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1、主要内容主要内容一、食品辐照的现状及辐照食品的检测原理一、食品辐照的现状及辐照食品的检测原理（一）背景（二）检测的基本原理二、检测方法介绍二、检测方法介绍（一）GB/T21926-2008辐照含脂食品中2-十二烷基环丁酮测定气相色谱/质谱法（二）GB/T23748-2009辐照食品的鉴定DNA彗星试验法筛选法（三）其他方法三、实际案例三、实际案例第1页/共106页第一部分：食品辐照的现状及检测原理第一部分：食品辐照的现状及检测原理（一）背景（一）背景什么是辐照什么是辐照（Irradiation）？辐照是指将电子加速器（0.2MeV10MeV）产生的电子线或放射性同位素（137Cs或60Co）产
2、生的射线的能量转移给被辐照物质，通过控制辐射强度，达到人们所需要的目标:使被辐照物质的物理性能和化学组成发生变使被辐照物质的物理性能和化学组成发生变化化（突变育种、材料改性）使生物体受到不可恢复的损失和破坏使生物体受到不可恢复的损失和破坏（灭菌、杀虫）。第2页/共106页辐照效应（一）辐照效应（一）辐照物理学效应辐照物理学效应射线与物质的作用光子、光电子、康普顿散射等电子射线的作用库仑散射、轫致辐射、契连科夫效应等第3页/共106页辐照的化学效应辐照的化学效应水产生羟自由基,氢自由基H2O2蛋白质导致二硫键、氢键、盐键和醚键等的断裂促使蛋白质的一级结构发生变化发生脱氨基作用、脱羧作用和氧化作用
3、糖类有明显的降解作用和辐解产物形成脂类氧化不饱和脂肪酸，出现脱羧、氢化、脱氨等维生素脂溶性维生素（最敏感：维生素A和E；稳定：维生素D）；水溶性维生素（最敏感：维生素B1和C）辐照效应（二）辐照效应（二）第4页/共106页辐照效应（三）辐照效应（三）辐照的生物学效应辐照的生物学效应食品辐照的生物学效应与生物机体内的化学变化有食品辐照的生物学效应与生物机体内的化学变化有关关微生物直接控制或杀灭食品中的腐败性微生物及致病微生物（细菌、酵母与霉菌、病毒）虫类昆虫、寄生虫果蔬抑制呼吸高峰、改变果蔬中的化学成分、影响新鲜蔬菜代谢反应第5页/共106页根据2003年9月712日在美国芝加哥召开的国际第十四
4、届国际辐射加工年会提供的信息食品辐照食品辐照 45%灭菌：医疗保健用品21%、药品4%、包装材料灭菌11%聚合物改性6%仿形部件2%烟道气处理7%天然植物化学功能食品5%辐照技术在各行业的应用辐照技术在各行业的应用第6页/共106页为什么要对食品进行辐照处理？为什么要对食品进行辐照处理？1.灭菌灭菌除虫除虫消灭食品中的微生物，寄生虫消灭食品中的微生物，寄生虫食品中往往存在造成食品腐败和引起食源性疾病的生物，而辐照产生的r射线具有极强的穿透性和电离能力，可以通过直接或间接的作用(自由基)破坏细胞的结构分子以及DNA，导致微生物/寄生虫死亡。实例实例：辐照后的粮食3年内不会生虫；肉禽类食品经过辐照
5、处理，可全部消灭霉菌、大肠杆菌等腐败性和致病性微生物；一般真空包装下,24时鲜肉的保质期是5-7天，而利用辐照处理后，在24下保质期为30天。第7页/共106页2.抑制发芽抑制发芽,延缓成熟延缓成熟蔬菜、水果在采摘后有一段休眠期，休眠期过后又会恢复生长，发芽，有些农产品一旦发芽，就不能食用或丧失原有的食用价值。如土豆（产生剧毒的龙葵素）、大蒜、洋葱（无原先的食用价值）等。辐照辐照通过破坏酶赖以生存的附着水环境，降低或钝化酶的活性，从而抑制上述农产品发芽，延长保质期。实例：一般土豆常温保存40天，发芽率100%；而吸收0.1kGy辐照剂量后，常温保存300天，无发芽现象。第8页/共106页水果采
6、收后仍是活得有机体，继续进行着一系列生理生化过程（后熟），很多营养成分被消耗掉。辐照酶，受体蛋白250-350Gy对未成熟的香蕉照射，可使成熟期推迟16天；用250Gy照射芒果，使成熟期推迟16天；用2kGy或更高的剂量照射草莓，使草莓在5摄氏度下，延长货架时间5-8天。第9页/共106页3.其它作用：其它作用：降解食品中残留的农兽药氯霉素（河虾、蜂蜜），菊酯，氨基甲酸酯（苹果汁）改善食品品质加速陈化（酒）；肉质鲜嫩可口（牛肉）；消化吸收（大豆）；缩短复水时间（脱水食品）；改进烘烤质量（面粉）实例：用0.8kGy和1.3kGy剂量辐照的两种白兰地酒，存放3月后品尝鉴定，其酒质相当于3年老酒。第
