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1、DNA的粗提取与鉴定 第1页/共48页一、基础知识一、基础知识（一）提取（一）提取DNADNA的方法的方法1 1、提取生物大分子的基本思路、提取生物大分子的基本思路选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子2 2、生物大分子、生物大分子主要指蛋白质、酶和核酸主要指蛋白质、酶和核酸3 3、提取、提取DNADNA的基本思路的基本思路利用利用DNADNA与与RNARNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNADNA，去除其，去除其他成分他成分第2页/共48页
2、4 4、DNADNA的溶解性的溶解性DNADNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaClNaCl溶液中溶解度不同，利用这一特点，选溶液中溶解度不同，利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使择适当的盐浓度就能使DNADNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反5 5、讨论：、讨论：根据根据DNADNA在在NaClNaCl溶液中的溶解度曲线图，思考在什么浓度下，溶液中的溶解度曲线图，思考在什么浓度下，DNADNA的溶解度最的溶解度最小？小？DNADNA在在NaClNaCl溶液中的溶解度是如何变化的？溶液中的溶解度是如何变化的？第3页/共48页第4页
3、/共48页在在NaClNaCl溶液浓度低于溶液浓度低于0.14 mol/L0.14 mol/L时，时，DNADNA的溶解度随的溶解度随NaClNaCl溶液浓度的增加而逐渐降低；溶液浓度的增加而逐渐降低；在在0.14 mol/L0.14 mol/L时，时，DNADNA溶解度最小；当溶解度最小；当NaClNaCl溶液浓度继续增加时，溶液浓度继续增加时，DNADNA的溶解度又逐的溶解度又逐渐增大。渐增大。当氯化钠的物质的量浓度为当氯化钠的物质的量浓度为 2 mol2 molL L时，时，DNADNA的溶解度最大，浓度为的溶解度最大，浓度为 0 014 mol14 molL L时，时，DNADNA的溶
4、解度最低。利用这一原理，可以使的溶解度最低。利用这一原理，可以使DNADNA在盐溶液中溶解或析出在盐溶液中溶解或析出如何通过控制如何通过控制NaClNaCl溶液的浓度使溶液的浓度使DNADNA在盐溶液中溶解或析出？在盐溶液中溶解或析出？第5页/共48页DNADNA不不溶溶于于酒酒精精溶溶液液，但但是是细细胞胞中中的的某某些些物物质质则则可可以以溶溶于于酒酒精精。利利用用这这一一原原理理，可可以将以将DNADNA与蛋白质进一步分离与蛋白质进一步分离6 6、DNADNA在酒精溶液中的溶解性在酒精溶液中的溶解性7 7、DNADNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性对酶、高温和洗涤剂的耐受性蛋白酶能水解蛋白质
5、，但是对蛋白酶能水解蛋白质，但是对DNADNA没有影响没有影响大多数蛋白质不能忍受大多数蛋白质不能忍受606080C80C的高温，而的高温，而DNADNA在在80C80C以上才会变性以上才会变性洗涤剂可以溶解细胞的细胞膜，去除脂质和蛋白质洗涤剂可以溶解细胞的细胞膜，去除脂质和蛋白质,但对但对DNADNA没有影响没有影响第6页/共48页第7页/共48页8 8、DNADNA的鉴定的鉴定 DNA DNA与二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定与二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNADNA的试剂的试剂 紫外灯照射法紫外灯照射法A A、配制染色剂，用蒸馏水配制万分之五的
6、溴化已锭（、配制染色剂，用蒸馏水配制万分之五的溴化已锭（EBEB）B B、将玻璃棒上缠绕的白色絮状物抹于蜡纸上，再滴一滴、将玻璃棒上缠绕的白色絮状物抹于蜡纸上，再滴一滴EBEB溶液染色溶液染色C C、将蜡纸放在紫外灯、将蜡纸放在紫外灯(260 nm)(260 nm)下照射（暗室中），可见橙红色的荧光下照射（暗室中），可见橙红色的荧光(DNA(DNA的紫外吸的紫外吸收高峰在收高峰在260 nm260 nm处处)甲基绿甲基绿 （蓝绿色）（蓝绿色）第8页/共48页二、二、DNADNA的粗提取与鉴定的实验设计的粗提取与鉴定的实验设计（一）实验材料的选取（一）实验材料的选取 1 1、材料：鱼卵、猪肝、菜
