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1、预习重点：1.蛋白质的功能 2.氨基酸组成、分类、两性解离3.氨基酸的分离分析4.蛋白质的一级结构、肽键和肽链5.维持蛋白质构象的化学键 6.蛋白质的二级结构7.蛋白质的结构与功能学习难点：1.谷胱甘肽 2.蛋白质一级结构的测定3.基序、三级结构、四级结构4.蛋白质合成基本原理5.蛋白质的性质6.蛋白质分离纯化7.蛋白质纯度鉴定第1页/共87页第一节第一节蛋白质是生命的物质基础蛋白质是生命的物质基础第2页/共87页一、蛋白质是构成生物体的基本成分第3页/共87页二、蛋白质具有多样性的生物学功能生物催化作用（酶）代谢调节作用（激素）免疫保护作用（抗体）转运和贮存作用（血红蛋白)运动与支持作用（肌
2、动蛋白、胶原蛋白）控制生长和分化作用（核蛋白）接受和传递信息作用（受体蛋白）生物膜的功能第4页/共87页第5页/共87页第二节蛋白质的化学组成第6页/共87页 各种蛋白质的含氮量很接近，平均为各种蛋白质的含氮量很接近，平均为1616。100克样品中克样品中蛋白质的含量蛋白质的含量(g%)=每克样品含氮每克样品含氮克数克数 6.25100 凯氏定氮法测定蛋白质含量:定氮仪一.蛋白质的元素组成：第7页/共87页二、蛋白质结构的基本单位氨基酸组成蛋白质的氨基酸共有组成蛋白质的氨基酸共有2020种，称为种，称为基本氨基酸基本氨基酸。（一）基本氨基酸（一）基本氨基酸的结构通式的结构通式CHCOOHRH2
3、N不同的-氨基酸，其R 侧链不同除甘氨酸、脯氨酸外，基本氨基酸皆为除甘氨酸、脯氨酸外，基本氨基酸皆为L-L-氨基酸氨基酸。第8页/共87页2020种氨基酸的分类：根据种氨基酸的分类：根据R R基不同，分为基不同，分为4 4类类甘氨酸甘氨酸 glycine Gly G 5.97丙氨酸丙氨酸 alanine Ala A 6.00缬氨酸缬氨酸 valine Val V 5.96亮氨酸亮氨酸 leucine Leu L 5.98异亮氨酸异亮氨酸 isoleucine Ile I 6.02苯丙氨酸苯丙氨酸 phenylalanine Phe P 5.48脯氨酸脯氨酸 proline Pro P 6.30
4、1、非极性疏水性氨基酸、非极性疏水性氨基酸2第9页/共87页色氨酸色氨酸 tryptophan Try W 5.89丝氨酸丝氨酸 serine Ser S 5.68酪氨酸酪氨酸 tyrosine Try Y 5.66 半胱氨酸半胱氨酸 cysteine Cys C 5.07 蛋氨酸蛋氨酸 methionine Met M 5.74天冬酰胺天冬酰胺 asparagine Asn N 5.41 谷氨酰胺谷氨酰胺 glutamine Gln Q 5.65 苏氨酸苏氨酸 threonine Thr T 5.60 2、极性中性氨基酸、极性中性氨基酸第10页/共87页天冬氨酸天冬氨酸 aspartic a
