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1、第六章第六章 重组体克隆的重组体克隆的筛选与鉴定筛选与鉴定 由DNA分子的体外重组，通过转化、转染、转导等适当途径引入宿主，会得到大量的重组体细胞或噬菌体。在这些众多的重组体中，会有多种类型的DNA分子，包括：不带任何外源DNA插入片段，仅由线性载体分子自身连接形成的环状DNA分子；由一个载体分子和一个或数个外源DNA片段构成的重组体DNA分子；单纯由数个外源DNA片段彼此连接形成的多聚DNA分子。对于这些由混合的DNA制剂转化而来的大量的克隆群体，需要采用特殊的方法，才能选择和鉴定出可能含有目的基因的重组体克隆。目前已发展和应用了一系列重组体克隆检测法，包括遗传检测法、物理检测法、使用特异性
2、探针的核酸杂交法，以及免疫化学法等。6.1 利用表型特征选择（遗传检测法）利用表型特征选择（遗传检测法）表型是指机体遗传组成同环境相互作用所产生的外观或其他特征。这里所说的供筛选用的表型特征来自两个方面：一个是克隆载体提供的，另一方面是插入的外源DNA序列提供的，前者应用较多。6.1.1 利用载体提供的表型特征选择重组体分子利用载体提供的表型特征选择重组体分子 1.抗药性标记插入失活选择法抗药性标记插入失活选择法 检测外源DNA插入作用的一种通用的方法是插入失活效应。例如在pBR322质粒的DNA序列上，编码有四环素抗性基因(Tetr)和氨苄青霉素抗性基因(Ampr)，且在Tetr基因内有Ba
3、m HI和Sal I两种限制酶的单一切点。在这两个识别位点中的任何插入作用，都会导致Tetr基因出现功能性失活，因而根据AmprTets表型即可筛选出在Tetr基因内带有插入DNA片段的重组体细胞。利用环丝氨酸富集法可以简化这种插入失活检测法的程序，该法可以使那些只带有原来质粒载体的细菌致死，从而抑制不含有插入DNA片段的载体分子形成转化子。例如：当外源DNA 插入在pBR322质粒的四环素抗性基因(Tetr)上，该基因便会立即失去它的功能作用，而另一种抗菌素抗性基因氨苄青霉素基因(Ampr)，则仍然是完整的。将转化的细菌培养物移至含有氨苄青霉素的培养基中生长，经过这样的选择作用而得以存活下来
4、的所有细胞，都应该带上了pBR322质粒分子。在这些pBR322质粒分子中，有一部分是在其Tetr基因序列内具有DNA插入片段的重组质粒。把这种富集了的培养物作适当的稀释后，转接到含有四环素的培养基中生长，于是在其pBR322质粒分子的Tetr基因序列中带有DNA插入片段的所有细胞，都将停止生长（注意：四环素不会使细胞死亡，只是抑制细胞的生长）。最后加入环丝氨酸，就会促使所有正在生长着的细胞发生溶胞反应，那些没有发生溶胞反应而存活下来的细胞，大约有90100%都带有pBR322重组质粒，且在其Tetr基因上都含有一个插入的外源DNA片段，这些细胞可通过离心作用收集起来。此外，在pBR322质粒
5、的Ampr基因序列中，也有一个Pst I限制酶的唯一识别位点。Ampr基因正常情况下表达产生-内酰胺酶，在其作用下青霉素会变成青霉酮酸，当加入碘-青霉素指示液（30%I2，1.5%KI，5%青霉素G，0.05M的pH 6.4的磷酸缓冲液），AmprTetr菌落为无色透明。但当pBR322质粒的Ampr基因插入失活后，AmpsTetr菌落在碘-青霉素指示液中不褪色，仍呈碘的蓝灰色。根据菌落周围指示液颜色的改变与否，很容易鉴别出重组体菌落。这种方法的优点是无需把每一个转化子接种在Amp和Tet平板上，直接在转化平板上即可鉴定。其缺点是由于把指示液直接加入选择平板内，极易超成菌落之间的相互污染，给其