7、10页/共106页水果采收后仍是活得有机体，继续进行着一系列生理生化过程（后熟），很多营养成分被消耗掉。辐照酶，受体蛋白250-350Gy对未成熟的香蕉照射，可使成熟期推迟16天；用250Gy照射芒果，使成熟期推迟16天；用2kGy或更高的剂量照射草莓，使草莓在5摄氏度下，延长货架时间5-8天。第11页/共106页辐照目的与效果及相对应的剂量范围辐照目的与效果及相对应的剂量范围第12页/共106页食品辐照技术的特点食品辐照技术的特点1.节能节能据国际原子能机构（IAEA）统计：每吨冷藏食品能耗为3.2*108J；热杀菌法能耗1.1*109J；辐照法为2.2*107J，比常规方法节能十几倍到几十
8、倍。第13页/共106页2.冷加工冷加工常规的热杀菌、微波、气流式过热蒸汽等常常造成食品内部分子热运动加剧，丧失食品原有的色香味甚至营养成分。（如香辛料、冷藏/冻肉、新鲜蔬菜等）辐照方法属于冷加工，可以在常温或者低温下进行，在食品辐照过程中一般升温很小。如0.1-1kGy辐照大多数蔬菜，水果，通常升温最高不超过1。食品辐照技术的特点食品辐照技术的特点第14页/共106页3.穿透力强，灭杀彻底穿透力强，灭杀彻底多数食品的病原性细菌，经80短时间巴氏消毒后仍能生长；药剂处理则只对食品表面的杀菌有效，深层病菌无法杀灭。辐照具有较强的穿透力，如60Co的r射线在水中的半减弱层为11cm水层，因而可以在
9、包装下以及不解冻情况下辐照食品，并包装下以及不解冻情况下辐照食品，并深入到食品内部深入到食品内部，杀灭隐藏很深的病菌，害虫，寄生虫和微生物，达到长期保存目的。食品辐照技术的特点食品辐照技术的特点第15页/共106页4.无化学残留无化学残留常规熏蒸（环氧乙烷、溴甲烷）、添加防腐剂等方法会有化学药剂和添加剂的残留导致食品品质改变。辐照不需化学添加剂，不存在残留毒性，也不会产生感生放射性，不污染环境。食品辐照技术的特点食品辐照技术的特点第16页/共106页食品辐照的安全性评价（一）食品辐照的安全性评价（一）不会诱发放射性：不会诱发放射性：射线能量诱发阈能诱发放射性；60Co-1.25MeV；137C
10、s-0.66MeV，电子线-10Mev；第17页/共106页食品辐照的安全性评价（二）毒理学没有问题毒理学没有问题国际食品辐照卫生安全评价联合专家委员会、国际食品法典委员会于1980年、1999年和2003年宣布：用10kGy以下剂量处理的任何食品，不会产生毒理学上的问题，且超过10kGy剂量的辐照食品也是卫生安全的，无需再进行毒理学实验。有争议部分：有争议部分：辐照后食品可能有基因突变的风险，但科学家们各执一词，没有定论。第18页/共106页 所以，食品辐照技术已经在很多国家获得广泛的所以，食品辐照技术已经在很多国家获得广泛的应用，也成为世贸组织（应用，也成为世贸组织（WTO）认可的食品加工
11、技）认可的食品加工技术。术。（中国国门时报，）截至目前，世界上已有42个国家正式批准了240多种辐照食品的标准，有些国家则严格禁止辐照食品进口。第19页/共106页世界主要国家关于辐照食品的法规世界主要国家关于辐照食品的法规欧盟允许辐照食品种类及辐照剂量欧盟允许辐照食品种类及辐照剂量国别允许辐照食品种类允许辐照剂量欧盟草药、香料和植物调味料 最高10kGy法国 猪肉、大蒜、洋葱、虾（含冷冻）、鱼（含冷冻）、香料、脱水蔬菜、家禽肉荷兰大蒜、洋葱、虾（含冷冻）、马铃薯、家禽肉、蛋白英国豆类、猪肉、大蒜、洋葱、虾（含冷冻）、鱼（含冷冻）、香料、脱水蔬菜、木瓜、草莓、马铃薯、大米、小麦、无菌食品第20
12、页/共106页日本允许辐照食品种类及辐照剂量日本允许辐照食品种类及辐照剂量国别允许辐照食品种类允许辐照剂量日本土豆150Gy（且不允许重复照射）2000年日本香辛料协会申请香辛料允许辐照，但现在还未获批准第21页/共106页澳大利亚、新西兰允许辐照食品种类及辐照剂澳大利亚、新西兰允许辐照食品种类及辐照剂量量国别允许辐照食品种类允许辐照剂量澳大利亚、新西兰栗子、水果类、南美番荔枝、荔枝、龙眼、芒果、山竹果、番木瓜、红毛丹 150Gy-1kGy药草、香辣调味料 2kGy-30kGy药草萃取物（新鲜、干燥或发酵的叶、花或植物的其他部分制造的饮料，茶除外）3kGy-10kGy第22页/共106页美国允
13、许辐照食品种类及辐照剂量美国允许辐照食品种类及辐照剂量国别允许辐照食品种类允许辐照剂量美国新鲜、未加热处理过的猪肉 0.3kGy1kGy干燥或脱水酶制剂 10kGy 干燥或脱水香料 30kGy 新鲜、冷冻或生的禽肉 3kGy 冷冻包装肉类(仅美国国家航空航天局)44kGy 冷冻生肉 4.5kGy 冷冻生肉制品 7kGy 新鲜蛋类 3kGy 种子 8kGy 新鲜或冷冻的软体甲壳类动物 5.5kGy 新鲜水果蔬菜1kGy 第23页/共106页加拿大允许辐照食品种类及辐照剂量加拿大允许辐照食品种类及辐照剂量国别允许辐照食品种类允许辐照剂量加拿大土豆、洋葱 小麦、面粉和全麦粉香料和脱水调味品 芒果0.
