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1、第二章第二章 酶促反应动力学酶促反应动力学2.1 酶促反应动力学的特点酶促反应动力学的特点2.1.1 酶的基本概念酶的基本概念2.1.2 酶的稳定性及应用特点酶的稳定性及应用特点 酶是以活力、而不是以质量购销的。酶是以活力、而不是以质量购销的。酶酶有有不不同同的的质质量量等等级级：工工业业用用酶酶、食食品品用用酶酶、医医药药用用酶酶。酶酶的的实实际际应应用用中中应应注注意意，没没有有必必要要使使用用比比工工艺艺条件所需纯度更高的酶。条件所需纯度更高的酶。经经典典酶酶学学研研究究中中，酶酶活活力力的的测测定定是是在在反反应应的的初初始始短短时时间间内内进进行行的的，并并且且酶酶浓浓度度、底底物物
2、浓浓度度较较低低，且且为为水水溶溶液液，酶酶学学研研究究的的目目的的是是探探讨讨酶酶促促反反应应的的机机制。制。工工业业上上，为为保保证证酶酶促促反反应应高高效效率率完完成成，常常需需要要使使用用高高浓浓度度的的酶酶制制剂剂和和底底物物，且且反反应应要要持持续续较较长长时时间间，反反应应体体系系多多为为非非均均相相体体系系，有有时时反反应应是是在在有有机机溶剂中进行。溶剂中进行。2.2 均相酶促反应动力学均相酶促反应动力学2.2.1 酶促反应动力学基础酶促反应动力学基础可采用化学反应动力学方法建立酶促反应动力学方程。可采用化学反应动力学方法建立酶促反应动力学方程。对酶促反应对酶促反应 ，有：，
3、有：式中，式中，k：酶促反应速率常数；：酶促反应速率常数；r：酶促反应速率；：酶促反应速率；rA：以底物：以底物A的消耗速率表示的酶促反应速率；的消耗速率表示的酶促反应速率；rP：以产物：以产物P的生成速率表示的酶促反应速率。的生成速率表示的酶促反应速率。2.2.2 单底物酶促反应动力学2.2.2.1 米氏方程 根据酶底物中间复合物假说，对单底物酶促反应 ，其反应机制可表示为：快速平衡法推导动力学方程：快速平衡法推导动力学方程：几点假设：（1）CSCE，中间复合物ES的形成不会降低CS。（2）不考虑这个可逆反应。（3）为快速平衡，为整个反应的限速阶段，因此ES分解成产物不足以破坏这个平衡。解之
4、，得解之，得令令则则根据假设建立动力学方程根据假设建立动力学方程解之，得解之，得令令则则根据以上假设，可建立如下方程组根据以上假设，可建立如下方程组米氏方程米氏方程 rrmaxrmax/2KmCS图21 酶浓度一定时底物浓度对反应速率的影响双倒数法(Linewear Burk):对米氏方程两侧取倒数，得 ,以 作图，得一直线，直线斜率为 ，截距为 ,根据直线斜率和截距可计算出Km和rmax。2.2.2.2 抑制剂对酶促反应速率的影响 失活作用 抑制作用 竞争性抑制 非竞争性抑制 竞争性抑制竞争性抑制 非竞争性抑制非竞争性抑制EISESI快速平衡法推导动力学方程：快速平衡法推导动力学方程：解之，
5、得解之，得，式中式中:采用稳态法推导动力学方程：采用稳态法推导动力学方程：解之，得解之，得式中式中:非竞争性抑制反应机理非竞争性抑制反应机理快速平衡法推导动力学方程快速平衡法推导动力学方程 解之，得解之，得式中式中:解之，得解之，得式中式中:竞争性抑制竞争性抑制 非竞争性抑制非竞争性抑制令可变形为可变形为:可变形为可变形为:令 竞争性抑制竞争性抑制 非竞争性抑制非竞争性抑制1r1CS1rmax-1Km-1Km1r1CS1rmax-1KmCI=0CI 1rmaxCI=0CI 快速平衡法推导动力学方程快速平衡法推导动力学方程:解之解之,得得式中式中:解之解之,得得式中式中:可见可见,产物抵制属于竞
6、争性抵制产物抵制属于竞争性抵制底物抑制：对于某些酶促反应，当底物浓底物抑制：对于某些酶促反应，当底物浓度较高时，反应速率呈下降趋势，称为底度较高时，反应速率呈下降趋势，称为底物抑制。物抑制。CSC CS Sr底物抑制反应机理：底物抑制反应机理：快速平衡法推导动学方程：快速平衡法推导动学方程：解之解之,得得式中式中:2.2.3 2.2.3 多底物酶促反应动力学多底物酶促反应动力学一般的多底物酶促反应可表示为：一般的多底物酶促反应可表示为：这里讨论：双底物双产物情况这里讨论：双底物双产物情况反应机制：反应机制：关键问题：底物关键问题：底物A A、B B哪个先和酶结合？哪个先和酶结合？u 任何一个都