6、后的鉴定带来困难。目前使用纸片法使这一方法得到了改善：预先将一定大小的纸片浸泡在指示液中，干燥后密闭保存，使用时只要将纸片覆盖在转化平板上，数分钟内就可以观察到结果。2.-半乳糖苷酶显色反应选择法半乳糖苷酶显色反应选择法 将pUC质粒转化的细胞，培养在补加有X-gal和乳糖诱导物IPTG的培养基中时，由于基因内互补作用形成的有功能的半乳糖苷酶，会把培养基中无色的X-gal切割成半乳糖和深蓝色的底物，使菌落呈现出蓝色反应。当pUC质粒载体的lacZ 序列插入了外源DNA片段时，会阻断读码结构，使其编码的肽失去活性，结果产生出白色的菌落。因此，根据这种-半乳糖苷酶的显色反应，便可以检测出含有外源D
7、NA插入序列的重组体克隆。6.1.2 利利用用插插入入序序列列提提供供的的表表型型特特征征选选择择重重组组体体分子分子 这种选择法要求所克隆的DNA片段是一个完整的序列，而且能够在大肠杆菌中实现功能的表达。其依据的基本原理是：转化进来的外源DNA编码的基因，能够对大肠杆菌寄主菌株所具有的突变发生体内抑制或互补效应，从而使被转化的寄主细胞表现出外源基因编码的表型 特 征。例 如 小 鼠 的 二 氢 叶 酸 还 原 酶（DHFR）的分离：先将含有DHFR-mRNA的小鼠总mRNA制剂反转录成cDNA拷贝，构建cDNA基因文库。根据小鼠DNFR对于药物三甲氧苄二氨嘧啶呈现抗性这种性状特征，将转化的细
8、菌生长在含有三甲氧苄二氨嘧啶的培养基中（其含量水平为可以抑制大肠杆菌的DHFR的活性），选择转化子。这样分离出来的抗性克隆，显然都是由于具有小鼠DHFR基因的克隆片段，赋予寄主细胞新的抗性表型所致。6.1.3 利用噬菌斑形态选择重组体分子利用噬菌斑形态选择重组体分子 把DNA包装成有活性的噬菌体颗粒，主要取决于两个因素：一是要具有能被噬菌体包装蛋白和头部前体所识别的区域，即cos区；二是DNA的长度，只有重组体DNA是野生型 DNA的75105%的长度时，才能在培养平板上形成清晰的噬菌斑，而单一的载体DNA是不会包装成活的噬菌体颗粒的。经体外包装，转导后能否形成清晰噬菌斑，尤其是对替换型载体，
9、本身就是一种可利用的选择标记。另外cI基因插入失活后，会诱发溶源性细菌的原噬菌体进入溶菌周期，根据产生噬菌斑的清晰与混浊，也可以进行选择。6.2 利用核酸杂交筛选利用核酸杂交筛选 从基因文库中筛选带有目的基因插入序列的克隆，最广泛使用的一种方法是核酸分子杂交技术。它所依据的原理是放射性同位素（32P或125I）标 记 的 DNA或 RNA探 针 进 行DNA-DNA或DNA-RNA杂交，利用同源DNA碱基配对的原则检测特定的重组克隆。核酸杂交筛选法的最大优点是它可以普遍广泛地应用，尤其适合于大量群体的筛选，只要有现成可用的特异性探针，就可以有效地检测任何一种插入的外源DNA序列，而不以这种序列
10、能否在大肠杆菌中实现基因表达为前提。6.2.1 原位杂交筛选原位杂交筛选 生长在培养基平板上的菌落或噬菌斑，按照其原来的位置不变地影印在硝酸纤维素滤膜上，并在原位发生溶菌、DNA变性和杂交作用，而将母板很好地保存起来。因为变性DNA同硝酸纤维素滤膜有很强的亲和力，便在膜上形成DNA的印迹，在80下烘烤滤膜，使DNA牢固地固定下来。用放射性同位素标记的RNA或DNA为探针同滤膜上的菌落所释放的变性DNA杂交，并用放射自显影技术进行检测，凡是含有与探针互补序列的菌落DNA，就会在X光胶片上出现曝光点。根据曝光点的位置，便可以从保留的母板上相应位置挑出所需要的阳性菌落或噬菌斑，这就是所需要的含有目的
