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1、分子发光1第1页，共26页，编辑于2022年，星期五2.荧光分析法的应用荧光分析法的应用1.1.工作曲线法工作曲线法工作曲线法工作曲线法荧光猝灭工作曲线法荧光猝灭工作曲线法荧光猝灭工作曲线法荧光猝灭工作曲线法F Fx xF FC Cs sC Cx x直接荧光标准曲线法直接荧光标准曲线法直接荧光标准曲线法直接荧光标准曲线法F FC Cs sF Fx xC Cx x一一一一.定量分析方法定量分析方法定量分析方法定量分析方法2.2.标准对照法（比较法）标准对照法（比较法）标准对照法（比较法）标准对照法（比较法）cx待测试液浓度待测试液浓度cs标准溶液浓度标准溶液浓度Ifx待测试液荧光强度待测试液荧光
2、强度Ifx标准溶液荧光强度标准溶液荧光强度If0空白试剂荧光强度空白试剂荧光强度依据：依据：IF=kc2第2页，共26页，编辑于2022年，星期五荧光分析的灵敏度比紫外荧光分析的灵敏度比紫外荧光分析的灵敏度比紫外荧光分析的灵敏度比紫外-可见分光光度法高可见分光光度法高可见分光光度法高可见分光光度法高10103 310104 4.二二.荧光分析法的灵敏度荧光分析法的灵敏度荧光分析法的灵敏度荧光分析法的灵敏度荧光分析法可通过荧光分析法可通过提高入射光强度提高入射光强度或或增大检测器的放大倍数增大检测器的放大倍数提提高灵敏度。高灵敏度。3第3页，共26页，编辑于2022年，星期五紫外紫外紫外紫外-可
3、见分光光度计可见分光光度计可见分光光度计可见分光光度计:光源光源光源光源样品池样品池样品池样品池单色器单色器单色器单色器检测器检测器检测器检测器数据处理数据处理数据处理数据处理仪器控制仪器控制仪器控制仪器控制荧光荧光荧光荧光(磷光磷光磷光磷光)分光光度计分光光度计分光光度计分光光度计:光源光源光源光源样品池样品池样品池样品池激发激发激发激发单色器单色器单色器单色器检测器检测器检测器检测器数据处理数据处理数据处理数据处理仪器控制仪器控制仪器控制仪器控制发射发射发射发射单色器单色器单色器单色器4第4页，共26页，编辑于2022年，星期五在在在在光光光光照照照照下下下下会会会会发发发发生生生生荧荧荧
4、荧光光光光的的的的无无无无机机机机化化化化合合合合物物物物很很很很少少少少，主主主主要要要要利利利利用用用用与与与与有有有有机机机机试试试试剂剂剂剂形形形形成成成成的的的的荧光配合物荧光配合物荧光配合物荧光配合物。如。如。如。如AlAl3+3+可与可与可与可与8-8-羟基喹啉配合。羟基喹啉配合。羟基喹啉配合。羟基喹啉配合。三三三三.荧光分析的应用荧光分析的应用荧光分析的应用荧光分析的应用1.1.无机化合物的分析无机化合物的分析无机化合物的分析无机化合物的分析v v直接荧光测定法直接荧光测定法直接荧光测定法直接荧光测定法常常常常测测测测定定定定的的的的元元元元素素素素有有有有：BeBe、AlAl
5、、B B、GaGa、SeSe、MgMg、ZnZn、CdCd与与与与某某某某些些些些稀稀稀稀土元素；测定的灵敏度有些可以达到土元素；测定的灵敏度有些可以达到土元素；测定的灵敏度有些可以达到土元素；测定的灵敏度有些可以达到1010-10-10;某某某某些些些些元元元元素素素素虽虽虽虽然然然然不不不不与与与与有有有有机机机机试试试试剂剂剂剂形形形形成成成成发发发发荧荧荧荧光光光光的的的的配配配配合合合合物物物物，但但但但是是是是它它它它会会会会与与与与发发发发荧荧荧荧光光光光的的的的配配配配合合合合物物物物争争争争夺夺夺夺配配配配位位位位体体体体，组组组组成成成成不不不不发发发发荧荧荧荧光光光光的的