5、cid Asp D 2.97谷氨酸谷氨酸 glutamic acid Glu E 3.22赖氨酸赖氨酸 lysine Lys K 9.74精氨酸精氨酸 arginine Arg R 10.76组氨酸组氨酸 histidine His H 7.593、酸性氨基酸、酸性氨基酸4、碱性氨基酸碱性氨基酸第11页/共87页（三）、氨基酸的化学性质 两性解离与等电点两性解离与等电点 紫外吸收性质紫外吸收性质 茚三酮反应茚三酮反应第12页/共87页.两性解离氨基酸在水溶液和晶体状态主要以氨基酸在水溶液和晶体状态主要以兼性离子兼性离子形式存在形式存在CHRCOOH3N+第13页/共87页等电点的定义：等电点的
6、定义：当溶液处于某一当溶液处于某一pHpH值时，值时，氨基酸分子中所含的氨基酸分子中所含的-NH-NH3 3+和和-COO-COO-数目正数目正好相等，净电荷为好相等，净电荷为0 0。这一。这一pHpH值即为氨基值即为氨基酸的等电点，简称酸的等电点，简称pIpI。每种氨基酸都有特定的等电点。在等电点时，每种氨基酸都有特定的等电点。在等电点时，氨基酸的溶解度最小。氨基酸的溶解度最小。等电点第14页/共87页COOCHH3N+R+OH+H+COOCHH2NR+OH+H+在酸性溶液中在酸性溶液中（pH pI）在水溶液中在水溶液中（pH=pI）在碱性溶液中在碱性溶液中（pHpI）COOHCHH2NR溶
7、液溶液pHpH影响氨基酸的羧基与氨基的解离程度影响氨基酸的羧基与氨基的解离程度第15页/共87页COOCHH3N+CH3 K1COOHCHH3N+CH3COOH2NCH3 K2Ala+Ala AlaHCCOOHC HH3N+CH2COOHCOOCHH3N+CH2COOHCOOCHH2NCH2COOAsp+Asp Asp Asp=K1 K2 K3CCCH2COON+3HOOH举例：第16页/共87页.紫外吸收在紫外区在紫外区酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸光能力有吸光能力。苯丙氨酸的苯丙氨酸的 maxmax259nm259nm酪氨酸的酪氨酸的 maxmax278nm278nm
8、色氨酸的色氨酸的 maxmax279nm279nm蛋白质中含有这些芳香族氨基酸，所以也有紫外吸收能力。一般用紫外分光光度计在280nmnm波长下测定最波长下测定最大光吸收，而测定蛋白质的含量。大光吸收，而测定蛋白质的含量。第17页/共87页 .茚三酮的反应茚三酮的反应A.A.该反应非常灵敏，该反应非常灵敏，测定范围：测定范围：0.5500.550g/ml g/ml B.B.氨基酸与茚三酮，生成的蓝紫色化合物，氨基酸与茚三酮，生成的蓝紫色化合物，在在570nm570nm测定吸光值测定吸光值C.C.脯氨酸、羟脯氨酸与茚三酮生成黄色物质，在脯氨酸、羟脯氨酸与茚三酮生成黄色物质，在440nm440nm
9、处测吸光值处测吸光值应用：应用：A.A.氨基酸定量分析（纸层析法或者薄膜层析法分离）氨基酸定量分析（纸层析法或者薄膜层析法分离）B.B.氨基酸自动分析仪氨基酸自动分析仪第18页/共87页氨基酸的分离与分析氨基酸的分离与分析 自动氨基酸分析仪自动氨基酸分析仪1.1.蛋白质完全酸水解蛋白质完全酸水解2.2.水解液于水解液于PH 2PH 2上样于钠型阳离子交换柱上样于钠型阳离子交换柱3.3.用用PH 3.5 0.2mol/LPH 3.5 0.2mol/L柠檬酸钠溶液洗脱柠檬酸钠溶液洗脱4.4.用用PH 4.25 0.2mol/LPH 4.25 0.2mol/L柠檬酸钠溶液洗脱柠檬酸钠溶液洗脱5.5.