7、花、香蕉、鸡血、哺乳动物的红细胞、猕猴桃、洋葱、豌、材料：鱼卵、猪肝、菜花、香蕉、鸡血、哺乳动物的红细胞、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜、在液体培养基中培养的大肠杆菌。（从中选取豆、菠菜、在液体培养基中培养的大肠杆菌。（从中选取2 23 3种实验材料）种实验材料）2 2、原则：凡是含有、原则：凡是含有DNADNA的生物材料都可以考虑，但选用的生物材料都可以考虑，但选用DNADNA含量相对较高的生物组含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大织，成功的可能性更大第9页/共48页动物细胞的破碎较易，例如，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水动物细胞的破碎较易，例如，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水 ，同时用玻
8、璃棒，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可搅拌，过滤后收集滤液即可（二）破碎细胞，获取含（二）破碎细胞，获取含DNADNA的滤液的滤液1 1、动物细胞、动物细胞答：蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血答：蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出，从而释放出DNADNA讨论：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？讨论：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？第10页/共48页植物细胞需要先
9、用一定的洗涤剂和食盐溶解细胞膜植物细胞需要先用一定的洗涤剂和食盐溶解细胞膜2 2、植物细胞、植物细胞讨论：加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？讨论：加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？答：洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于答：洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于DNADNA的释放；食盐的主要成分的释放；食盐的主要成分是是NaClNaCl，有利于，有利于DNADNA的溶解的溶解实例：提取洋葱实例：提取洋葱DNADNA时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行从分的时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行从分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液搅拌和研磨，过滤后收集研磨液第11页
10、/共48页答：研磨不充分会使细胞核内的答：研磨不充分会使细胞核内的DNADNA释放不完全，提取的释放不完全，提取的DNADNA量变少，影响实验结果，量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等讨论：如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？讨论：如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？（三）去除滤液中的杂质（三）去除滤液中的杂质为了纯化提取的为了纯化提取的DNADNA需要将滤液作进一步处理需要将滤液作进一步处理讨论：此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？讨论：此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？答：可能含有核蛋白