14、251.5kGy新鲜禽肉1.53.0kGy冷冻禽肉2.05.0kGy鲜、干或预处理的虾1.53.0kGy冷冻的虾1.55.0kGy鲜牛肉1.54.5kGy冷冻牛肉2.07.0kGy第24页/共106页我国的辐照情况我国的辐照情况我国于1958年开始建造研究用辐照装置（五五期间开始动物实验、六五期间进一步研究），90年代以后辐照技术逐步向食品工业转移。到2005年，我国设计装源能力30万居里（11.1PBq）以上的商用辐照装置已达84座，功率5kw以上的电子加速器为83台；2007年辐照加速器达100台，在建33台，平均每年以15%的速度递增。2005年，辐照食品产值达35亿元，产量达14.5万
15、吨，占世界辐照食品产量(40万吨)的36%，居世界首位，其中辐照香辛料、脱水蔬菜、大蒜及大蒜制品是主要产品，其直接产值超过20亿元，社会效益巨大，近几年又有了进一步的发展。所以，从辐照食品的种类和数量而言，我国是世界上辐所以，从辐照食品的种类和数量而言，我国是世界上辐照食品应用最多的国家之一照食品应用最多的国家之一。第25页/共106页我国辐照食品安全规定允许辐照食品种类允许辐照食品种类 允许辐照剂量允许辐照剂量 标准标准 适用商品适用商品 熟畜禽肉类熟畜禽肉类 低于8kGy GB 14891.1-1997猪肉、牛肉、鸡鸭肉 花粉类低于8kGyGB 14891.2-1994 玉米、荞麦、高梁、
16、芝麻、油菜、向日葵、紫云英的蜜源的纯花粉及混合花粉干果果脯类干果果脯类0.41.0kGyGB 14891.3-1997花生仁、桂圆、空心莲、核桃、生杏仁、红枣、桃脯、杏脯、山楂脯及其他蜜饯类香辛料类香辛料类低于10kGyGB 14891.4-1997 所有品种 新鲜水果、蔬菜新鲜水果、蔬菜 低于1.5kGy GB 14891.5-1997 土豆、洋葱、西红柿、苹果等17种 猪肉 低于0.65kGy GB 14891.6-1994 鲜猪肉冷冻包装畜禽肉类冷冻包装畜禽肉类 低于2.5kGy GB 14891.7-1997 预包装的猪肉、牛肉、鸡鸭肉 豆类、谷类及其制品豆类、谷类及其制品 豆类低于0
17、.2kGy谷类0.40.6kGy GB 14891.8-1997 豆类、谷类及其制品薯干酒 低于4kGy GB 14891.9-1994 薯干酒第26页/共106页此外，与国际上的规定一样，我国自1996年出台辐照食品卫生管理办法，到后来的食品辐照通用技术要求以及2007年实施的食品召回管理规定和2008年新修订的食品标识管理规定法规标准中都有明确指出，凡是经过电离辐射或者电离能量处理过的农产品及食品都要进行标签标注,凡未贴标识的辐照食品一律不准进入国内市场。第27页/共106页食品辐照设施食品辐照设施防护防护 非常重要非常重要尤其是升降源尤其是升降源第28页/共106页保障辐照食品安全性的前
18、提条件前提条件1、辐照剂量和辐照时间监控的需要目前各国普遍认可的剂量是10kGy以下，而高于这个剂量是否会产生一些不安全因素还存在争议。2、非法辐照的监管需要监控辐照灭菌的单位，对其灭菌的品种和操作品种和操作进行监控违法辐照、重复辐照3、标识管理的需要尽管国家早就对此进行了相关规定，但在目前销售的食品上很少会发现有标注辐照食品字样的。给消费者知情和选择的机会是很有必要的，所以这方面的相关监督应该要加强。为什么要对辐照食品进行检测（一）第29页/共106页为什么要对辐照食品进行检测（二）为什么要对辐照食品进行检测（二）4.进出口贸易的需要由于各国的历史、生活习惯及法规差异，目前世界各国允许辐照的
19、食品种类仍差别较大，需要判别出口产品是否满足进口国要求第30页/共106页我国辐照产品在国外被通报的部分情况我国辐照产品在国外被通报的部分情况2005-2006年，我国出口食品先后10次被欧盟食品预警系统通报非法辐照2007年1月26日，中国出口到法国的小龙虾小龙虾被检出非法辐照2007年3月21日，中国出口到英国的人参胶囊人参胶囊、辣味咖喱碗面辣味咖喱碗面、中草药茶中草药茶等被检出非法辐照2007年3月28日，中国出口到意大利的脱水蔬菜脱水蔬菜被检出非法辐照；2007年7月4日，中国出口到英国的1批人参粉末胶囊人参粉末胶囊被检出含有未经批准的辐照成分；2008年2月22日，中国出口到英国的一