10、分析洗脱谱上各峰的位置和面积，与标准氨基酸图谱比较分析分析洗脱谱上各峰的位置和面积，与标准氨基酸图谱比较分析 P66P66第19页/共87页第三节蛋白质的分子结构第20页/共87页一级结构（决定空间结构）：又叫共价结构或基本结构，指蛋白质中不同氨基酸的种类、数量和排列顺序。（构象）空间结构二级结构三级结构四级结构基序基序结构域结构域（决定功能）（决定功能）第21页/共87页+-HOHNH2-CH-C-N-CH-COOHR2HR1ONH2-CH-CR1OOH NH-CH-CR2OOHH肽键由一分子氨基酸的羧基和另一分子氨基酸氨基缩合脱水而成。概念：概念：肽、肽、二肽、二肽、寡肽、寡肽、多肽、多肽
11、、多肽多肽链链第22页/共87页H2NCN CCOOHRnHHCOR3NHCHCCR1H OOR2NHCHR4NHCH-CON-N-末端末端C-末端氨基酸残基氨基酸残基氨基酸残基:多肽链中的氨基酸参与肽链的形成，已非原来完整的分子，称为氨基酸残基。共价主链：多肽链中的骨干是由氨基酸的羧基与氨基形成的肽链部分规则的重复排列而成，称为共价主链。侧链：多肽链中R基部分，称为侧链。第23页/共87页方向性方向性：书写方式：N端写在左边，C端写在右边命名：从N端到C端CNN 末端：多肽链中有自由氨基的一端C 末端：多肽链中有自由羧基的一端H2NCH2COOHCNHCCCH3OOOHNCH2CHH丙氨酸丝
12、氨酸甘氨酸第24页/共87页一级结构中化学键：肽键（主要）、二硫键（少量）二硫键：由两分子半胱氨酸残基的巯基脱氢而成，存在于肽链内或肽链间 牛核糖核酸酶牛核糖核酸酶C C末端末端N N末末端端第25页/共87页GSHGSH过氧过氧化物酶化物酶H2O2 2GSH 2H2O GSSG GSHGSH还原酶还原酶NADPH+H+NADP+生物活性肽生物活性肽 1.谷胱甘肽谷胱甘肽(GSH)第26页/共87页体内许多激素属寡肽或多肽体内许多激素属寡肽或多肽2.多肽类激素多肽类激素第27页/共87页 二二.蛋白质的一级结构测定蛋白质的一级结构测定1.1.氨基酸组成的分析氨基酸组成的分析蛋白质样品的纯化蛋白
13、质样品的纯化蛋白质分子中多肽链数目的测定蛋白质分子中多肽链数目的测定 氨基酸组成的分析：氨基酸组成的分析：氨基酸自动分析仪氨基酸自动分析仪 含多个亚基的蛋白质，先纯化为单含多个亚基的蛋白质，先纯化为单 个亚基，再测定每个亚基氨基酸组个亚基，再测定每个亚基氨基酸组成成 分析肽链的分析肽链的N-N-末端氨基酸末端氨基酸分析肽链的分析肽链的C-C-末端氨基酸末端氨基酸第28页/共87页N N末端氨基酸分析末端氨基酸分析A.A.二硝基氟苯（二硝基氟苯（DNFBDNFB）法：）法：P70P70B.B.二甲氨基萘磺酰氯法（二甲氨基萘磺酰氯法（DNS-ClDNS-Cl）灵敏度：灵敏度：1 1 1010-9-
14、9molmol。C.C.EdmanEdman法（苯异硫氰酸，法（苯异硫氰酸，PITCPITC法法）：P71P71，蛋白质自动分析仪，蛋白质自动分析仪 D.D.氨肽酶法：氨肽酶法：肽链外切酶，从多肽链的肽链外切酶，从多肽链的N-N-端逐个水解端逐个水解氨基酸氨基酸。第29页/共87页A A.肼解法肼解法:C C末端氨基酸分析末端氨基酸分析B.B.羧肽酶法：羧肽酶法：肽链外切酶，从多肽链的肽链外切酶，从多肽链的C-C-端逐个水解端逐个水解氨基酸氨基酸。第30页/共87页大分子多肽氨基酸顺序的确定：裂解大分子多肽氨基酸顺序的确定：裂解A.A.化学裂解法：化学裂解法：溴化氰裂解法；羟胺溴化氰裂解法；羟