11、、多糖和答：可能含有核蛋白、多糖和RNARNA等杂质等杂质第12页/共48页讨论：为什么反复地溶解与析出讨论：为什么反复地溶解与析出DNADNA，能够去除杂质，能够去除杂质答：用高盐浓度的溶液溶解答：用高盐浓度的溶液溶解DNADNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNADNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNADNA，就能，就能够除去与够除去与DNADNA溶解度不同的多种杂质溶解度不同的多种杂质第13页/共48页讨论：方案二与方案三的原理有什么不同？
12、讨论：方案二与方案三的原理有什么不同？答：方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的答：方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNADNA与蛋白质分开；方案三与蛋白质分开；方案三利用的是利用的是DNADNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNADNA分离分离第14页/共48页第15页/共48页（四）（四）DNADNA的析出与鉴定的析出与鉴定DNADNA的析出用的是与滤液体积相等的的析出用的是与滤液体积相等的冷却的酒精溶液（体积分数为冷却的酒精溶液（体积分数为95 95），静置，静置2 23min3min，溶液中会出现，溶液
13、中会出现白色丝状物，白色丝状物，这就是粗提取这就是粗提取DNADNA。用玻璃棒沿。用玻璃棒沿一个方向一个方向搅拌，搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水1 1、DNADNA的析出的析出第16页/共48页第17页/共48页2 2、DNADNA的鉴定的鉴定鉴定鉴定DNADNA时在试管中先加入物质的量的浓度为时在试管中先加入物质的量的浓度为2mol/L 2mol/L 的的NaClNaCl溶液溶液5ml5ml于两只试管中，于两只试管中，其中一只加入其中一只加入DNADNA丝状物，各加入丝状物，各加入二苯胺二苯胺4ml 4ml 试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中试剂。混合
14、均匀后，将试管置于沸水中加热加热5min,5min,待试管冷却后，比较两只试管中溶液颜色的变化，看看溶解有待试管冷却后，比较两只试管中溶液颜色的变化，看看溶解有DNADNA的溶液是的溶液是否有否有蓝色蓝色第18页/共48页（一）案例一：以鸡血为实验材料进行（一）案例一：以鸡血为实验材料进行DNADNA的粗提取的粗提取三、实验案例三、实验案例鸡血细胞极易吸水胀破，而用动物肝脏细胞作实验材料常常需要匀浆和离心，对鸡血细胞极易吸水胀破，而用动物肝脏细胞作实验材料常常需要匀浆和离心，对设备要求较高，操作繁琐，历时较长设备要求较高，操作繁琐，历时较长1 1、鸡血细胞做实验材料的原因、鸡血细胞做实验材料的
15、原因鸡血细胞核的鸡血细胞核的DNADNA含量丰富，材料易得含量丰富，材料易得第19页/共48页2 2、实验原理、实验原理 DNA DNA在在NaClNaCl溶液中的溶解度，是随着溶液中的溶解度，是随着NaClNaCl的浓度的变化而改变的。当的浓度的变化而改变的。当NaClNaCl的物质的的物质的量浓度为量浓度为0.14 mol0.14 molL L时时,DNA,DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使溶解在的溶解度最低。利用这一原理，可以使溶解在NaClNaCl溶液中溶液中的的DNADNA析出。析出。DNA DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质可以溶于酒精溶液。利用这一原理，不溶于酒精