11、基因插入片段的重组体克隆。6.2.2 核酸杂交检测的探针核酸杂交检测的探针 进行核酸分子杂交的前提是要有特定的DNA或RNA作探针。具有一定已知序列的核酸片段，再带上一定的探测标记，就构成了核酸探针。它可以通过分子杂交与待测基因的DNA序列结合，产生杂交信号，从而把待测基因的质和量显示出来。1.放射性探针 广泛使用的探针，多是以32PdNTP为标记前体，通过缺口平移的方法，把天然DNA或RNA片段标记上放射性同位素。此外还可以化学合成DNA探针，只要已知目的基因产物的部分氨基酸序列，就可以从这个信息中，反推出基因编码区可能的核苷酸排列顺序。选择一小段含有独特密码子（Met和Try）或简并性最小
12、的密码子（Cys、His、Phe和Tyr等）的氨基酸序列，用化学法合成出相当于这些密码子序列的寡核苷酸片段（1020个碱基）混和物；然后利用多核苷酸激酶，将32PdNTP转移到合成的DNA的5-OH末端（称为末端标记），即成为标记好的探针。一个密码子：Met（甲硫氨酸）AUG Try（色氨酸）UGG二个密码子：Cys（半胱氨酸）His（组氨酸）Phe （苯丙氨酸）Try （酪氨酸）Lys （赖氨酸）2.非放射性探针 由于32P放射性同位素半衰期只有14.3天，不易保存，且对人体有一定的损害，因而近年来又研制了非放射性物质标记核酸的方法，如糖基化探针、生物素探针、毛地黄苷标记等。用生物素标记DN
13、A形成探针是目前用得较多的一种，它可以采用酶促或光促生物素来标记核酸。酶促法是利用缺口转移的方法，但标记前体不是32PdTTP，而是用嘧啶环C5位连接了生物素的dTTP（或dUTP），它可以有效地掺入DNA中形成生物素探针。光促法使用的试剂为光敏生物素乙酸盐，它是由光敏基团、连接臂和生物素组成的。光敏基团可在光照下活化，与核酸的碱基结合，连接臂可以降低生物素基团对核酸杂交的空间位阻；生物素用做标记物。将待标记的核酸（DNA或RNA）与光敏生物素乙酸盐混合，在近紫外的光源（如高压汞灯、碘钨灯）下照射1520分钟，就可将生物素标记在单链或双链的DNA或RNA上，形成稳定的共价结合。标记好的生物素探
14、针，可用于核酸的杂交反应，然后用亲和素-酶系统来显示。亲和素可以特异地与生物素结合，酶可与底物反应进行显色或化学发光，这就相当于放射性同位素探针杂交后的放射自显影。最常用的工具酶是辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）。非放射性方法进行核酸杂交，其灵敏度不如放射性方法高，但非放射性探针具有安全、稳定、使用方便等优点，是一种正在发展很有前途的方法。6.3 利用免疫学方法筛选利用免疫学方法筛选 免疫学方法专一性很强、灵敏度很高，其基本原理是：以目的基因在宿主细胞中的表达产物（多肽）作抗原，以该基因产物的免疫血清作抗体，通过抗原抗体反应将目的基因克隆检出。免疫学方法可以分为两种：即放射性抗体测
15、定法和免疫沉淀测定法。这些方法最突出的优点是，它们直接检测重组克隆所表达的蛋白产物，能够检测无任何可供选择的表型特征的重组克隆。当然这种方法必须具备有效的特异性抗体。6.3.1 放射性抗体测定法放射性抗体测定法 这一方法所依据的原理为：(1)一种免疫血清含有好几种特异性抗体（IgG），它们识别抗原分子上的不同定子，并分别同各自识别的抗原定子相结合；(2)抗体分子或抗体的F(ab)部分，能够十分牢固地吸附在固体基质（如聚乙烯等塑料制品）上，而不会被洗脱掉；(3)通过体外碘化作用，IgG抗体便会迅速地被放射性同位素125I标记上。放射性抗体测定的主要程序是：(1)首先把转化的菌落涂布在平板上，长出