15、胺NHNH2 2OHOH裂解法裂解法 B.B.酶裂法酶裂法:胰蛋白酶，胃蛋白酶等胰蛋白酶，胃蛋白酶等第31页/共87页确定肽段在多肽链中的次序确定肽段在多肽链中的次序：重叠法：重叠法 P72P72 利利用用两两套套或或多多套套肽肽段段的的氨氨基基酸酸顺顺序序彼彼此此间间的的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。1616肽，端肽，端H H 端端 法法裂裂解解：ONS ONS PS PS EOVE EOVE RLA RLA HOWTHOWT 法法裂裂解解：SEO SEO WTON WTON VERL VERL APS APS HOHO 重叠法重叠法确定序列
16、：确定序列：HOWTONSEOVERLAPSHOWTONSEOVERLAPS第32页/共87页核糖体核糖体蛋白质链蛋白质链5.5.核酸推导法核酸推导法第33页/共87页SSNH-OoCCSSOH-OCH2NH3+COO-疏水键二硫键盐键侧链氢键氢键1.1.氢键氢键:由连接在一个电负性大的原子上的氢与另一电负性大的原子相互作用形成；多肽链主链骨架上羰基氧原子与亚氨基的氢原子间形成氢键维持二级结构的主要次级键；侧链间或主链间所生成的氢键是维持三、四级结构的主要化学键之一。2.2.疏水键疏水键:两个非极性基团因避开水相而聚集在一起的两个非极性基团因避开水相而聚集在一起的作用力，维持蛋白质三、四级结构
17、的主要次级键。作用力，维持蛋白质三、四级结构的主要次级键。第35页/共87页盐键：盐键：蛋白质蛋白质分子中分子中带正电带正电荷集团荷集团和负电和负电荷基团荷基团之间静之间静电吸引电吸引所形成所形成的化学的化学键。键。第36页/共87页（二）蛋白质的二级结构（二）蛋白质的二级结构多肽主链原子的局部空间排列。多肽主链原子的局部空间排列。即即多肽链的主链骨架中若多肽链的主链骨架中若干干肽单位肽单位，各自沿一定的轴盘旋或折叠，并以，各自沿一定的轴盘旋或折叠，并以氢键氢键为主要为主要次级键形成有规则的构象。次级键形成有规则的构象。肽单位：肽键与相邻的两个碳原子所组成的基团，又称肽平面。CCN COH第3
18、7页/共87页肽键具有部分双键性质，不能自由旋转；肽单位是刚性平面结构，肽单位的6个原子都位于同一平面上；肽单位的特点：第38页/共87页-螺旋结构螺旋结构-折叠折叠结构结构 -折角折角蛋白质二级结构构象的种类：第39页/共87页角蛋白中的角蛋白中的-螺旋和二硫键螺旋和二硫键第40页/共87页（三）基序多肽内顺序上相邻的二级结构在空间折叠中靠近，彼此相互作用，形成有规则的二级结构聚集体。超二级结构的超二级结构的基本形式基本形式：螺旋组合（）折叠组合（）螺旋折叠组合（）第41页/共87页（四）结构域在较大的蛋白质分子中，由于多肽链上相邻的超二级结构紧密联系，进一步折叠形成一个或多个相对独立的致密
19、的三维实体。免疫球蛋白免疫球蛋白G G的立体结构的立体结构第42页/共87页（五）蛋白质的三级结构一条多肽链中所有原子或基团在三维空间的整体排布。主要化学键：疏水键、氢键、盐键第43页/共87页（五）蛋白质的四级结构 由两个或两个以上的多肽链之间相互作用，彼此以非共价键相连而形成更复杂的构象，称为蛋白质的四级结构。每一条多肽链都有完整的三级结构，这每条多肽链称为蛋白质的一个亚基。主要化学键：疏水键、氢键、范德华力、盐键、二硫键第44页/共87页 血红蛋白的一、二、三、四级结构第45页/共87页（一）肽的人工合成 保护（氨基、羧基、侧链活性基团）活化（氨基、羧基）缩合剂（二）胰岛素的人工合成（三