16、溶液，但是细胞中的某些蛋白质可以溶于酒精溶液。利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的可以进一步提取出含杂质较少的DNADNA。DNA DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNADNA的试剂。的试剂。第20页/共48页3 3、实验材料和用具：、实验材料和用具：鸡血细胞液（鸡血细胞液（510ml510ml）；体积分数为）；体积分数为95%95%的冷酒精溶液（实验前置于冰箱内冷却的冷酒精溶液（实验前置于冰箱内冷却24h24h）；蒸馏水；质量浓度为）；蒸馏水；质量浓度为0 0g/mlg/ml的柠檬酸纳溶液；务质量的浓度分
17、别为的柠檬酸纳溶液；务质量的浓度分别为2mol/L2mol/L和和0 0015mol/L015mol/L的氯化纳溶液；二苯胺试剂。铁架台；铁环；镊子；三角架；酒精灯；的氯化纳溶液；二苯胺试剂。铁架台；铁环；镊子；三角架；酒精灯；石棉网；载玻片；玻璃棒；滤纸；滴管；量筒（石棉网；载玻片；玻璃棒；滤纸；滴管；量筒（100ml100ml，一个）；烧杯；（，一个）；烧杯；（100ml100ml，一，一个，个，50ml50ml、500ml500ml各二个）；试管（各二个）；试管（20ml20ml，二个）；漏斗；试管夹；纱布。，二个）；漏斗；试管夹；纱布。第21页/共48页4 4、课前准备鸡血细胞液、课前
18、准备鸡血细胞液取质量浓度为取质量浓度为0 01g/ml1g/ml的的柠檬酸纳溶液（抗凝剂）柠檬酸纳溶液（抗凝剂）100ml100ml，置于，置于500ml500ml烧杯中。注入烧杯中。注入新鲜的鸡血（约新鲜的鸡血（约180ml180ml），同时用玻璃棒搅拌，使血液与柠檬酸纳溶液充分混合，以），同时用玻璃棒搅拌，使血液与柠檬酸纳溶液充分混合，以免凝血。将烧杯中的血液置于冰箱内，精置一天，使血细胞自行沉淀。（也可以将血免凝血。将烧杯中的血液置于冰箱内，精置一天，使血细胞自行沉淀。（也可以将血液倒入离心管内，用液倒入离心管内，用1000r/min1000r/min（转每分）的离心机离心（转每分）的离
19、心机离心2min2min，血细胞沉淀于离心管，血细胞沉淀于离心管底部。实验时。底部。实验时。用吸管除去离心管上部的澄清液，就可以得到鸡血细胞液。）用吸管除去离心管上部的澄清液，就可以得到鸡血细胞液。）过程过程第22页/共48页柠檬酸钠作用柠檬酸钠作用防止血液凝固防止血液凝固作用机理作用机理柠檬酸钠能与血浆中的柠檬酸钠能与血浆中的CaCa2+2+发生反应，生成柠檬酸钙络合物，血浆中游离的发生反应，生成柠檬酸钙络合物，血浆中游离的CaCa2+2+大大大大减少，血液就不会凝固减少，血液就不会凝固鸡血细胞破碎以后释放出的鸡血细胞破碎以后释放出的DNADNA，容易被玻璃容器吸附，所以在提取过程中为了减，
20、容易被玻璃容器吸附，所以在提取过程中为了减少少DNADNA的损失，最好使用塑料的烧杯和试管盛放鸡血细胞液的损失，最好使用塑料的烧杯和试管盛放鸡血细胞液注意事项注意事项第23页/共48页讨论：提取鸡血中的讨论：提取鸡血中的DNADNA时，为什么时，为什么除去血液中的上清液？除去血液中的上清液？答：血液分为两部分，一部分是血浆，一部分是血细胞，离心后除去的上清液是血答：血液分为两部分，一部分是血浆，一部分是血细胞，离心后除去的上清液是血浆浆5 5、方法步骤、方法步骤 将制备好的鸡血细胞液将制备好的鸡血细胞液5 mL5 mL10mL10mL，注入到，注入到50 mL50 mL烧杯中。向烧杯中加入蒸馏
21、水烧杯中。向烧杯中加入蒸馏水20 mL20 mL，同时用，同时用玻璃棒玻璃棒充分搅拌充分搅拌5 min5 min，使血细胞加速破裂。使血细胞加速破裂。然后，用放有然后，用放有纱布的漏纱布的漏斗斗将血细胞液过滤至将血细胞液过滤至500mL500mL。取其滤液。取其滤液。提取鸡血细胞的细胞核物质提取鸡血细胞的细胞核物质第24页/共48页第25页/共48页讨论：讨论：答：让细胞内浓度大于周围溶液的浓度，细胞会吸水以至胀破答：让细胞内浓度大于周围溶液的浓度，细胞会吸水以至胀破（1 1）为什么要加入蒸馏水？加入蒸馏水后细胞会有什么变化？）为什么要加入蒸馏水？加入蒸馏水后细胞会有什么变化？（2 2）用玻璃
22、棒搅拌有什么意义？）用玻璃棒搅拌有什么意义？答：用玻璃棒搅拌可以加速血细胞和细胞核的破裂。注意应沿一个方向快速搅拌，但答：用玻璃棒搅拌可以加速血细胞和细胞核的破裂。注意应沿一个方向快速搅拌，但也不能太快太猛，防止打碎也不能太快太猛，防止打碎DNADNA（3 3）滤去的是什么物质？）滤去的是什么物质？得到的是什么？得到的是什么？答：过滤将滤去的是细胞膜和核膜等物质；得到的是与蛋白质等物质结合在一答：过滤将滤去的是细胞膜和核膜等物质；得到的是与蛋白质等物质结合在一起的起的DNADNA第26页/共48页溶解细胞核内的溶解细胞核内的DNADNA将氯化钠的物质的量浓度为将氯化钠的物质的量浓度为 2 mo