20、批花旗参胶囊花旗参胶囊被检出经辐照；2008年6月5日，日本检出中国的一批干香菇干香菇实行了放射线照射处理；2008年6月13日，英国食品标准局要求产自中国经辐照后的酵母粉酵母粉及其产品撤出2008年10月20日，日本检出1批干辣椒干辣椒经过辐照处理；2008年12月-2009年9月，日本先后四次查出我国输日干香菇干香菇经辐照处理；2009年9月7日，日本检出我国一批出口日本的冷冻水煮虾蛄冷冻水煮虾蛄接受过辐照处理；2010年2月4日，芬兰检出中国的裹亚麻籽口味的大豆大豆经辐照处理；2010年2月15日，意大利检出中国的茶补充剂茶补充剂经辐照处理2010年2月17日，芬兰检出中国的减肥茶减肥茶
21、采用了未经批准的辐照处理2010年5月28日，罗马尼亚检出中国出口至欧盟的植物萃取物植物萃取物经过非法辐照越越来来越越频频繁繁第31页/共106页（二）辐照食品检测的基本原理（二）辐照食品检测的基本原理概况：食品辐照剂量一般规定在0.01-10kGy之间，其引起食品的外观、形状、温度及组成上的变化是十分微小的，因此，检测食品是否已被辐照和估测辐照食品的吸收剂量是十分困难的。为此，1989年国际原子能机构组织了为期5年（1989-1994）的辐照食品分析检测方法协调研究，这次协调研究将辐照食品检测方法推向了实际应用，推动了检测方法向国际标准化发展。目前颁布辐照食品检测法定标准方法的国家和组织主要
22、有欧盟、国际食品法典委员会（CAC）、中国和日本。其中以欧盟的标准最为系统。欧盟先后颁布了涉及8个方法（含筛选法）的10个检测方法标准。中国共有6个。第32页/共106页基本思路：逆向证明：基于辐照在食品中产生的物理、化学、生物学和生理学等影响，从辐照后的产物和食品出现的一些微小变化为依据进行检测。根据目标物的特异性程度，检测方法分为初筛初筛和确证确证两种类型。第33页/共106页1.初筛方法的原理初筛方法的原理依据：辐照会引起生物体内的生物体内的DNA损伤、酶活损伤、酶活性钝化等生物效应性钝化等生物效应。着眼点：主要就是利用辐照前后食品表面的微微生物异常状态生物异常状态以及食品分子中食品分子
23、中DNA性状的变化性状的变化来实现检测。第34页/共106页特点：特点：操作简单，快速，高通量局限性：局限性：由于其他消毒、灭菌的处理方法（如熏蒸、加热、冻存）由于其他消毒、灭菌的处理方法（如熏蒸、加热、冻存）也会造成食品中微生物或也会造成食品中微生物或DNA的异常，的异常，所以初筛方法只能从间接的角度表明被检食品可能可能经过辐照，具体的鉴定需要通过确证方法。第35页/共106页2.确证方法的原理确证方法的原理依据：依据：辐照会造成食品中出现含量有明显变化的产物含量有明显变化的产物以及某些特某些特殊的物化特性殊的物化特性；着眼点：着眼点：辐照专一性辐解产物（环丁酮类、碳氢化合物）和存储的能量（
24、动量）等。目前国际上认可的法定确证方法很多，主要有气相色谱、气质联用、热释光、光致发光及电子自旋共振等方法。第36页/共106页第二部分：检测方法的介绍第二部分：检测方法的介绍初筛方法初筛方法直接荧光过滤器/需氧菌平板计数法内毒素/革兰氏阴性菌计数法（LAL/GNB）DNA彗星技术检测法确证方法确证方法针对碳氢化合物的气相色谱检测法针对2-十二烷基环丁酮的气相色谱-质谱检测法热释光检测法（TL）光致发光检测法（PSL）电子自旋共振技术（ESR）检测法其它方法其它方法 黏度（淀粉类）、邻酪氨酸法（蛋白质）、电阻抗法（土豆）、过氧化氢法（酒）、D-2,3-丁二醇法（酒）、发芽率测定法（土豆、大蒜）
25、等第37页/共106页我国现有的辐照食品检测方法标准我国现有的辐照食品检测方法标准NY/T1207-2006辐照香辛料及脱水蔬菜热释光鉴定方法NY/T1390-2007辐照新鲜水果、蔬菜热释光鉴定方法NY/T1573-2007辐照含骨类动物源性食品的鉴定-ESR法GB/T21926-2008辐照含脂食品中2-十二烷基环丁酮测定气相色谱-质谱法GB/T23748-2009辐照食品的鉴定DNA彗星试验法筛选法SN/T2522.1-2010进出口辐照食品检测方法微生物学筛选法第38页/共106页（一）（一）GB/T 21926-2008 辐照含脂食品中辐照含脂食品中2-十二烷基环丁酮测定十二烷基环丁