6、的的配配配配合合合合，使使使使其其其其产产产产生生生生荧荧荧荧光光光光猝猝猝猝灭灭灭灭，由由由由荧荧荧荧光光光光猝猝猝猝灭灭灭灭的强度计算的强度计算的强度计算的强度计算该元素的含量。该元素的含量。该元素的含量。该元素的含量。较常测定的元素有：较常测定的元素有：较常测定的元素有：较常测定的元素有：F F、S S、FeFe、AgAg、CoCo、NiNi、CuCu、MoMo、WWv v荧光猝灭测定法荧光猝灭测定法荧光猝灭测定法荧光猝灭测定法5第5页，共26页，编辑于2022年，星期五2.有机化合物的分析有机化合物的分析（1）脂肪族有机化合物）脂肪族有机化合物 分子结构较为简单，分子结构较为简单，本身
7、能发生荧光的很少本身能发生荧光的很少，一般需，一般需要要与某些试剂反应与某些试剂反应后才能进行荧光分析，如丙三醇与苯胺在后才能进行荧光分析，如丙三醇与苯胺在浓硫酸介质中反应生成发射蓝色荧光的喹啉，据此可以测定浓硫酸介质中反应生成发射蓝色荧光的喹啉，据此可以测定0.12gmL的丙三醇。的丙三醇。（2）芳香族化合物）芳香族化合物 具有共轭的不饱和体系具有共轭的不饱和体系，多能发生荧光，可，多能发生荧光，可直接直接用荧光用荧光法测定。法测定。6第6页，共26页，编辑于2022年，星期五一、概述一、概述 磷磷光光分分析析法法是是以以分分子子磷磷光光光光谱谱来来鉴鉴别别有有机机化化合合物物和和进进行行定
8、定量量分分析析的的一种方法。一种方法。磷光分析法在药物分析磷光分析法在药物分析,临床分析等领域的应用日益发展。临床分析等领域的应用日益发展。磷光的特点：磷光的特点：磷光磷光波长波长比荧光的大比荧光的大(能量能量T1S1)；磷光磷光寿命寿命比荧光的长比荧光的长(磷光为禁阻跃迁产生，速率常数小磷光为禁阻跃迁产生，速率常数小)；磷光寿命和强度对磷光寿命和强度对重原子重原子和和氧氧敏感。敏感。2.5 磷光分析法磷光分析法7第7页，共26页，编辑于2022年，星期五二、二、基本原理基本原理(一一)磷光的产生和磷光强度磷光的产生和磷光强度1.磷光是处于激发三重态的分子跃迁返回基态时所产生的辐射。磷光是处于
9、激发三重态的分子跃迁返回基态时所产生的辐射。2.磷光强度磷光强度:IP=2.3 PI0bc在一定的条件下，在一定的条件下，p、Ip、k、b 均为均为常数，因此上式可常数，因此上式可写成：写成：Ip=KcIP磷光强度磷光强度 P磷光效率磷光效率I 激发光的强度激发光的强度磷光物质的摩尔吸收系数磷光物质的摩尔吸收系数 b 试样池的光程试样池的光程 c 磷光物质的浓度磷光物质的浓度8第8页，共26页，编辑于2022年，星期五(二二)温度对磷光强度的影响温度对磷光强度的影响1.随着随着温度降低温度降低，分子热运动速率减慢，分子热运动速率减慢，磷光增强磷光增强。2.低温磷光低温磷光(液氮液氮)由于磷光寿
10、命长，由于磷光寿命长，T1的非辐射跃迁的非辐射跃迁(内转换内转换)几率增加，碰撞失活几率增加，碰撞失活(振动弛豫振动弛豫)的几率、光化学反应几率都增加，从而降低磷光强度。因此的几率、光化学反应几率都增加，从而降低磷光强度。因此有必要在低温下测量磷光。同时要求溶剂：有必要在低温下测量磷光。同时要求溶剂：易提纯且在分析波长区易提纯且在分析波长区无强吸收和发射；无强吸收和发射；低温下形成具有足够粘度的透明的刚性玻璃体。低温下形成具有足够粘度的透明的刚性玻璃体。常用的溶剂：常用的溶剂：EPA乙醇乙醇+异戊烷异戊烷+二乙醚二乙醚(2+2+5)IEPACH3I+EPA(1+10)。9第9页，共26页，编辑
