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1、柱填料 液相色谱柱的分离作用是在填料与流动相之间进行的，柱子的分类是依据填料类型而定。正相柱：多以硅胶为柱填料。根据外型可分为无定型和球型两种，其颗粒直径在310 m的范围内。另一类正相填料是硅胶表面键合CN，-NH2等官能团即所谓的键合相硅胶。反相柱：主要是以硅胶为基质，在其表面键合十八烷基官能团(ODS)的非极性填料。也有无定型和球型之分。常用的其他的反相填料还有键合C8、C4、C2、苯基等，其颗粒粒径在310 m之间。第1页/共17页卡套柱的安装（不加预柱）1将卡套架套入柱芯 2将两片夹套片嵌入柱芯的凹槽，使柱芯高于夹套（见左图）3将已套到柱芯上的卡套架向上推，直至高过夹套片 4将卡套帽
2、和卡套架旋在一起，然后用手拧紧 5然后依同样的顺序连接好柱子的另一端 6连接到液相色谱仪，PEEK接头手拧即可；若为不锈钢接头应使用专用扳手 注意：使用卡套柱时，两端的卡套应时刻连接在柱芯上。不管是平衡色谱柱或是清洗，任何时候都不能将卡套取下来，否则会造成填料的流失。第2页/共17页卡套柱的安装（加预柱）1将卡套架套入柱芯2将两片夹套片嵌入柱芯的凹槽，使夹套高于柱芯（见左图）3将已套到柱芯上的卡套架向上推，直至高过夹套片4将“子弹头”预柱放入卡套片内5将卡套帽和卡套架旋在一起，然后用手拧紧6然后依同样的顺序连接好柱子的另一端7连接到液相色谱仪，PEEK接头手拧即可；若为不锈钢接头应使用专用扳手
3、第3页/共17页更换色谱柱滤网和玻璃棉过滤片（同时可以修补色谱柱）注意：在取出反相柱芯的滤网和玻璃片之前，应该将色谱柱充分用水和甲醇/乙腈冲洗，而且修补工具的头部也应该蘸取少量的甲醇/乙腈，以避免在取出滤网和玻璃棉滤片时带出柱子内的填料。1将修补工具中的2套入柱芯的顶端2将修补工具中的3轻轻地旋入已套着2的柱芯中，并顺时针方向旋转到旋紧3一手握柱芯，另一只手轻轻地向外拉3，取出柱芯顶端的滤网4用一个小铲子轻轻地取出滤网下面的玻璃棉以及被污染的填料5将新的填料用甲醇润湿，然后填入挖去的部位，压平6照（左图）装上新的玻璃棉滤网，并用修补工具中的4将玻璃棉压入柱芯顶端7柱芯顶端套上2，然后参照（左图
4、）将滤网放入8压紧，然后取下2，再用4将滤网的边缘压平第4页/共17页色谱柱的老化 色谱柱安装和系统检漏工作完成后，就可以对色谱柱进行老化了。对色谱柱升至一恒定温度，通常为其温度上限。特殊情况下，可加热至高于最高使用温度10-20左右，但是一定不能超过色谱柱的温度上限，那样极易损坏色谱柱。当到达老化温度后，记录并观察基线。初始阶段基线应持续上升，在到达老化温度后5-10分钟开始下降，并且会持续30-90分钟。当到达一个固定的值后就会稳定下来。如果在2-3小时后基线仍无法稳定或在15-20分钟后仍无明显的下降趋势，那么有可能系统装置有泄漏或者污染。遇到这样的情况，应立即将柱温降到40以下，尽快的
5、检查系统并解决相关的问题。如果还是继续的老化，不仅对色谱柱有损坏而且始终得不到正常稳定的基线。一般来说，涂有极性固定相和较厚涂层的色谱柱老化时间长，而弱极性固定相和较薄涂层的色谱柱所需时间较短。而PLOT色谱柱的老化方法有各不相同。第5页/共17页平衡色谱柱 1.反相色谱柱在经过出厂测试后是保存在乙腈/水中的。需一定确保所使用的流动相和乙腈/水互溶。由于色谱柱在储存或运输过程中可能会干掉，因此在用流动相分析样品之前，应使用1020倍柱体积的甲醇或乙腈平衡色谱柱；如果所使用的流动相中含有缓冲盐，应注意用纯水“过渡”。2.硅胶柱或极性色谱柱在经过出厂测试后是保存在正庚烷中的。如果该色谱柱需要使用含
6、水的流动相，请在使用流动相之前用乙醇或异丙醇平衡第6页/共17页色谱柱使用前注意事项 在使用前一定要注意色谱柱的储存液与要分析样品的流动相是否互溶，如胺基(NH2)氰基(CN)柱均为正相条件下评价，所以如果使用条件为反相条件时，请用一中介流动相(如异丙醇)先置换掉柱内的储存液然后再应用。反相条件对于C18固定相采用的是甲醇-水为评价流动相，若要使用含盐浓度较高的流动相，使用前请用超纯水（或甲醇含量相对较低的甲醇-水）顶替掉原来的评价流动相，否则会对色谱柱造成极大的伤害，将会明显地减少色谱柱使用寿命第7页/共17页色谱柱的使用方向 高效液相色谱柱标签上的箭头所示方向是评价时流动相流动的方向，使用