20、）固相肽合成五、肽与蛋白质的人工合成五、肽与蛋白质的人工合成第46页/共87页第47页/共87页 第四节第四节蛋白质的结构与功能蛋白质的结构与功能第48页/共87页蛋白质分子的一级结构是形成空间结蛋白质分子的一级结构是形成空间结构的物质基础。构的物质基础。蛋白质分子特定的天然构象是蛋白质蛋白质分子特定的天然构象是蛋白质生物功能的体现。生物功能的体现。第49页/共87页一、蛋白质一级结构与功能的关系一级结构不同，生物学功能各异加压素H2N-半胱 酪-苯丙-谷胺 天胺 半胱-脯-精-甘-CO-NH2缩宫素H2N-半胱 酪-亮-谷胺 天胺 半胱-脯-异亮-甘-CO-NH2第50页/共87页一级结构中
21、关健部分相同，其功能相同ACTH -ACTH活性必需部分 -丝-酪-丝-24-丝-谷-苯丙-COO-H3N+1 2 3 24 31 33 39 -丝-酪-丝-24-亮-谷-苯丙-COO-H3N+-丝-酪-丝-24-丝-谷胺-苯丙-COO-H3N+-人猪牛第51页/共87页一级结构关键部分的变化，其生物活性也改变多肽或蛋白质 氨基酸位置 相对活性脑啡肽（5肽）衍生物甘2 蛋5D-丙 蛋-CO-NH21 11010P84第52页/共87页一级结构的变化与疾病的关系例：镰刀形红细胞贫血N-val his leu thr pro glu glu C(146)HbS 肽链肽链HbA 肽肽 链链N-val
22、 his leu thr pro val glu C(146)这种由遗传物质这种由遗传物质DNADNA突变引起的、在分子水平上仅存突变引起的、在分子水平上仅存在微观差异而导致的疾病，称为在微观差异而导致的疾病，称为“分子病分子病”。第53页/共87页镰刀形红细胞正常红细胞与镰刀形红细胞的扫描电镜图正常红细胞第54页/共87页二、蛋白质的空间构象与功能的关系二、蛋白质的空间构象与功能的关系1.蛋白质前体活化蛋白质前体活化 P85P852.蛋白质变构蛋白质变构3.蛋白质构象改变与疾病蛋白质构象改变与疾病第55页/共87页当配体与亚基（蛋白）结合后，引起该亚基构象变化，称为变构效应。2、蛋白质变构、
23、蛋白质变构效应第56页/共87页3.3.蛋白质构象改变与疾病蛋白质构象改变与疾病因蛋白质折叠错误或折叠导致构象异常变化引起的疾病，称为蛋白质构象病。疯牛病是由朊病毒蛋白(PrP)引起的一组人和动物神经退行性病变。PrPc-螺旋螺旋PrPsc-折叠折叠 正常正常 疯牛病疯牛病第57页/共87页不同生物与人的不同生物与人的CytcCytc的的AAAA差异差异数目数目生物生物 AAAA差异差异数目数目黑猩猩 0恒河猴 1兔 9袋鼠 10牛、猪、羊、狗 11马 12鸡、火鸡 13响尾蛇 14海龟 15金枪鱼 21角饺 23小蝇 25蛾 31小麦 35粗早链孢霉 43酵母 44 三、蛋白质的结构与生物进
24、化三、蛋白质的结构与生物进化第58页/共87页第五节蛋白质的性质第59页/共87页一、蛋白质分子的大小、形状及分子量的测定分子量10000 蛋白质；10000 多肽 P87胰岛素分子量为胰岛素分子量为54375437，习惯上称为蛋白质，习惯上称为蛋白质形状形状形状形状：根据其不对称常数，将蛋白质分为球形、椭圆：根据其不对称常数，将蛋白质分为球形、椭圆：根据其不对称常数，将蛋白质分为球形、椭圆：根据其不对称常数，将蛋白质分为球形、椭圆 形、纤维状形、纤维状形、纤维状形、纤维状 分子量测定常用方法分子量测定常用方法：分子筛层析法分子筛层析法 SDS-SDS-聚丙烯凝胶电泳（聚丙烯凝胶电泳（SDS-
25、PAGESDS-PAGE）生物质谱生物质谱第60页/共87页.分分子子筛筛层层析析法法测测定定蛋蛋白白质质分分子子量量大大小小凝胶颗粒收集蛋白质管蛋白质混合物大分子从柱上面加缓冲溶液小分子洗脱体积（Ve）凝胶柱大分子小分子Ve1Ve2V0第61页/共87页.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量大小第62页/共87页3.3.生物质谱（生物质谱（MSMS）测定蛋白质分子量大小）测定蛋白质分子量大小第63页/共87页二、蛋白质的变性 某些理化因素使蛋白质分子的空间构象发生改变或破坏，导致其生物活性的丧失和一些理化性质的改变的现象。变性的本质 破坏非共价键和二硫键，破坏非共价键和二硫键，不改变蛋