26、酮测定 气相色谱气相色谱/质谱法质谱法第39页/共106页 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局、中国国家标准化委员会提出。本标准由中国国家标准化管理委员会归口。本标准起草单位：国家农副加工食品质量监督检验中心、安徽国家农业标准化与监测中心。本标准主要起草人：程静、卢业举、赵成仕、舒勇、夏春、王彩霞、邵栋梁、戚爱香。第40页/共106页范围范围规定了辐照含脂食品中2-十二烷基环丁酮的气相色谱/质谱测定方法。适用于辐照含脂食品。检出限为10g/kg（以脂肪计）。研究表明：鸡肉、猪肉、鲜蛋、三文鱼和奶酪等均适用第41页/共106页原理原理2-十二烷基环丁酮是含脂食品中棕榈酸甘油酯经辐照后
27、，酰氧键（酯键）发生断裂，生成2-十二烷基环丁酮。目前，还没有证据表明2-烷基环丁酮在未经辐照的食物中也能被检测到标志性化合物。棕榈酸甘油酯棕榈酸甘油酯2-十二烷基环丁酮十二烷基环丁酮注：若是硬脂酸甘注：若是硬脂酸甘油脂则会产生油脂则会产生2-十十四烷基环丁酮四烷基环丁酮断键成环断键成环第42页/共106页方法的概述方法的概述用正己烷索氏抽提法提取脂肪（含2-十二烷基环丁酮），经过弗洛里柱净化，以气相色谱-质谱检测。第43页/共106页试剂正己烷，乙醚，2-十二烷基环丁酮标准品，无水硫酸钠，弗罗里硅土（60-100目，650烘烤，10%水去活，陈化过夜）仪器和设备气相色谱，索氏提取器，冷冻离心
28、机，玻璃层析柱，均质器弗洛里硅土去活化，陈化重要第44页/共106页检测条件：色谱柱：DB-5MS（m）升温程序：80（1min）15/min150 8/min200 20/min260（2min）选择离子（m/z）监测：9898、55、112不分流进样，1L第45页/共106页取样：优先取脂肪含量高的部分（如鸡皮），对于脂肪含量低的食品要增加被测样品数量。两步索氏提取，两步索氏提取，需需11-17h第46页/共106页索氏抽提法索氏抽提法用无水乙醚或石油醚以索氏提取器提取，蒸去溶剂后得脂肪。试样处理：试样处理：谷物等经粉碎过40目筛，肉用绞肉机绞2次，适当拌以海砂，移入滤纸筒液体或半固体则与
29、海砂混合后在沸水浴上蒸干，在100度左右干燥，研细，装筒。过程：过程：抽提6-12小时，蒸干溶剂，干燥恒重，计算含量GB/T 5009.6-2003 中的脂肪含量的测定中的脂肪含量的测定第47页/共106页简化技巧简化技巧按照标准操作涉及2次索氏提取可以加以简化，使实验步骤更加连贯方法一：取索氏提取干燥后的脂肪200mg，溶于5mL正己烷。7.4方法二：用正己烷索氏提取取一部分提取液测脂肪含量根据计算结果量取200mg脂肪所对应提取液体积7.4第48页/共106页C=ACs/As 第49页/共106页第50页/共106页（二）（二）GB/T 23748-2009 辐照食品的鉴定辐照食品的鉴定
30、DNA彗星试验法彗星试验法 筛选法筛选法第51页/共106页发布部门：中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会发布日期：2009-05-13实施日期：2009-08-01首发日期：2009-05-13起草单位：国家环保产品质量监督检验中心、河北师范大学生命科学学院、中国标准化研究院、湖北出入境检验检疫局检验检疫技术中心起草人：张岩、李玉国、李挥、吕品、崔海容、周正、王丽霞、刘敬泽、郭丽敏、谢乐、刘东、闫蕴力、李丛芬、周巍第52页/共106页标准参照BSEN13784-2002食品DNA彗星试验法鉴定辐照食品筛选法(英文版)制定规定了含DNA辐照食品的DNA彗星试验筛选方法
31、。适用于生鲜肉类、原粮、干果、蔬菜以及香辛料是否辐照的筛选前言前言第53页/共106页原理将含有DNA的食品进行辐照处理时，DNA的一条单链或者双链会出现断裂而产生不同的DNA片段。将样品用琼脂糖固定在显微镜载玻片上后，用去垢剂裂解细胞以破坏细胞膜，然后在设定的电压下进行电泳。各DNA片段从细胞内向阳极方向延伸或迁移，就如同向着阳极方向形成一条尾巴，使被破坏的细胞电泳图看起来像一颗彗星。受到辐照的细胞其DNA（含更多片段）从细胞核到阳极的彗星比未受到辐照的细胞更长一些。未受到辐照的细胞其彗星近似于圆形或只有很短的尾巴第54页/共106页典型的典型的DNA彗星照片，未经辐照的冷冻牛肉的银染结果彗