16、菌落以后，再影印到另一块平板上继续培养，并保留原来的平板作为母板；(2)待影印平板上的菌落长好后，置于含有氯仿饱和气体的容器中使菌落裂解，阳性菌落便释放出抗原；(3)将吸附了未标记IgG抗体的聚乙烯薄膜覆盖在平板表面，如果抗原与抗体具有对应关系，则在薄膜上形成抗原-抗体复合物；(4)取下聚乙烯薄膜，再用125I 标记的IgG处理，125I-IgG便会与结合在聚乙烯薄膜上的抗原决定簇结合；(5)漂洗聚乙烯膜除去过剩的125I-IgG，干燥后进行放射性自显影判断结果，并从母板上获得相应的重组克隆。对于能够分泌表达产物的重组体克隆，可以省去影印平板、裂解菌落等程序，操作更为简化。例如分泌胰岛素重组体
17、克隆的筛选：在放射免疫分析法基础上，最近又发展了一类非放射性免疫分析技术，例如荧光免疫分析、酶免疫分析以及化学发光免疫分析等。这些方法具有和放射免疫法相同的灵敏度和特异性，而且没有象同位素那样的半衰期短和安全防护问题，是一类很有发展前途的检测技术。6.3.2 免疫沉淀测定法免疫沉淀测定法 相对于放射性免疫法，该方法灵敏度要低，而且易受干扰，但它的价值在于实验简便易行。其做法是：在生长菌落的琼脂培养基中，加入专门抗这种蛋白质分子的特异性抗体。如果有些菌落的细菌会分泌出某种蛋白质，那么在它的周围就会出现一条叫做沉淀素的抗体-抗原沉淀物所形成的白色的圆圈。上述方法的缺点是只能检测分泌出细胞的蛋白质；
18、经两项轻微的改良后，也可以用来检测非分泌的蛋白质。第一种改良方法是：采用对 cI857噬菌体溶源性的大肠杆菌细胞作寄主，它含有在42下会发生热失活的热敏感阻遏物。把生长着待检测菌落的原培养基平板，影印到加有抗体的琼脂平板上，等到影印平板中的菌落长到肉眼可以辨认的大小时，将培养温度上升到42，经过1 h之后，平板中就会有许多细胞被热诱导发生溶菌作用。于是细胞的内含物便被释放出来，分布在周围的培养基中，其中目的基因编码的蛋白质就会同加在培养基中的抗体发生反应，并在菌落的周围形成一圈沉淀素带。第二种改良方法是：将补加有抗体和溶菌酶的琼脂，小心地倾注到菌落的上面，并使之凝固。在溶菌酶的作用下，处于菌落
19、表面的细胞发生溶菌反应，逐步地释放出细胞内部的蛋白质。如果有某些菌落的细胞能够分泌出目的基因编码的蛋白质，它们就会同包含在琼脂培养基中的抗体发生反应，形成沉淀素圈。6.4 转译筛选法转译筛选法 转译筛选法可分为杂交阻断转译法（HART）和杂交释放转译法（HRT）两种不同的筛选策略。它们的突出优点是，能够将克隆的DNA同所编码的蛋白质产物之间的关系对应起来。这两种方法都要通过无细胞转译系统检测经处理后的mRNA的生物学功能，常用的有麦胚提取物系统、网织红细胞提取物系统。6.4.1 杂交阻断转译法（杂交阻断转译法（HART）这种方法又称杂交抑制的转译筛选法，其依据的原理是：在体外无细胞的转译体系中
20、，mRNA一旦同DNA分子杂交之后，就不能够再指导蛋白质多肽的合成，即mRNA的转译被抑制了。在高浓度甲酰胺溶液的条件下（这种溶液既有利于DNA-RNA的杂交，同时又能抑制质粒DNA的再联合），将从转化的大肠杆菌菌落群体或噬菌体群体中制备来的带有目的基因的重组质粒DNA，变性后同未分部的总mRNA进行杂交。从杂交混合物中回收的核酸，加入到无细胞转译体系进行体外转译，由于其中加有35S标记的甲硫氨酸，因此转译合成的多肽蛋白质，可以通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影进行分析。并把其结果同未经杂交的mRNA的转译产物作比较，从中便可以找到一种其转录合成被抑制了的mRNA，这就是同目的基因变性DNA互
21、补而彼此杂交的那种mRNA。根据这种目的基因编码的蛋白质转译抑制作用，就可筛选出含有目的基因的重组体质粒的大肠杆菌菌落群体或噬菌体群体。阻断转译杂交法是一种很有效的检测手段，它能从总mRNA逆转录产生的cDNA群体中检出所需要的目的cDNA，因而特别适用于那些高丰度的mRNA。6.4.2 杂交释放转译法（杂交释放转译法（HRT）这种方法又称杂交选择的转译筛选法，是一种更为敏感的方法，而且可以检出低丰度的mRNA（占总mRNA的1），它与阻断转译杂交的原理相似。其主要程序是：首先将克隆DNA结合到硝酸纤维素滤膜上，再与未经分离纯化的mRNA或细胞的总RNA杂交；然后漂洗滤膜，在低盐缓冲液或甲酰胺