26、白质的一级结构不改变蛋白质的一级结构第64页/共87页变性作用的因素变性作用的因素物理因素：高温、紫外线、X-射线、超声波、剧烈振荡等化学因素：强酸、强碱、尿素、去污剂、重金属、三氯醋酸、浓酒精等变性作用的意义变性作用的意义变性的特征：变性的特征：生物活性的丧失某些理化因素的改变溶解度降低，易沉淀溶解度降低，易沉淀不对称性增加不对称性增加粘度增加粘度增加扩散系数降低扩散系数降低分子结构松散，易被水解分子结构松散，易被水解第65页/共87页 天然状态，天然状态，有催化活性有催化活性 尿素、尿素、-巯基乙醇巯基乙醇 去除尿素、去除尿素、-巯基乙醇巯基乙醇非折叠状态，无活性非折叠状态，无活性第66页
27、/共87页三、蛋白质的两性电离及等电点三、蛋白质的两性电离及等电点蛋白质是两性电解质，其解离程度取决于所处蛋白质是两性电解质，其解离程度取决于所处溶液的酸碱度。溶液的酸碱度。l等电点等电点（pI）在在某某一一pH的的溶溶液液中中，蛋蛋白白质质所所带带正正负负电电荷荷相相等等，净净电电荷荷为为零零，此此时时溶溶液液的的pH值值称称为为该蛋白质的该蛋白质的等电点。等电点。第67页/共87页 CHNH2COOHRpH=pI+OH-pHpI+H+NH3+COO-CHNH2COO-R+OH-+H+pHpICH COOHRNH3+蛋白质的兼性离子蛋白质的兼性离子阳离子阳离子阴离子阴离子R CH第68页/共
28、87页四.蛋白质的胶体性质+带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质水化膜水化膜水化膜水化膜蛋白质形成亲水胶体的因素：蛋白质形成亲水胶体的因素：蛋白质表面有水化层蛋白质表面有水化层蛋白质表面具有同种电荷蛋白质表面具有同种电荷第69页/共87页五、蛋白质的沉淀反应五、蛋白质的沉淀反应蛋白质分子从溶液中析出的现象，称为蛋白蛋白质分子从溶液中析出的现象，称为蛋白 质的沉淀。质的沉淀。1.1.中性盐沉淀：硫酸铵、氯化钠中性盐沉淀：硫酸铵、氯化钠2.2.有机溶剂沉淀反应：乙醇、苯酚有机溶剂沉淀反应：乙醇、苯酚3.3.加热沉淀反应：加热沉淀反应：4.4.重金属盐沉淀反应：重金属中毒
29、重金属盐沉淀反应：重金属中毒5.5.生物碱试剂：药检（三氯醋酸生物碱试剂：药检（三氯醋酸）第70页/共87页六、蛋白质的颜色反应六、蛋白质的颜色反应 P93P931.1.茚三酮反应：氨基茚三酮反应：氨基2.2.双缩脲反应：双缩脲反应：肽键肽键3.3.酚试剂反应：酪氨酸、酚试剂反应：酪氨酸、色氨酸色氨酸第71页/共87页七、蛋白质的免疫学性质1.抗原，抗原性2.抗体 单克隆抗体 多克隆抗体3.蛋白质免疫性质的应用 免疫预防：疫苗 免疫、诊断治疗第72页/共87页二、蛋白质的分离与纯化 利用不同蛋白质溶解度不同、分子大小不同、电离性质不同、配基特异性不同确定使用利用不同蛋白质溶解度不同、分子大小不
30、同、电离性质不同、配基特异性不同确定使用不同的纯化方法不同的纯化方法第73页/共87页（一）利用溶解度不同的分离纯化方法 1.1.等电点沉淀等电点沉淀2.2.盐析沉淀盐析沉淀3.3.低温有机溶剂沉淀法低温有机溶剂沉淀法4.4.温度对蛋白质溶解度的影响温度对蛋白质溶解度的影响 0-40 0-40 0-40 0-40之间，大部分蛋白质溶解度随温度升高而增加，之间，大部分蛋白质溶解度随温度升高而增加，之间，大部分蛋白质溶解度随温度升高而增加，之间，大部分蛋白质溶解度随温度升高而增加，40-5040-5040-5040-50以上以上以上以上开始变性而沉淀。因此蛋白质分离一般在开始变性而沉淀。因此蛋白质