32、星照片，未经辐照的冷冻牛肉的银染结果 典型的典型的DNA彗星照片，彗星照片，7kGy银染辐照后的冷冻牛肉结果银染辐照后的冷冻牛肉结果 第55页/共106页试剂以及仪器设备试剂以及仪器设备常规的琼脂糖凝胶电泳所需的试剂：电泳缓冲液，裂解缓冲液，EDTA、Tris、吖啶橙、溴化乙锭和碘化吡啶等溶液。水平电泳仪，显微镜（按不同显色方法，配置不同）第56页/共106页试样制备（细胞悬液）试样制备（细胞悬液）动物组织动物组织 1 骨髓骨髓将骨劈裂，取骨髓置在冰冷PBS溶液中，以搅拌使细胞悬浮，过筛布（100m），待用。2 肌肉组织肌肉组织刮取肌肉组织或者用解剖刀将其切成极薄的薄片（不能带有脂肪），放入冰
33、冷PBS溶液中，以搅拌获得悬浮液，过筛布（500m+200m），待用。第57页/共106页植物组织植物组织1 种子、坚果和香料种子、坚果和香料用研钵研碎去壳样品，置于冰冷PBS溶液中，以500转/分钟搅拌。悬浮液顺次通过孔径大小为200m和100m的筛布进行过滤。待用。2 马铃薯、洋葱等马铃薯、洋葱等用解剖刀将样品切成极薄的薄片，同上处理第58页/共106页分析测定分析测定铸胶先用一薄层琼脂糖对载玻片进行预涂层，再将细胞悬浮液与琼脂糖铸胶溶液混合并转移至已预涂层的载玻片上。裂解细胞：使细胞膜成为可渗透膜，便于DNA在电泳时向外迁移电泳染色检测对于吖啶橙染色的片子，荧光显微镜应配备460nm到4
34、85nm（蓝色激发光）的滤波片。被染色的DNA（双链）发绿光，但背景和碎片呈黄色。对于碘化丙啶或溴化乙锭染色的片子，荧光显微镜应装有515nm到560nm（绿色激发光）的滤波片及590nm的光栅。镜下DNA发红光。对于银染的片子，任何标准透射显微镜都可以观察到。首选首选也可以再涂一层琼脂糖，防止悬液中其它电离也可以再涂一层琼脂糖，防止悬液中其它电离成分影响电泳成分影响电泳第59页/共106页结果判断结果判断辐照后的样品一般没有完整的细胞，仅有彗星存在；而未辐照的样品则几乎始终存在一定量的无拖尾或拖尾很少的未损伤细胞。尽管大量的不同形状或长度的细胞也可能在未辐照的样品中检测到，但始终有实际未损伤
35、细胞存在这一特有的现象。第60页/共106页一般通过显微镜下目视，即可将样品分为经辐照或未经辐照。若用图像分析系统则还可对彗星形式作客观的评价。计算彗星的长度、面积、拖尾、彗星头部、尾部等更多的信息第61页/共106页因为通过其他途径也可能得到DNA片段（肉类在酶作用下的DNA自然降解，加热或微波处理后的食品，天然的残核等），所以DNA彗星检测技术只是一种筛选法，其结果需用另一种专门针对辐照样品的检测方法进行确证，注意事项注意事项第62页/共106页（三）其他方法（三）其他方法直接荧光过滤器直接荧光过滤器/需氧菌平板计数法（需氧菌平板计数法（DEFT/APC）内毒素内毒素/革兰氏阴性菌计数法（
36、革兰氏阴性菌计数法（LAL/GNB）针对碳氢化合物的气相色谱检测法针对碳氢化合物的气相色谱检测法热释光检测法（热释光检测法（TL）光致发光检测法（光致发光检测法（PSL）电子自旋共振技术（电子自旋共振技术（ESR）检测法）检测法第63页/共106页1）直接荧光过滤器）直接荧光过滤器/需氧菌平板计数法需氧菌平板计数法（DEFT/APC）原理：利用辐照前后食品中微生物状态的异常变化来进行检测的。其中DEFT通过滤膜减压过滤，在滤膜上获得微生物，以吖啶橙荧光染色表征，DEFT值表示样品中的微生物总数（包括辐照中死亡的微生物）。APC方法得出的则是样品中的活微生物数。在本方法中将由DEFT得到的数据与
37、APC方法的数据进行对比，当两者存在很大差异（4个数量级）时，则表明样品可能受过辐照。第64页/共106页取5g样品加入45ml蛋白胨水中混匀过滤样品悬浮液DEFTAPC取2ml样品过滤液经薄膜过滤器过滤用2mlAO对薄膜过滤器染色2min用2.5ml缓冲液（pH3.0）清洗滤器用2.5ml2-丙醇再次清洗取下并干燥聚碳酸酯纤维滤膜制备DEFT玻片用落射荧光显微镜检测DEFT玻片DEFT计数结果表述：Dc=A-BAPC计数准备系列稀释液用平板计数琼脂进行菌落计数30孵育72h菌落计数（cfu）膜：膜：0.6um和和10um第65页/共106页优点：1.鉴于普通食品中微生物存在的普遍性，这一方法
38、适用性较广，可以用于多香果、胡椒粉、小豆蔻等药草和调味品，也可用于肉、奶、海产品和家禽等食品；2.在一个试验周期内，可以同时操作大量样品，通量大，适于大规模筛查。局限性：1）当样品中的微生物含量很少时（APC103cfu/g）,这种方法会受到限制；2）某些本身含有抑菌成分的香料（如丁香，肉桂，大蒜和芥末）会造成假阳性结果；3）其他可使微生物死亡的食品加工处理方式（熏蒸，加热处理）也会导致相似的DEFT值与APF值之差，因此，筛的阳性结果必须进行确证。第66页/共106页2）内毒素）内毒素/革兰氏阴性菌计数法革兰氏阴性菌计数法（LAL/GNB）原理：原理：LAL/GNB法的原理与DEFT/APC