23、l2 mol的溶的溶40mL40mL加入到滤液中，并用加入到滤液中，并用玻璃棒沿一个方向玻璃棒沿一个方向搅拌搅拌1min1min，使其混合均匀，这时，使其混合均匀，这时DNADNA在溶液中呈溶解状态在溶液中呈溶解状态沿烧杯内壁缓缓加入蒸馏水，同时用沿烧杯内壁缓缓加入蒸馏水，同时用玻璃棒不停地轻轻搅拌，玻璃棒不停地轻轻搅拌，这时烧杯中有丝状物出这时烧杯中有丝状物出现，注意观察丝状物呈什么颜色。继续加入蒸馏水，溶液中出现的粘稠物会越来越多。现，注意观察丝状物呈什么颜色。继续加入蒸馏水，溶液中出现的粘稠物会越来越多。当粘稠物不再增加时停止加入蒸馏水（这时溶液中氯化钠的物质的量浓度相当于当粘稠物不再增
24、加时停止加入蒸馏水（这时溶液中氯化钠的物质的量浓度相当于0.14 0.14 molmolL L）析出含析出含DNADNA的粘稠物的粘稠物第27页/共48页第28页/共48页讨论：加入蒸馏水的目的？讨论：加入蒸馏水的目的？降低降低NaClNaCl溶液浓度到使溶液浓度到使DNADNA溶解度最低点，使溶解度最低点，使DNADNA从从NaClNaCl溶液中析出溶液中析出将溶液中的将溶液中的DNADNA与其他杂质分离，这一步骤是实验成败的关键。与其他杂质分离，这一步骤是实验成败的关键。实验中应该缓慢贴壁实验中应该缓慢贴壁加入蒸馏水，并轻轻地沿一个方向不停地均匀搅拌，以利于加入蒸馏水，并轻轻地沿一个方向不
25、停地均匀搅拌，以利于DNADNA分子的附着和缠绕分子的附着和缠绕注意事项：注意事项：第29页/共48页滤取含滤取含DNADNA的粘稠物的粘稠物用放有用放有多层纱布多层纱布的漏斗，过滤步骤的漏斗，过滤步骤3 3中的溶液至中的溶液至 500mL500mL的烧杯中，含的烧杯中，含 DNADNA的的粘稠粘稠物被留在纱布上物被留在纱布上将将DNADNA的粘稠物再溶解的粘稠物再溶解取取 1 1个个 50 mL50 mL烧杯，向烧杯内注入氯化钠的物质的量浓度为烧杯，向烧杯内注入氯化钠的物质的量浓度为 2 mol2 molL L的溶液的溶液 20mL20mL。用钝头镊子将纱布上的粘稠物夹至氯化钠溶液中，用钝头
26、镊子将纱布上的粘稠物夹至氯化钠溶液中，用玻璃择不停地搅拌，用玻璃择不停地搅拌，使粘稠物尽使粘稠物尽可能多地溶解于溶液中可能多地溶解于溶液中第30页/共48页第31页/共48页过滤含有过滤含有DNADNA的氯化钠溶液的氯化钠溶液取取1 1个个100 mL100 mL烧杯，用放有烧杯，用放有两层纱布两层纱布的漏斗过滤步骤的漏斗过滤步骤5 5中的溶液。取其滤液，中的溶液。取其滤液，DNADNA溶于滤液中溶于滤液中提取含杂质较少的提取含杂质较少的DNADNA在上述滤过的溶液中，加入在上述滤过的溶液中，加入冷却的、酒精的体积分数为冷却的、酒精的体积分数为 9595的溶液的溶液 50mL50mL（使用冷却
27、（使用冷却的酒精，对的酒精，对DNADNA的凝集效果较佳），并用的凝集效果较佳），并用玻璃棒搅拌，玻璃棒搅拌，溶液中会出现含杂质较少的丝溶液中会出现含杂质较少的丝状物。用玻璃棒将丝状物卷起，并用滤纸吸取上面的水分。这种丝状物的主要成分就状物。用玻璃棒将丝状物卷起，并用滤纸吸取上面的水分。这种丝状物的主要成分就是是DNADNA第32页/共48页第33页/共48页答：因为答：因为DNADNA不溶于冷酒精，而其他物质可以溶解在酒精中，使含杂质较少的不溶于冷酒精，而其他物质可以溶解在酒精中，使含杂质较少的DNADNA丝丝状物可以析出状物可以析出,悬浮于溶液中悬浮于溶液中讨论：讨论：（2 2）观察丝状物
28、呈什么颜色？）观察丝状物呈什么颜色？答：白色答：白色（1 1）为什么要加）为什么要加50mL50mL的冷酒精？的冷酒精？第34页/共48页取两支取两支20 mL20 mL的试管，各加入氯化钠的物质的量浓度为的试管，各加入氯化钠的物质的量浓度为0 0015 mol015 molL L的溶液的溶液5 mL5 mL，将，将丝状物放入其中一支试管中，丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入加入4mlL4mlL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热 5 min5 m
