用还有一定距离。4.体细胞核移植技术在研究和应用上还存在什么问题？请你查阅资料，了解这方面的前沿动态。第43页/共58页D例题解析1、动物细胞工程技术的基础是、动物细胞工程技术的基础是（）A.动物细胞融合动物细胞融合 B.单克隆抗体单克隆抗体 C.胚胎移植胚胎移植 D.动物细胞培养动物细胞培养解析：动物细胞工程中技术包括动物细胞培养、解析：动物细胞工程中技术包括动物细胞培养、动物细胞融合、
18、胚胎移植和单克隆抗体，其中动物细胞融合、胚胎移植和单克隆抗体，其中动物细胞培养是其他技术的基础动物细胞培养是其他技术的基础第44页/共58页 2、在动物细胞培养过程中遗传物质发生、在动物细胞培养过程中遗传物质发生改变的细胞是改变的细胞是 A细胞系细胞系 B细胞株细胞株 C原代细胞原代细胞 D传代细胞传代细胞A解析：细胞株传代至解析：细胞株传代至50代后出现细胞生长停滞代后出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代细其在培养条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系胞为细胞系第45页/共58页3、用于动物
19、细胞培养的组织和细胞大都取自、用于动物细胞培养的组织和细胞大都取自胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织，其胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织，其主要原因是这样的组织细胞主要原因是这样的组织细胞（）A.容易产生各种变异容易产生各种变异 B.具有更强的全能性具有更强的全能性 C.取材十分方便取材十分方便 D.分裂增殖的能力强分裂增殖的能力强D第46页/共58页4.动物细胞培养与植物细胞培养的重要区别在于动物细胞培养与植物细胞培养的重要区别在于 A.培养基不同；培养基不同；B.动物细胞培养不需要在无菌条件下进行；动物细胞培养不需要在无菌条件下进行；C.动物细胞可以传代培养，而植物细胞不能；动物细胞
20、可以传代培养，而植物细胞不能；D.动物细胞能够大量培养，而植物细胞只能培动物细胞能够大量培养，而植物细胞只能培养成植株。养成植株。A第47页/共58页5.在动物细胞培养的有关叙述中正确的是在动物细胞培养的有关叙述中正确的是A.细胞的癌变发生于原代培养向传代培养的过渡过程中细胞的癌变发生于原代培养向传代培养的过渡过程中B.动物细胞培养液中通常含有葡萄糖、氨基酸、无机盐、生长素和动物血清等动物细胞培养液中通常含有葡萄糖、氨基酸、无机盐、生长素和动物血清等C.动物细胞培养的目的是获得大量的细胞动物细胞培养的目的是获得大量的细胞D.动物细胞培养前和培养过程中都要用胰蛋白酶处理动物细胞培养前和培养过程中
21、都要用胰蛋白酶处理D第48页/共58页1.用动、植物成体的体细胞进行离体培用动、植物成体的体细胞进行离体培养，下列叙述正确的是养，下列叙述正确的是A.都需用培养箱都需用培养箱 B.都须用液体培养基都须用液体培养基C.都要在无菌条件下进行都要在无菌条件下进行 D.都可体现细胞的全能性都可体现细胞的全能性链接高考C解析：动、植物成体的体细胞进行离体培养都要在无解析：动、植物成体的体细胞进行离体培养都要在无菌条件下进行，动物成体的体细胞离体培养用液体培菌条件下进行，动物成体的体细胞离体培养用液体培养基，不能体现细胞的全能性，植物成体的体细胞离养基，不能体现细胞的全能性，植物成体的体细胞离体培养不一定
22、用液体培养基，能体现细胞的全能性。体培养不一定用液体培养基，能体现细胞的全能性。故故C正确。正确。第50页/共58页2.下列不属于动物细胞工程应用的是下列不属于动物细胞工程应用的是 A.大规模生产干扰素用于抵抗病毒引起的感染大规模生产干扰素用于抵抗病毒引起的感染 B.为大面积烧伤的病人提供移植的皮肤细胞为大面积烧伤的病人提供移植的皮肤细胞 C.大规模生产食品添加剂、香料等大规模生产食品添加剂、香料等 D.利用胚胎移植技术，加快优良种畜的繁殖利用胚胎移植技术，加快优良种畜的繁殖C解析：大规模生产食品添加剂、香料等是植物解析：大规模生产食品添加剂、香料等是植物细胞工程的应用，动物细胞工程无此应用细