39、法较为类似，同样依据食品中存在的大量失活微生物组织可以假定为辐照产物的原理，利用样品中活的革兰氏阴性菌数量和样品中革兰氏阴性菌表面的细菌毒素来估算活的革兰氏阴性菌总量与死的革兰氏阴性菌总量，如果两个结果的差异很大,说明样品可能经过辐照处理。第67页/共106页步骤1：检测试验样品中活的革兰氏阴性菌（GNB）的计数。在211的条件下，革兰氏阴性菌在含有乳酸链球菌素、青霉素和结晶紫的选择性培养基中好氧生长，24h1h后形成的菌落数。步骤2：采用鲎变形细胞溶解物法(LAL)检测鉴定试验样品中细菌内毒素的浓度。鲎变形细胞溶解产物（LAL）实验是一种半定量的分析方法，在适宜条件下细菌内毒素激活鲎试剂中的
40、凝固酶，使鲎试剂产生凝集反应形成凝胶。第68页/共106页优点：快速、高通量筛查适用于新鲜的整禽或胸脯、腿、翅膀等部分以及去皮或未去皮的冷藏或冷冻胴体的鉴别，适用于微生物实验室对食品的快速、高通量筛查。局限性：样品中存在的大量死亡微生物组织可能是由多种原因造成的，需要确证；并且辐照后未冷藏的食品中的细菌会再次繁殖，从而影响检测。第69页/共106页3）针对碳氢化合物的气相色谱检测法）针对碳氢化合物的气相色谱检测法原理：在食品所含的脂肪中，脂肪酸甘油酯是主要成分，在辐照过程中，含脂样品中已知结构的脂肪酸（见表1，表2）经辐照会发生化学键断裂，生成少1个碳（Cn-1，烷烃）和少2个碳（Cn-2，烯
41、烃）的辐照产物（见表1，表2），经加热溶出、溶剂萃取或索氏提取等方法获得脂肪，再经弗罗里柱萃取净化、浓缩，以配备氢火焰检测器或质谱的气相色谱仪即可检测。表1表2第70页/共106页优点：适用于含油脂丰富的食品，如鸡肉、猪肉、木瓜、芒果等；本方法的检测限低，对于生肉类、乳酪等食品可达0.5kGy（商业辐照剂量可能稍高），对于新鲜鳄梨、木瓜和芒果检测限为0.3kGy。常规仪器检测，无须特殊仪器；检测限不受样品存储时间的影响。局限性：1）方法只能针对含脂食品，可以检测的食品种类比较有限，2）必须预知食品中所含主要脂肪酸种类和结构，才能确定最终检测的目标化合物；3）饱和碳氢化合物可能为天然存在，会干扰
42、检测，必须与其他预测的不饱和碳氢化合物同时进行判断，尤其当使用溶剂进行提取时，试剂空白是必须要考察的。第71页/共106页4）热释光检测法（）热释光检测法（TL）原理：原理：热释光检测法是目前国际上使用最多的目前国际上使用最多的法定方法，法定方法，这一方法的原理基于含有或沾染硅酸盐粒子(如尘埃)的食品在辐照时，硅酸盐粒子可吸收并稳定能量。当食品中分离出的硅酸盐粒子在控制加热的条件下会释放出吸收的能量，产生荧光。再将同样的样品经固定剂量（通常为1kGy）辐照处理，进而测定其荧光，通过两者比较便可判断样品是否经过辐照。该方法在理论上适用于所有暴露于土壤、风沙中的食品，目前多用于草药、香料及甲壳类动
43、物、新鲜蔬菜、脱水蔬菜和马铃薯的检测。第72页/共106页能量吸收能量吸收辐射能量辐射能量热热 能能能量释放能量释放光光 能能第73页/共106页第74页/共106页发光曲线发光曲线1发光曲线发光曲线2第75页/共106页优点：优点：方法只依赖于食品中的硅酸盐矿物，而与食品种类无关，且所有暴露于土壤或风沙中的食品都不可避免的含有矿物残渣，所以适用性广泛。局限性：局限性：方法的稳定性依赖于样品中的矿物质种类及含量，不同数量不同种类的矿物质（如石英，长石等）在辐照后会显示出截然不同的热释光强度，所以同一样品在固定剂量的再次辐照后的热释光的测定是必需的，造成了检测周期的延长；此外，当样品含有矿物较少
44、时常常导致结果无效，往往需要加大样品量予以改善。第76页/共106页5）光致发光检测法（）光致发光检测法（PSL）原理：原理：光致发光检测法的原理与热释光相近，同样利用食品中普遍存在的矿物残渣（如硅酸盐或生物无机物质）在辐照过程中会通过束缚在结构，空隙或杂质中的电荷载体储存能量，然后通过光刺激释放能量，形成激发光谱。（苏格兰大学环境研究中心研发）第77页/共106页优点：光致发光的特点在于筛查与校正并行，适用于所有含矿物残渣的食品，目前该方法在贝类、草药、香料和调味剂中应用较多，对于贝类食品的检测限可达0.5kGy。局限性1）样品的PSL敏感性取决于单个样品内含有的矿物质的量和类型；2）低矿物