11、于2022年，星期五(三三)重原子效应重原子效应 使用含有使用含有重原子的溶剂重原子的溶剂(碘乙烷、溴乙烷碘乙烷、溴乙烷)或在磷光物质中引入或在磷光物质中引入重原重原子取代基子取代基，都可以提高物质的磷光强度，这种效应称为，都可以提高物质的磷光强度，这种效应称为重原子效应重原子效应。前者称为外部重原子效应，后者称为内部重原子效应。前者称为外部重原子效应，后者称为内部重原子效应。机理机理:重原子的高核电荷使磷光分子的重原子的高核电荷使磷光分子的电子能级交错电子能级交错，容易引起或，容易引起或增强磷光分子的自旋轨道偶合作用，从而使增强磷光分子的自旋轨道偶合作用，从而使S1T1的的系间窜跃概率增大系
12、间窜跃概率增大，有利于增大磷光效率。有利于增大磷光效率。10第10页，共26页，编辑于2022年，星期五(四四)室温磷光室温磷光 低温磷光需低温实验装置且受到溶剂选择的限制，低温磷光需低温实验装置且受到溶剂选择的限制，1974年后发年后发展了室温磷光。展了室温磷光。1)固体基质：在室温下以固体基质固体基质：在室温下以固体基质(如纤维素等如纤维素等)吸附磷光体，可吸附磷光体，可增加分子刚性、减少三重态猝灭等非辐射跃迁，从而提高磷光量子增加分子刚性、减少三重态猝灭等非辐射跃迁，从而提高磷光量子效率。效率。2)胶束增稳：利用表面活性剂在临界浓度形成具多相性的胶束，改变胶束增稳：利用表面活性剂在临界浓
13、度形成具多相性的胶束，改变磷光体的微环境、增加定向约束力，从而减小内转换和碰撞等去活化的几磷光体的微环境、增加定向约束力，从而减小内转换和碰撞等去活化的几率，提高三重态的稳定性。率，提高三重态的稳定性。利用利用胶束增稳胶束增稳、重原子效应重原子效应和和溶液除氧溶液除氧是该法的三要素。是该法的三要素。11第11页，共26页，编辑于2022年，星期五3)敏化磷光：其过程可以简单表示为：敏化磷光：其过程可以简单表示为：此法中，被测物质不发射磷光，而是引发受体发光。此法中，被测物质不发射磷光，而是引发受体发光。12第12页，共26页，编辑于2022年，星期五三、磷光分析仪器三、磷光分析仪器 在在荧荧光
14、光仪仪样样品品池池上上增增加加磷磷光光配配件件：低低温温杜杜瓦瓦瓶瓶和和斩斩光片光片。如右图所示。如右图所示。杜瓦瓶：杜瓦瓶：提供低温提供低温；斩光片：斩光片：切断激发光切断激发光。斩斩光光片片的的作作用用是是利利用用其其分分子子受受激激所所产产生生的的荧荧光光与与磷磷光光的的寿寿命命不不同同获获取取磷磷光辐射。光辐射。转筒式转筒式转盘式转盘式磷光分析仪器示意图磷光分析仪器示意图13第13页，共26页，编辑于2022年，星期五1.1.光学系统与荧光分光光度计的区别光学系统与荧光分光光度计的区别光学系统与荧光分光光度计的区别光学系统与荧光分光光度计的区别光源光源光源光源样品池样品池样品池样品池激
15、发激发激发激发单色器单色器单色器单色器检测器检测器检测器检测器数据处理数据处理数据处理数据处理仪器控制仪器控制仪器控制仪器控制发射发射发射发射单色器单色器单色器单色器切光器（斩波器）切光器（斩波器）切光器（斩波器）切光器（斩波器）荧荧荧荧 光：光：光：光：1010-8-8 secsec磷磷磷磷 光：光：光：光：110110-4-4 secsec2.2.样品池与荧光分光光度计的区别样品池与荧光分光光度计的区别样品池与荧光分光光度计的区别样品池与荧光分光光度计的区别通常情况下，样品池需要放在盛通常情况下，样品池需要放在盛通常情况下，样品池需要放在盛通常情况下，样品池需要放在盛液氮的石英杜瓦瓶液氮的