23、胞工程的应用，动物细胞工程无此应用第51页/共58页3“试管婴儿试管婴儿”技术属于技术属于A胚胎移植胚胎移植B组织培养组织培养C克隆技术克隆技术D基因工程基因工程A解析：试管婴儿是获得精子和卵细胞后，在解析：试管婴儿是获得精子和卵细胞后，在体外受精，之后把早期的胚胎移植到体内，体外受精，之后把早期的胚胎移植到体内，属于胚胎移植技术，繁殖方式为有性生殖。属于胚胎移植技术，繁殖方式为有性生殖。而克隆是无性繁殖的意思，比如体细胞核移而克隆是无性繁殖的意思，比如体细胞核移植技术得到的动物为克隆动物。植技术得到的动物为克隆动物。第52页/共58页4胚胎移植技术目前主要应用于胚胎移植技术目前主要应用于 A
24、 解决某些不孕症者的生育问题解决某些不孕症者的生育问题 B 治疗某些遗传病治疗某些遗传病 C 提高良种家畜的繁殖力提高良种家畜的繁殖力 D 提高动物的抗病力提高动物的抗病力AC第53页/共58页5、回答下列有关动物细胞培养的问题：回答下列有关动物细胞培养的问题：在动物细胞培养过程中。当贴壁细胞分裂生长到在动物细胞培养过程中。当贴壁细胞分裂生长到细胞表面细胞表面时，细胞会停止分裂增殖，这种时，细胞会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的现象称为细胞的。此时，瓶壁上形成的细。此时，瓶壁上形成的细胞层数是胞层数是。要使贴壁的细胞从瓶壁上分离下来，。要使贴壁的细胞从瓶壁上分离下来，需要用酶处理，可用的酶是需
25、要用酶处理，可用的酶是。随着细胞传代次数的增多，绝大部分细胞分裂停随着细胞传代次数的增多，绝大部分细胞分裂停止，进而出现止，进而出现 现象；但极少数细胞可现象；但极少数细胞可以连续增殖，其中有些细胞会因遗传物质发生改变以连续增殖，其中有些细胞会因遗传物质发生改变而变成而变成细胞，该种细胞的黏着性细胞，该种细胞的黏着性，细，细胞膜表面蛋白质（糖蛋白）的量胞膜表面蛋白质（糖蛋白）的量 。相互接触相互接触接触抑制接触抑制一层一层胰蛋白酶胰蛋白酶衰老甚至死亡衰老甚至死亡不死性不死性降低降低减少减少第54页/共58页(3)检查某种毒物是否能改变细胞染色体的数目，检查某种毒物是否能改变细胞染色体的数目，最
26、好选用细胞分裂到最好选用细胞分裂到期的细胞用显微镜期的细胞用显微镜进行观察。进行观察。(4)在细胞培养过程中，通常在在细胞培养过程中，通常在 条件下保条件下保存细胞。因为在这种条件下，细胞中存细胞。因为在这种条件下，细胞中 的的活性降低，细胞活性降低，细胞的速率降低。的速率降低。(5)给患者移植经细胞培养形成的皮肤组织后，发给患者移植经细胞培养形成的皮肤组织后，发生了排斥现象，这是因为机体把移植的皮肤组生了排斥现象，这是因为机体把移植的皮肤组织当作织当作进行攻击。进行攻击。中中低温低温酶酶新陈代谢新陈代谢抗原抗原第55页/共58页苏丹红是一种人工色素（工业染料），它在人体内代谢生成相应的胺类。
27、科研人员以小鼠为实验材料，用“动物细胞培养技术”对苏丹红毒性进行了检测。（1）该方法检测有毒物质毒性的指标是 。（2）请完善检测苏丹红毒性的实验。主要实验步骤：第一步，取大小相同的六只培养瓶依次编号为l6，分别加入等量相同的培养液和小鼠细胞；第二步：；第三步：。结果如下表：结论：。变异细胞占全部培养细胞的比例向1号瓶中加入适量的水，向26号瓶中加入等量不同浓度的苏丹红添加剂。培养一段时间后，取样制成临时装片，观察记录变异细胞的数目。低浓度的苏丹红毒性很小，随浓度增加毒性逐渐增强。动物细胞培养技术的应用动物细胞培养技术的应用第56页/共58页动物细胞培养技术的应用动物细胞培养技术的应用继哺乳动物乳腺发生器研发成功后，膀胱生物发生器的研究也取得了一定进展。最近，科学家培养出一种转基因小鼠，其膀胱上皮细胞可以合成人的生长激素并分泌到尿液中。请回答：（1）将人的生长激素基因导入小鼠受体细胞，常用方法是 。（2）在研制膀胱生物反应器时，应使外源基因在小鼠的细胞中特异表达。（5）为使外源基因在后代长期保持，可将转基因小鼠细胞的 转入 细胞中构成重组细胞，使其发育成与供体具有相同性状的个体。该技术称为 。该重组细胞发育的过程中还应用了技术。显微注射法膀胱上皮细胞核 去核的卵母细胞细胞核移植动物细胞培养第57页/共58页感谢您的观看！第58页/共58页