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1、植物叶绿体色素含量的测定第1页，共16页，编辑于2022年，星期六高高等等植植物物叶叶绿绿体体色色素素叶绿素叶绿素类胡萝卜类胡萝卜叶黄素叶黄素-C-C4040H H5656O O胡萝卜素胡萝卜素-C-C4040H H5656叶绿素叶绿素b-Cb-C5555H H7070O6NO6N4 4MgMg叶绿素叶绿素a-Ca-C5555H H7272O O5 5N N4 4MgMg第2页，共16页，编辑于2022年，星期六 叶绿素吸收光谱：第3页，共16页，编辑于2022年，星期六 最大吸收区域在最大吸收区域在蓝紫蓝紫光部分光部分（400-500nm400-500nm），基本，基本上不吸收黄光，从而呈上
2、不吸收黄光，从而呈现黄色现黄色。类胡萝卜素吸收光谱：第4页，共16页，编辑于2022年，星期六红光区红光区蓝光区蓝光区第5页，共16页，编辑于2022年，星期六 叶叶绿绿体体色色素素提提取取液液中中各各色色素素的的吸吸收收光光谱谱虽虽有有不不同同，但但又又存存在在着着明明显显的的重重叠叠，在在不不分分离离的的情情况况下下同同时时测测定定叶叶绿绿素素a、叶叶绿绿素素b和和类类胡胡萝萝卜卜素素的的浓浓度度，可可分分别别测测定定在在663nm、645nm（分分别别是是叶叶绿绿素素a和和叶叶绿绿素素b在在红红光光区区的的吸吸收收峰峰）和和475nm的的光光吸吸收收，然然后后根根据据Lambert-Be
3、er定定律律，计计算算出出提提取取液液中中叶叶绿绿素素a、叶绿素、叶绿素b和类胡萝卜素的浓度。和类胡萝卜素的浓度。nA663=82.04Ca+9.27Cb（1）nA645=16.75Ca+45.60Cb（2）第6页，共16页，编辑于2022年，星期六将上式整理，可以得到下式：将上式整理，可以得到下式：Ca=13.95A665-6.88A649 Cb=24.96A649 7.32 A665 CT=Ca+Cb=18.08A649-6.63 A665 CX.C=(1000A470-2.05Ca-114Cb)/245第7页，共16页，编辑于2022年，星期六 叶叶绿绿体体色色素素，不溶于水，易溶于乙醇
4、、丙酮等有机溶剂。同时，叶绿体色素在植物细胞内是以色素蛋白复合体的结构存在的。故通常用80%的丙酮或95%乙醇提取叶绿素。叶绿体色素的提取叶绿体色素的提取第8页，共16页，编辑于2022年，星期六 为什么要用含有水的有机溶剂提取叶片为什么要用含有水的有机溶剂提取叶片 中的叶绿素？中的叶绿素？这是因为叶绿素这是因为叶绿素分子结构的分子结构的“头部头部”是亲水的，与蛋白质是亲水的，与蛋白质结合很牢，需要经过结合很牢，需要经过水水 溶解作用才可被提溶解作用才可被提取出来。取出来。第9页，共16页，编辑于2022年，星期六 实验步骤实验步骤 1取2种新鲜玉米（完全/缺素）叶片，擦净组织表面污物，剪碎（
5、去掉中脉），混匀。2各称取0.2g，分别放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及2ml95乙醇，研成匀浆，再加少量95%乙醇，多次研磨至组织发白，静置片刻。加入少量碳酸钙；弱光下研磨，速度要快第10页，共16页，编辑于2022年，星期六实验步骤实验步骤 3取滤纸1张，置漏斗中，用95%乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到25ml容量瓶中，用少量95%乙醇冲洗研钵和研棒数次，将液体全部倒入漏斗中。4用滴管吸取95%乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用95%乙醇定容至25ml，摇匀。残渣中的色素要充分洗脱！第11页，共16页，编辑于2022年，星期六 实
6、验步骤实验步骤 5把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯内。以95乙醇为空白，在波长665nm、649nm和470nm下测定吸光度。完全完全缺素缺素A470A470A A649649A A665665过滤的比色液不能混浊第12页，共16页，编辑于2022年，星期六 95%95%乙醇提取液中色素计算公式：乙醇提取液中色素计算公式：Ca=13.95A A665665-6.88A A649649 Cb=24.96A A649 649 7.32 A A665665 C CT T=Ca+Cb=18.08A649-6.63 A665 C CX.CX.C=(1000A A470470-2.05Ca-114
7、Cb)/245 以上是求出叶绿素总浓度，以上是求出叶绿素总浓度，mg.Lmg.L-1-1 第13页，共16页，编辑于2022年，星期六按以下公式计算各色素含量按以下公式计算各色素含量(mg.g(mg.g鲜重鲜重-1-1)：叶绿体色素含量叶绿体色素含量 =色素的浓度色素的浓度提取液体积提取液体积(L)(L)稀释倍数稀释倍数 样品鲜重(g)第14页，共16页，编辑于2022年，星期六注意事项：注意事项：1、研磨要在弱光下进行，且速度要快；、研磨要在弱光下进行，且速度要快；2、研磨时要加入少量的碳酸钙，保护叶绿素；、研磨时要加入少量的碳酸钙，保护叶绿素；3、残渣中的色素要充分洗脱；、残渣中的色素要充分洗脱；4、波长要调准；、波长要调准；5、比色液不能混浊。、比色液不能混浊。第15页，共16页，编辑于2022年，星期六思考题思考题 1、叶绿素、叶绿素a、b在蓝光区也有吸收峰，能否在蓝光区也有吸收峰，能否用这一吸收峰波长进行叶绿素、的定用这一吸收峰波长进行叶绿素、的定量分析？为什么？量分析？为什么？2、为什么提取叶绿素时干材料一定要用、为什么提取叶绿素时干材料一定要用80的丙酮或乙醇，而新鲜的材料可以用无的丙酮或乙醇，而新鲜的材料可以用无水丙酮或乙醇提取？水丙酮或乙醇提取？第16页，共16页，编辑于2022年，星期六