7、有可能先与酶结合任何一个都有可能先与酶结合 （随机机制）（随机机制）u A A先与酶结合或先与酶结合或B B先与酶结合先与酶结合 u 两底物同时与酶结合两底物同时与酶结合 （可能性极小）（可能性极小）随机机制（分支机制）随机机制（分支机制）EEBEAEABEPQEPEQE（不形成三元复合物）反应模型（不形成三元复合物）反应模型EAEAAPPBBEQQQEEG （EG：修饰过的酶：修饰过的酶）简单机制简单机制EEAEABAABBEPQQQEPEPP双底物酶促反应动力学双底物酶促反应动力学 反应机理：反应机理：解之，得解之，得式中：式中：2.3 固定化酶促反应动力学 2.3.1 2.3.1 固定化
8、酶促反应动力学基础固定化酶促反应动力学基础 2.3.1.1 2.3.1.1 酶的固定化技术定义酶的固定化技术定义 酶的固定化技术是将水溶性的酶分子通过一定的方式，如静电酶的固定化技术是将水溶性的酶分子通过一定的方式，如静电吸附，共价键等与载体如角叉菜胶、离子交换树脂等材料制成固吸附，共价键等与载体如角叉菜胶、离子交换树脂等材料制成固相酶的技术。相酶的技术。细胞的固定化技术细胞的固定化技术:为省去从微生物（或动、植物）中提取为省去从微生物（或动、植物）中提取酶的操作，确保酶的稳定性，采用直接固定化微生物细胞、动植酶的操作，确保酶的稳定性，采用直接固定化微生物细胞、动植物细胞、组织技术。物细胞、组
9、织技术。物理吸附法物理吸附法 载体结合法载体结合法 离子结合法离子结合法 共价结合法共价结合法 交联法交联法 格子型格子型 包埋法包埋法 微胶囊微胶囊2.3.1.2 2.3.1.2 酶和细胞固定化方法酶和细胞固定化方法 交联法交联法EOEEOOOE2.3.1.3 2.3.1.3 固定化对酶性质的影响固定化对酶性质的影响底物专一性的改变底物专一性的改变 稳定性增强稳定性增强 最适最适pHpH值和最适温度变化值和最适温度变化动力学参数的变化动力学参数的变化 2.3.1.4 2.3.1.4 影响固定化酶促反应的主要因素影响固定化酶促反应的主要因素 分子构象的改变分子构象的改变 位阻效应位阻效应 微扰
10、效应微扰效应 分配效应分配效应 （可用（可用Kp Kp 定量描述定量描述）链接扩散效应扩散效应 （可定量描述）（可定量描述）分配系数分配系数 (Kp)(Kp)链接 分配系数：载体内外底物分配系数：载体内外底物(或其他物质或其他物质)浓度之比。浓度之比。Kp Kp的测定：的测定：已知底物浓度已知底物浓度(C CS0S0 )，体积，体积(V(V0 0)的溶液中，的溶液中，放入不含底物的一定体积的载体，并保持适宜条件，当达放入不含底物的一定体积的载体，并保持适宜条件，当达到平衡时，测定载体外溶液的底物浓度到平衡时，测定载体外溶液的底物浓度(Cs)(Cs)。2.3.2 2.3.2 固定化酶促反应过程分
11、析固定化酶促反应过程分析2.3.2.1 2.3.2.1 外部扩散过程外部扩散过程 以表面固定化酶为例。以表面固定化酶为例。CSCSS外扩散过程分析外扩散过程分析外扩散速率：外扩散速率：达到平衡时，达到平衡时，即即 酶促反应速率：酶促反应速率：N,rrmaxNmax 0 CSS CS(CSS，rout)NmaxN，rrmax0 CSS CS(CSS，rout)Da准数准数:当当 时，时，过程为外扩散控制。过程为外扩散控制。当当 时，时，过程为反应控制。过程为反应控制。式中式中:表明表明C*为为Da准数的函数，即准数的函数，即(时时,)表明表明为为C*的函数，即的函数，即 可见，Da准数是决定效率