16、石英杜瓦瓶液氮的石英杜瓦瓶液氮的石英杜瓦瓶内，来内，来内，来内，来测定测定测定测定低温磷光低温磷光低温磷光低温磷光。14第14页，共26页，编辑于2022年，星期五2.6 化学发光分析法化学发光分析法一、概述一、概述 某些物质在进行化学反应时，由于吸收了反应时产生的某些物质在进行化学反应时，由于吸收了反应时产生的化学能化学能，而使反应产物分子激发至激发态，受激分子由激，而使反应产物分子激发至激发态，受激分子由激发态回到基态时，便发出一定波长的光。这种吸收化学能使发态回到基态时，便发出一定波长的光。这种吸收化学能使分子发光的过程称为化学发光。分子发光的过程称为化学发光。利用化学发光反应而建立起来
17、的分析方法称为利用化学发光反应而建立起来的分析方法称为化学发化学发光分析法光分析法。化学发光也发生于生命体系，称为化学发光也发生于生命体系，称为生物发光生物发光。15第15页，共26页，编辑于2022年，星期五二、化学发光分析的基本原理二、化学发光分析的基本原理 （一）化学发光反应的基本要求（一）化学发光反应的基本要求 化学发光是吸收化学反应过程产生的化学能，而使反应产物分化学发光是吸收化学反应过程产生的化学能，而使反应产物分子激发所发射的光。子激发所发射的光。任何一个化学发光任何一个化学发光反应都应包括反应都应包括化学激发化学激发和和发光发光两个步骤，必两个步骤，必须满足如下条件：须满足如下
18、条件：(1)化学反应必须提供化学反应必须提供足够的化学能足够的化学能，并被发光物质吸收形成电子激发，并被发光物质吸收形成电子激发态。许多态。许多氧化还原反应氧化还原反应具备此要求。具备此要求。(2)吸收了化学能处于激发态的分子，应能释放出光子或能将能量转吸收了化学能处于激发态的分子，应能释放出光子或能将能量转移给其他分子，该分子能以光的形式释放能量。移给其他分子，该分子能以光的形式释放能量。16第16页，共26页，编辑于2022年，星期五（二）化学发光效率（二）化学发光效率化学效率：化学效率：发光效率：发光效率：时刻时刻t t 的化学发光强度的化学发光强度(单位时间发射的光量子数单位时间发射的
19、光量子数)：d dc c/d/dt t 分析物参加反应的速率；分析物参加反应的速率；17第17页，共26页，编辑于2022年，星期五（三）化学发光强度与化学发光分析的依据（三）化学发光强度与化学发光分析的依据 在化学发光分析中，被分析物相对于发光试剂小得多，在化学发光分析中，被分析物相对于发光试剂小得多，对于对于一级动力学反应：一级动力学反应：dc/dt=Kc；K 为反应速率常数。为反应速率常数。定量依据：定量依据：（1 1）在一定条件下，峰值光强）在一定条件下，峰值光强度与被测物浓度成线性；度与被测物浓度成线性；（2）在一定条件下，在一定条件下，曲线下面积为发光总强度曲线下面积为发光总强度(
20、S)，其，其与被测物浓度与被测物浓度成线性：成线性：18第18页，共26页，编辑于2022年，星期五（四）化学发光反应类型（四）化学发光反应类型1.1.直接化学发光和间接化学发光直接化学发光和间接化学发光直接发光直接发光是被测物作为反应物直接参加化学发光反应，是被测物作为反应物直接参加化学发光反应，生成电子激发态产物分子，此初始激发态能辐射光子。生成电子激发态产物分子，此初始激发态能辐射光子。A+B C*+DC*C+h 式式中中A A或或B B是是被被测测物物，通通过过反反应应生生成成电电子子激激发发态态产产物物C*，当当C*跃迁回基态时，辐射光子。跃迁回基态时，辐射光子。19第19页，共26