7、过程相流动的方向也最好按此方向。第8页/共17页流动相 流动相中所用的各种有机溶剂要尽可能地使用色谱纯或至少是分析纯试剂，配流动相的水最好是超纯水或全玻璃器皿的双蒸水。如果将所配得流动相再经过0.45 或0.22 m 的滤膜过滤一次则更好，这一点对含盐的流动相尤为重要。另外装流动相的容器和色谱系统中的在线过滤器等装置应该定期清洗或更换。总之必须保证所使用的流动相和色谱系统是足够的清洁。第9页/共17页样品 样品也要尽可能的清洁，同样可选用样品过滤器或样品预处理柱(SPE柱)对样品进行预处理，若样品不便处理要使用保护柱。在用正相色谱法分析样品时如无特殊要求所有的溶剂和样品应严格脱气第10页/共1
8、7页pH值以常规硅胶为基质的键合相填料高效液相色谱柱通常的pH 值适用范围是2.0-10.0。当必须要在pH值适用范围的边界(特别是在8.0pH10.0 或pH2.0)，凡是以硅胶为基质的色谱柱关机前最好用适当的溶剂(如超纯水)将流动相顶替出柱然后方可短时间或过夜保存。(2).如色谱柱要长时间保存，色谱柱必须存于合适的溶剂状态下。对于反相柱可以储存于纯甲醇或乙腈中；正相柱可以存于严格脱水后的纯正己烷中；离子交换柱可以储存于水(含防腐剂叠氮化钠或柳硫汞)中，并将购买新色谱柱时附送的防尘防干裂塑料堵头堵上。对使用过含盐浓度较高的流动相的色谱柱，在储存之前，必须用超纯水顶替掉原来的流动相后，再储存于
9、合适的溶剂状态下。储存的温度最好是室温第12页/共17页色谱柱的再生因为高效液相色谱柱是消耗品随着使用时间或进样次数的增加当出现色谱峰高降低峰宽加大或出现肩峰时一般来说可能是柱效下降(1).反相柱的再生采用以甲醇:水=95:5(V/V)纯甲醇二氯甲烷等溶剂作流动相顺次冲洗每种流动相流经色谱柱的量为20-30倍色谱柱体积然后再以相反顺序冲洗色谱柱(2).正相柱顺次以正己烷异丙醇二氯甲烷甲醇作流动相冲洗色谱柱每步注意平衡溶剂的顺序不要颠倒每种流动相流经色谱柱的量为20-30倍柱体积(因异丙醇9的粘度较大冲洗过程中请随时注意调整冲洗的流速)用甲醇冲洗完后再以相反的顺序冲洗色谱柱要注意上述溶剂必需严格
10、脱水第13页/共17页色谱柱的再生 (3).离子交换柱的再生长时间在高pH值和高离子强度缓冲溶液中使用将导致色谱柱离子交换能力降低用稀酸缓冲溶液冲洗可使阳离子柱再生反之用稀碱缓冲溶液冲洗可使阴离子柱再生以上色谱柱的再生方法并不是绝对的标准方法用户可根据自己的实际经验和目的选择合适的并能溶解柱内污染物的溶剂作流动相按正方向或反方向的冲洗但是需要指出的是无论采用什么方法再生色谱柱均不可能完全恢复柱效或其他参数至新柱水平第14页/共17页注意事项1.1.柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动；柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动；2.2.当柱子和色谱仪联结时，阀件或管路一定要清洗干净；当柱子和
11、色谱仪联结时，阀件或管路一定要清洗干净；3.3.要注意流动相的脱气；要注意流动相的脱气；4.4.避免使用高粘度的溶剂作为流动相；避免使用高粘度的溶剂作为流动相；5.5.进样样品要提纯；进样样品要提纯；6.6.严格控制进样量；严格控制进样量；7.7.大多数反相色谱柱的大多数反相色谱柱的pHpH稳定范围是稳定范围是2 27.57.5，尽量不超过该，尽量不超过该色谱柱的色谱柱的pHpH范围范围第15页/共17页注意事项1.避免流动相组成及极性的剧烈变化2.如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相，应在实验完毕柱子冲洗干净，并保存在乙腈中3.压力升高是需要更换预柱的信号4.每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品；5.每天分析测定结束后，都要用适当的溶剂来清洗柱；6.若分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存并封闭；第16页/共17页感谢您的观看！第17页/共17页