22、的缓冲液中加热，把杂交的mRNA洗脱下来（即把mRNA释放出来）；再用回收的mRNA进行体外转译试验，用聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影分析鉴定转译产物，同时亦可测定蛋白产物的生物活性，以达到筛选所需基因的目的。6.5 物理筛选法物理筛选法 6.5.1 凝胶电泳筛选法凝胶电泳筛选法 带有插入片段的重组体在分子量上会有所增加，因而一种直截了当的方法是分离质粒的DNA并测定其分子长度。对此，电子显微镜是有效的方法，但过于繁琐，通常用操作程序比较简单的凝胶电泳法进行检测。由于质粒DNA的电泳迁移率是与其分子量大小成比例的，根据在凝胶中迁移速度的差别，即可鉴定出含有外源DNA插入序列的重组体菌落。有些假
23、阳性转化菌落（如自我连接载体、缺失连接载体、未消化载体、两个互相连接的载体，以及两个外源片段插入的载体等转化的菌落），用平板法筛选是无法鉴别的，但可以被电泳法淘汰。因为由这些转化菌落分离的质粒DNA分子的大小各不相同：和真正的阳性重组体DNA比较，前三种重组DNA分子较小，在电泳时的泳动率较快，其DNA带的位置跑在阳性重组DNA带的前面；后两种重组DNA分子较大，泳动率较慢，其DNA带的位置跑在阳性重组DNA带的后面。所以电泳法能筛选出有插入片段的阳性重组体。如果插入片段是大小相近的非目的基因片段，对于这样的假阳性重组体，电泳法仍不能鉴别，只有进一步用Southern blot杂交，即以目的基
24、因片段制备的放射性探针和电泳筛选出的重组体DNA杂交，才能最终确定真阳性重组体。Southern blot：由E.southern于1975年创立的杂交方法：将琼脂糖凝胶上的DNA 片段按照原有顺序转移到硝酸纤维素薄膜上并固定起来，然后与P32标记的DNA或RNA探针杂交，用放射自显影确定杂交带。Northern blot:类似于Southern blot的RNA分子杂交技术,与Southern blot的主要区别是在变性剂的存在下，将琼脂糖凝胶上的RNA 片段按照原有顺序转移到硝酸纤维素薄膜上，然后与P32标记的RNA探针杂交，用放射自显影确定杂交带。Western blot:是转移蛋白质到
25、硝酸纤维薄膜上，以亲和反应或免疫反应或结合反应测定蛋白质的技术。蛋白质用聚丙烯酰胺凝胶进行电泳并染色。6.5.2 R-环检测法环检测法 R-环指的是RNA通过取代与其序列一致的DNA链而与双链DNA杂交，被取代的DNA单链与RNA-DNA杂交双链所形成的环状结构（被取代的原DNA链在杂交区呈突出的环状）。R-环的形成是因为：在70%甲酰胺溶液中，当接近DNA变性温度时，杂交双链DNA-RNA分子比双链DNA-DNA分子更稳定。因此，仔细控制形成R-环的条件，将RNA及DNA相互混合，RNA便会同它的双链DNA分子中的互补序列退火形成稳定的DNA-RNA杂交分子，而使被取代的另一链处于单链状态。R-环结构一旦形成就十分稳定，而且可以在电子显微镜下观察到。所以应用R-环检测法，可以鉴定出双链DNA中存在的与特定RNA分子同源的区域。根据这样的原理，在有利于形成R-环的条件下，使待检测的纯化的质粒DNA，在含有mRNA分子的缓冲液中进行局部地变性。如果质粒DNA分子上存在着与mRNA探针互补的序列，那么这种mRNA就将取代DNA分子中的相应的互补链，形成R-环结构。然后在电子显微镜下观察，便可以检测出重组体质粒的DNA分子。演讲完毕，谢谢观看！