29、in，待试管冷却后，待试管冷却后，观察并且比较两支试管中溶液颜色的变化观察并且比较两支试管中溶液颜色的变化 DNA DNA的鉴定的鉴定第35页/共48页第36页/共48页讨论：讨论：答：有丝状物的试管变成蓝色，另一试管还是原来颜色答：有丝状物的试管变成蓝色，另一试管还是原来颜色（2 2）这一鉴定结果说明什么问题？）这一鉴定结果说明什么问题？（1 1）比较两个试管中溶液的颜色有什么不同？）比较两个试管中溶液的颜色有什么不同？答：提取出的丝状物是答：提取出的丝状物是DNADNA（3 3）DNADNA的直径约为的直径约为2010-10 m2010-10 m，实验中出现的丝状物的粗细是否表示，实验中出
30、现的丝状物的粗细是否表示1 1个个DNADNA分子分子直径的大小？直径的大小？答：答：DNADNA分子直径只有分子直径只有2 nm2 nm。丝状物是多个。丝状物是多个DNADNA子聚在一起形成的子聚在一起形成的 第37页/共48页第38页/共48页答：整个实验共答：整个实验共“两次蒸馏水，三次过滤，两次析出，六次搅拌两次蒸馏水，三次过滤，两次析出，六次搅拌”6 6、讨论：、讨论：两次蒸馏水两次蒸馏水第一次：第一次：细胞吸水胀破细胞吸水胀破 第一步第一步第二次：使第二次：使 DNADNA黏稠物析出黏稠物析出 第三步第三步（1 1）此实验过程中有几次使用蒸馏水？几次过滤，几次析出，几次搅拌？分别在
31、哪一）此实验过程中有几次使用蒸馏水？几次过滤，几次析出，几次搅拌？分别在哪一步？步？第39页/共48页过过滤滤时时使使用用的的纱纱布布层层数数与与需需用用滤滤液液或或黏黏稠稠物物有有关关，第第二二次次要要用用其其滤滤出出的的黏黏稠稠物物有有关，所以要使用多层纱布，第一次和第三次均要用其滤液，使用的纱布为关，所以要使用多层纱布，第一次和第三次均要用其滤液，使用的纱布为1 12 2层层三次过滤三次过滤第一次：第一次：DNADNA存在于滤液里存在于滤液里 第一步第一步第二次：第二次：DNADNA被留在纱布上被留在纱布上 第四步第三次：第四步第三次：DNADNA存在于滤液里存在于滤液里 第六步第六步第
32、40页/共48页两次析出两次析出第一次：用第一次：用0.14 mol0.14 molL L 的的NaCINaCI溶液含杂质多溶液含杂质多第三步第三步第二次：用冷却的第二次：用冷却的9595的酒精的酒精第七步第七步六次搅拌：第一、二、三、五、七步六次搅拌：第一、二、三、五、七步其中除第八步外，其余均要朝一个方向搅拌，在第三、五步搅动还要轻缓，玻其中除第八步外，其余均要朝一个方向搅拌，在第三、五步搅动还要轻缓，玻璃棒不要直插烧杯底部，这样才能保证得到完整的璃棒不要直插烧杯底部，这样才能保证得到完整的DNADNA第41页/共48页（2 2）为什么反复地溶解与析出）为什么反复地溶解与析出DNADNA，
33、能够去除杂质？，能够去除杂质？答：用高盐浓度的溶液溶解答：用高盐浓度的溶液溶解DNADNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNADNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNADNA，就，就能够除去与能够除去与DNADNA溶解度不同的多种杂质溶解度不同的多种杂质第42页/共48页（二）（二）案例二：以菜花为实验材料进行案例二：以菜花为实验材料进行DNADNA的粗提取的粗提取1 1、课前准备、课前准备将新鲜菜花和体积分数为将新鲜菜花和体积分数为9595的乙醇
34、溶液放入冰箱冷冻室的乙醇溶液放入冰箱冷冻室24 h24 h2 2、提取、提取DNADNA的具体步骤的具体步骤取材：称取取材：称取30 g30 g菜花，去梗取花，切碎菜花，去梗取花，切碎研磨：将碎菜花放入研钵中，倒入研磨：将碎菜花放入研钵中，倒入10 mL10 mL研磨液，充分研磨研磨液，充分研磨10 min10 min第43页/共48页研磨液的配制方法如下：将研磨液的配制方法如下：将10.1 g Tris10.1 g Tris加入到加入到50 mL50 mL蒸馏水中，使其溶解，然后，用蒸馏水中，使其溶解，然后，用2 2 moL/LmoL/L的的HClHCl溶液调节溶液调节pHpH至至8.08.