45、质含量的甲壳类动物和香料需进行校正PSL检测以避免假阴性；3）样品中盐的存在会干扰检测信号。第78页/共106页6）电子自旋共振技术（）电子自旋共振技术（ESR）检测法）检测法原理：辐照与食品分子的相互作用是以自由基的形式进行的，当辐照含骨、壳、纤维素等特殊样品体系（固体或干燥成分）时，可产生较长寿命的自由基，这些自由基所含的未成对电子具有净电子自旋角动量（即具有能级差的电子自旋或顺磁中心），当微波与之作用时，会产生共振吸收光谱，可用电子自旋共振（ESR）波谱仪测定。这一原理导致了ESR技术在含骨，纤维素及晶体糖的辐照食品检测中获得广泛应用。第79页/共106页图图A.1未经辐照的芒果干样品的
46、典型未经辐照的芒果干样品的典型ESR光谱光谱图图A.2经辐照的芒果干（经辐照的芒果干（3.0kGy）的典型）的典型ESR光谱光谱第80页/共106页优点准确灵敏，对于羟磷灰石含量高的样品检测限低；加热或长时间存储对检测结果无明显影响。鱼类的检测限可达0.5kGy，对于开心果壳可达2kGy，辣椒粉为5kGy，鲜草莓为1.5kGy，无花果干、芒果干、番木瓜干和葡萄干为0.5kGy。局限性方法的检测限和稳定性受样品中羟磷灰石的矿化度和结晶度、纤维素晶体的结构和含水量、干燥程度的影响；此外，样品在粉碎过程中可能产生自由基，从而干扰检测。第81页/共106页第82页/共106页纵观目前的辐照检测方法，由
47、于食品的成分复杂，不同成分对辐照的反应存在差异，所采用的检测方法各不相同；且方法通用性较差。目前，辐照食品检测的思路：初筛+确证多种手段相结合进行检测小结小结第83页/共106页三、实际案例三、实际案例（一）实际动物组织中应用DNA彗星法检测第84页/共106页试验样品试验样品：市购猪肉、牛肉，以10克/份装于小塑料,以钴60进行辐照处理,辐照剂量分别为2.5kGy,5.0kGy,10.0kGy,每种剂量分别辐照5个样品，进行对照实验。市购新鲜猪肝、牛肝,以10克/份装于小塑料,以钴60进行辐照处理,辐照剂量分别为2.5kGy,5.0kGy,10.0kGy,每种剂量分别辐照5个样品，进行对照实
48、验。第85页/共106页染色染色将载玻片浸入溴化乙锭染液中3-5分钟。浸泡在水中1-2分钟清洗载玻片。在用荧光显微镜观察前，准备好盖玻片盖在载玻片的湿面上，沾掉多余水分。立即观察，因干燥后会影响细胞观察效果。检测检测溴化乙锭染色的片子，荧光显微镜选择510nm-590nm（绿色激发光）的滤波片观察。镜下DNA发红光。第86页/共106页一、牛肌肉牛肌肉未处理牛肌肉2.5kGy处理牛肌肉5kGy处理牛肌肉10kGy处理第87页/共106页用分析软件分析结果如下：剂量水平彗星长彗星光密度彗星重心彗星惯量彗星分布矩0464267769.9616580.091921.96162.5733807230.
49、8488677.556822.848851056234949.44871686.76235.4487101358583845.65541990.25737.6554尾长尾光密度尾重心Olive尾矩尾惯量尾分布矩00000070627750.93913.96621927.5542.9391551614778.289810.07964293.08764.2898892869772.916313.69084581.11664.9163尾%DNA头长头%DNA头光密度头重心头惯量04699.96494266269.9531579.551916.48724283.51283179526.8826430.
50、78225.89785074.10224620239.3692775.885933.43164666.56845714131.9645689.0917头分布矩尾/头(长)21.9531018.88260.921125.36921.123.96451.9348第88页/共106页二、肝 肝未处理肝2.5kGy处理肝5kGy处理 肝10kGy处理第89页/共106页用分析软件进行分析结果如下：剂量水平彗星长彗星光密度彗星重心彗星惯量彗星分布矩0575792248.9587747.805424.95872.59013834250.66541480.0734.665451176965860.00712