12、因子 和比浓度C*的唯一参数，因而是表征传质过程对反应速率影响的基本准数。Da准数越小，固定化酶表面浓度越接近于主体浓度CS，越接近于1。Da准数越大，固定化酶表面浓度越趋近于零，越小，越趋近于零。为提高固定化酶外扩散效率为提高固定化酶外扩散效率,应设法减小应设法减小Da准数。减小准数。减小Da准数的措施：准数的措施：1、降低固定化酶颗粒的粒径，增大比表面、降低固定化酶颗粒的粒径，增大比表面积，但由于粒径减小会伴随压降增加，因此应积，但由于粒径减小会伴随压降增加，因此应用中综合考虑，确定合适的粒径。用中综合考虑，确定合适的粒径。2、使固定化酶表面流体处于湍流状态以增大、使固定化酶表面流体处于湍
13、流状态以增大 。2.3.2.2 内部扩散过程内部扩散过程 具有大量内孔的球形固定化酶颗粒Rdrr内扩散效率因子内扩散效率因子稳定状态下，对底物进行物料衡算：稳定状态下，对底物进行物料衡算：流入量流出量反应量流入量流出量反应量整理整理,得得两侧同除两侧同除 ,得得当反应符合米氏方程规律时，当反应符合米氏方程规律时，故故,令令 ,上式可转化为无因次形式，得上式可转化为无因次形式，得边界条件边界条件:,该微分方程无解析解，只能用数值法求解。该微分方程无解析解，只能用数值法求解。西勒西勒准数准数()的物理意义是表面反应速率与内扩散速率之的物理意义是表面反应速率与内扩散速率之比。对各类反应动力学与固定化
14、酶的形状，普遍比。对各类反应动力学与固定化酶的形状，普遍化的化的 的定义式为的定义式为:引入无因次参数，则引入无因次参数，则无解析解，只有数值解。无解析解，只有数值解。见教材见教材33页图页图2-10 内扩散效率因子内扩散效率因子 in 是是 和和 的函数。的函数。对对 in影响不大，影响影响不大，影响 in的主要参数是的主要参数是西勒准数西勒准数。如果。如果 ，则，则 不随不随 变变化，近似等于化，近似等于1，也就是说没有内部传，也就是说没有内部传质阻力，若质阻力，若 ，则，则 ，反应为内，反应为内扩散所限制。扩散所限制。为提高固定化酶内扩散效率，应为提高固定化酶内扩散效率，应设法减小设法减
15、小。减小减小 的措施主要是适当降低固定的措施主要是适当降低固定化酶颗粒粒径。化酶颗粒粒径。外扩散过程外扩散过程内扩散过程内扩散过程 Da准数是决定外扩散准数是决定外扩散 效率的唯一参数。效率的唯一参数。准数是决定内扩散准数是决定内扩散效率的主要参数。效率的主要参数。Da准数定义：准数定义：西勒准数定义：西勒准数定义：外扩散效率因子定义：外扩散效率因子定义：内扩散效率因子定义：内扩散效率因子定义：Da1，过程为外扩散控，过程为外扩散控制制 0.3时，过程为内时，过程为内扩散控制。扩散控制。2.4 酶的失活动力学2.4.1 未反应时酶的失活动力学未反应时酶的失活动力学2.4.1.1 一步失活模型一
16、步失活模型 式中式中:E具有活性的酶，具有活性的酶，D失活的酶。失活的酶。kd失活反应速率常数。失活反应速率常数。建立酶失活动力学方程：建立酶失活动力学方程：边界条件：边界条件：积分，得积分，得几个概念：几个概念：一步失活常数：一步失活常数 ：半衰期，当：半衰期，当 ：时间常数，：时间常数，三者关系：三者关系：2.4.1.2 多步失活模型 多步串联失活模型：多步串联失活模型：同步失活模型：同步失活模型：式中，式中，为失活速率常数为为失活速率常数为 的酶组分的分的酶组分的分率。因此，率。因此，2.4.1.3 2.4.1.3 温度对酶失活的影响式中，式中，指前因子指前因子 反应活化能反应活化能同时考虑温度和时间对酶失活的影响：同时考虑温度和时间对酶失活的影响：（见教材（见教材3535页图页图2-112-11）2.4.2 反应中酶的热失活动力学反应中酶的热失活动力学 看图：看图：图图2-12（a)说明：说明：图图2-12（b)说明：说明：2.4.2.1 反应中酶的失活模型建立失活动力学方程：建立失活动力学方程：方程联立求解，得式中：讨论：讨论：1时，底物对酶失活无影响。时，底物对酶失活无影响。0时，酶完全被底物所保护。时，酶完全被底物所保护。0 1时，底物加速酶的失活。时，底物加速酶的失活。因此称因此称 为底物对酶稳定性影响系数。为底物对酶稳定性影响系数。