35、0，再加入，再加入8.76 g NaCl 8.76 g NaCl、37.2 g EDTA 37.2 g EDTA、20 g SDS20 g SDS。待。待上述药品全部溶解后，再用蒸馏水定容至上述药品全部溶解后，再用蒸馏水定容至1 000 mL1 000 mLTris/HCl:Tris/HCl:提供缓冲体系，提供缓冲体系，DNADNA在这一体系中呈稳定态（在这一体系中呈稳定态（TrisTris为三羟甲基氨基甲烷）为三羟甲基氨基甲烷）EDTAEDTA（乙二胺四乙酸二钠）：是（乙二胺四乙酸二钠）：是DNADNA酶的抑制剂，可以防止细胞破碎后酶的抑制剂，可以防止细胞破碎后DNADNA酶降解酶降解DNA
36、DNASDSSDS（十二烷基磺酸钠）：可以使蛋白质变性，与（十二烷基磺酸钠）：可以使蛋白质变性，与DNADNA分离分离第44页/共48页过滤：过滤：在漏斗中垫上尼龙纱布，将菜花研磨液过滤到烧杯中在漏斗中垫上尼龙纱布，将菜花研磨液过滤到烧杯中(有条件的学校可将有条件的学校可将滤液倒入塑料离心管中进行离心，用滤液倒入塑料离心管中进行离心，用1000 r/min1000 r/min的转速，离心的转速，离心2 25 min5 min，取上清液，取上清液放入烧杯中放入烧杯中)。在。在4 4 冰箱中放置几分钟后，再取上清液冰箱中放置几分钟后，再取上清液沉淀：沉淀：将一倍体积的上清液倒入两倍体积的体积分数为
37、将一倍体积的上清液倒入两倍体积的体积分数为9595的预冷乙醇溶液中，的预冷乙醇溶液中，并用玻璃棒缓缓、轻轻地搅拌溶液并用玻璃棒缓缓、轻轻地搅拌溶液(玻璃棒不要直插到烧杯底部玻璃棒不要直插到烧杯底部)。沉淀。沉淀3 35 min5 min后，后，可见白色的可见白色的DNADNA絮状物出现。用玻璃棒缓缓旋转，将絮状物缠绕在玻璃棒上絮状物出现。用玻璃棒缓缓旋转，将絮状物缠绕在玻璃棒上第45页/共48页观察你提取的观察你提取的DNADNA颜色，如果不是白色丝状物，说明颜色，如果不是白色丝状物，说明DNADNA中的杂质较多；二苯胺鉴中的杂质较多；二苯胺鉴定出现蓝色说明实验基本成功，如果不呈现蓝色，可能所
38、提取的定出现蓝色说明实验基本成功，如果不呈现蓝色，可能所提取的DNADNA含量低，或是含量低，或是实验操作中出现错误，需要重新制备实验操作中出现错误，需要重新制备四、课题成果评价四、课题成果评价（一）是否提取出了（一）是否提取出了DNADNA第46页/共48页本实验提取的本实验提取的DNADNA粗制品有可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质粗制品有可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质（二）分析（二）分析DNADNA中的杂质中的杂质（三）不同实验方法的比较（三）不同实验方法的比较对于不同的实验方法，本课题可以采用分组的方法进行研究。首先选取不同的实验材对于不同的实验方法，本课题可以采用分组的方法进行研究。首先选取不同的实验材料，其次同种材料还可以采用不同方法，从多方面比较实验结果，如料，其次同种材料还可以采用不同方法，从多方面比较实验结果，如DNADNA的纯度、的纯度、DNADNA的颜色、二苯胺显色的深浅等，看看哪种实验材料、哪种提取方法的效果更好的颜色、二苯胺显色的深浅等，看看哪种实验材料、哪种提取方法的效果更好第47页/共48页谢谢您的观看！第48页/共48页