31、分离一般在开始变性而沉淀。因此蛋白质分离一般在开始变性而沉淀。因此蛋白质分离一般在0000或更低的温度下进行。或更低的温度下进行。或更低的温度下进行。或更低的温度下进行。第74页/共87页超过滤超过滤加压加压蛋白质溶液半透膜支持膜的栅板超滤液半透膜袋半透膜袋蛋白质溶液蛋白质溶液透析液透析液磁棒磁棒 磁力搅拌器磁力搅拌器 透析（二）根据分子大小不同的分离纯化方法（二）根据分子大小不同的分离纯化方法1.透析和超过滤 2.凝胶过滤3.密度梯度离心第75页/共87页2.2.分子排阻层析分子排阻层析未知未知logMrlogMr洗出洗出液中液中的蛋的蛋白质白质浓度浓度洗脱体积（洗脱体积（mLmL）第76页
32、/共87页层析的主要设备层析的主要设备第77页/共87页3.密度梯度离心法滴加样品滴加样品蔗糖密度梯度蔗糖密度梯度蔗糖浓度蔗糖浓度 CsCl密度梯度离心第78页/共87页（三）根据电离性质不同的分离纯化方法1.1.电泳法：电泳法：带点质点在电场中向电荷相反的方向移动。醋酸纤维膜电泳醋酸纤维膜电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 等电聚焦电泳等电聚焦电泳 免疫电泳免疫电泳 二维电泳二维电泳2.2.离子交换层析：离子交换层析：离子交换纤维素、离子交换纤维素、离子交换凝胶、离子交换凝胶、大孔型离子交换树脂大孔型离子交换树脂第79页/共87页等电聚焦电等电聚焦电泳泳第80页/共87页2.离离子子
33、交交换换层层析析分分离离蛋蛋白白质质蛋白质浓度洗脱体积带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质收集样品的管收集样品的管带负电荷的蛋白质蛋白质混合物玻璃柱带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质收集样品的管NaClNaCl梯度第81页/共87页（五）利用配体的特异性亲和力的纯化方法（五）利用配体的特异性亲和力的纯化方法应用 分离纯化酶、抗原、抗体 分离纯化核酸 研究酶的结构与功能+待纯化分子配体a.理论依据：待纯化分子和配体间具有亲和性+基质b.活性基质与配体结合产生亲和吸附剂+杂质c.待纯化分子与亲和吸附剂结合，与杂质分离+d.偶联复合物经解离后，得到纯的待纯化分子基质 纤维素、聚丙烯酰胺凝胶
34、、sepharose、sephadex第82页/共87页亲和层析原理示意图蛋白质混合物配体与配体结合的蛋白质加入的可溶性配基专一性结合蛋白质没有结合的蛋白质非专一性结合蛋白质蛋白质浓度洗脱体积与配体专一性结合蛋白质加入配基基质第83页/共87页1.蛋白质的纯度鉴定 蛋白质纯度鉴定通常采用物理化学的方法：层析法、电泳法、免疫化学法。蛋白质纯度鉴定通常采用物理化学的方法：层析法、电泳法、免疫化学法。1.1.层析纯 2.电泳纯：电泳图谱只呈现一个条带（或 峰）；HPCE 3.免疫纯第84页/共87页2.蛋白质的含量测定的方法 凯氏定氮法凯氏定氮法 FolinFolin一酚试剂法（一酚试剂法（LowryLowry法）法）双缩脲法双缩脲法 紫外分光光度法紫外分光光度法 BCABCA法法 BradfordBradford蛋白分析法蛋白分析法 第85页/共87页作业1.蛋白质的功能2.蛋白质结构与功能的关系3.蛋白质的变性定义、本质、特征、意义4.氨基酸两性离解第86页/共87页感谢您的观看！第87页/共87页