21、页，编辑于2022年，星期五间接发光间接发光是被测物是被测物A A或或B B，通过化学反应生成初始激发态，通过化学反应生成初始激发态产物产物C*，C*不直接发光，而是将其能量转移给不直接发光，而是将其能量转移给F，使，使F跃迁跃迁回基态，产生发光。回基态，产生发光。A+B C*+DC*+F F*+EF*F+h 式中式中C*为能量给予体，而为能量给予体，而F为能量接受体。为能量接受体。20第20页，共26页，编辑于2022年，星期五2.气相化学发光和液相化学发光气相化学发光和液相化学发光按反应体系的状态分类，如化学发光反应在气相中进行称为按反应体系的状态分类，如化学发光反应在气相中进行称为气相化
22、气相化学发光学发光；在液相或固相中进行称为；在液相或固相中进行称为液相或固相化学发光液相或固相化学发光；在两个不同相；在两个不同相中进行则称为中进行则称为异相化学发光异相化学发光。(1)气相化学发光气相化学发光主要有主要有O3、NO、S的化学发光反应，可用于监测空气中的的化学发光反应，可用于监测空气中的O3、NO、SO2、H2S、CO、NO2等。等。臭氧与乙烯的化学发光反应；臭氧与乙烯的化学发光反应；一氧化氮与臭氧的化学发光一氧化氮与臭氧的化学发光反应。反应。(2)液相化学发光液相化学发光用于此类化学发光分析的发光物质有鲁米诺、光泽碱、洛用于此类化学发光分析的发光物质有鲁米诺、光泽碱、洛粉碱等
23、。例如，利用发光物质鲁米诺，可测定痕量的粉碱等。例如，利用发光物质鲁米诺，可测定痕量的H2O2以及以及Cu、Mn、Co、V、Fe、Cr、Ce等金属离子。等金属离子。21第21页，共26页，编辑于2022年，星期五三、三、装置与技术装置与技术 装置流程：装置流程：发光反应室发光反应室光检测器光检测器信号放大器信号放大器显示与记录显示与记录 发光反应可采用静态或流动注射的方式进行：发光反应可采用静态或流动注射的方式进行：静静态态方方式式：用用注注射射器器分分别别将将试试剂剂加加入入到到反反应应器器中中混混合合，测测最最大大光强度或总发光量；试样量小，重复性差；光强度或总发光量；试样量小，重复性差；
24、流流动动注注射射方方式式：用用蠕蠕动动泵泵分分别别将将试试剂剂连连续续送送入入混混合合器器，定定时时通通过测量室，连续发光，测定光强度；试样量大；过测量室，连续发光，测定光强度；试样量大；22第22页，共26页，编辑于2022年，星期五四、化学发光分析的应用四、化学发光分析的应用1.广泛应用于大气中广泛应用于大气中O3、NO、NO2、H2O、SO2、CO等等组分的检测。组分的检测。2.鲁米诺鲁米诺H2O2体系体系:可测痕量的可测痕量的Cu2+、Mn2+、Co2+、V4+、Fe2+、Fe3+、Ni2+、Ag+、Au3+、Hg2+等等3.间接测定某些生物试样间接测定某些生物试样23第23页，共26
25、页，编辑于2022年，星期五五、五、特点特点1.1.灵敏度极高灵敏度极高 例：荧光素酶和磷酸三腺甙(ATP)的化学发光分析，可测定210-17Mol/L的ATP，即可检测出一个细菌中的ATP含量2.2.仪器设备简单仪器设备简单 不需要光源、单色器和背景校正；3.3.发射光强度测量无干扰发射光强度测量无干扰 无背景光、散射光等干扰；4.4.线性范围宽线性范围宽5.5.分析速度快分析速度快缺点：可供发光用的试剂少；发光反应效率低（大大低于生物体中的发光）；机理研究少。24第24页，共26页，编辑于2022年，星期五25第25页，共26页，编辑于2022年，星期五26第26页，共26页，编辑于2022年，星期五