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1、1HayflickHayflick界限界限 1961 1961年，年，Hayflick Hayflick 首次报道了体外培养首次报道了体外培养殖分殖分裂的极限裂的极限。他利用来自胚胎和成体的成纤维细胞进。他利用来自胚胎和成体的成纤维细胞进行体外培养，发现胚胎的成纤维细胞分裂传代行体外培养，发现胚胎的成纤维细胞分裂传代5050次次后开始衰退和死亡，而来自成年组织的成纤维细胞后开始衰退和死亡，而来自成年组织的成纤维细胞只能培养只能培养15153030代就开始死亡。代就开始死亡。细胞，至少是培养的细胞，不是不死的，而是有一定的寿命；它们的增殖能力不是无限的，而是有一定的界限，这就是Hayflick界
2、限。第1页/共40页2体外培养的年轻和老的人体外培养的年轻和老的人成纤维细胞的显微形态成纤维细胞的显微形态第2页/共40页3物种的寿命与体外培养物种的寿命与体外培养时细胞传代次数的关系时细胞传代次数的关系第3页/共40页4早老症儿童与正常儿童的比较早老症儿童与正常儿童的比较第4页/共40页5细胞衰老的特征细胞衰老的特征细胞内水分减少细胞内水分减少色素生成和色素颗粒沉积色素生成和色素颗粒沉积细胞核细胞核内质网内质网细胞质膜细胞质膜线粒体线粒体蛋白质合成的变化蛋白质合成的变化第5页/共40页6 细胞核的变化细胞核的变化体外培养的二倍体细胞，细胞核随着细胞分裂次数的增加不断增大细胞核的核膜内折（in
3、vagination）、染色质固缩化第6页/共40页7内质网的变化内质网的变化衰老动物内质网成分弥散性地分散于核周胞质中，粗面内质网的总量似乎是减少了第7页/共40页8 膜系统的变化膜系统的变化衰老的细胞，其膜流动性降低、韧性减小衰老细胞间间隙连接及膜内颗粒的分布也发生变化第8页/共40页9线粒体的变化线粒体的变化通常，细胞中线粒体的数量随龄减少，而其体积则随龄增大第9页/共40页10细胞衰老的理论细胞衰老的理论衰老的基因程序理论衰老的基因程序理论衰老的损伤积累理论衰老的损伤积累理论细胞衰老的端粒假说细胞衰老的端粒假说细胞衰老的线粒体损伤论细胞衰老的线粒体损伤论自由基理论自由基理论第10页/共
4、40页11氧化性损伤学说该理论认为，代谢过程中产生的活性氧基团或分子（reactive oxygen species，ROS）引发的氧化性损伤的积累，最终导致衰老。ROS主要有三种类型：O2-，即超氧自由基；OH-，即羟自由基；H2O2。它们的高度活性引发脂类、蛋白质和核酸分子的氧化性损伤，从而导致细胞结构的损伤乃至破坏。清 除ROS，就可以延长寿命第11页/共40页1213.2 13.2 细胞凋亡(Apoptosis)又又 称称 程程 序序 性性 细细 胞胞 死死 亡亡(programmed cell death,PCD)。是一个主动的由基因决定的自动结束生命的过程。是一个主动的由基因决定的
5、自动结束生命的过程。ApoptosisApoptosis的的概概念念源源自自于于希希腊腊语语，原原意意是是指指树树叶叶或花的自然凋落；或花的自然凋落；细细胞胞发发生生程程序序性性死死亡亡时时，就就像像树树叶叶或或花花的的自自然然凋凋落落一一样样，凋凋亡亡的的细细胞胞散散在在于于正正常常组组织织细细胞胞中中，无炎症反应，不遗留疤痕。无炎症反应，不遗留疤痕。死死亡亡的的细细胞胞碎碎片片很很快快被被巨巨噬噬细细胞胞或或邻邻近近细细胞胞清清除，不影响其他细胞的正常功能。除，不影响其他细胞的正常功能。第12页/共40页13细胞坏死与程序性细胞死亡细胞坏死与程序性细胞死亡第13页/共40页14细胞坏死与程
6、序性细胞死亡比较细胞坏死与程序性细胞死亡比较第14页/共40页15程程序序性性死死亡亡细细胞胞的的形形态态结结构构变变化化凋亡小体的形成凋亡小体逐渐为邻近的细胞吞噬并消化细细胞胞表表面面的的特特化化结结构构如如微微绒绒毛毛消消失失，细细胞胞间间接接触触的的消消失失，但但细细胞胞膜膜依依然然完完整整；线线粒粒体体大大体体完完整整，但但核核糖糖体体逐逐渐渐从从内内质质网网上上脱脱离离，内内质质网网囊囊腔腔膨膨胀胀，并并逐逐渐渐与与质质膜膜融融合合；染染色色质质固固缩缩，形形成成新新月月形形帽帽状状结结构构等等形形态态，沿沿着着核核膜膜分分布。布。第15页/共40页16细胞凋亡的生化特征细胞凋亡的主
7、要特征是形成大小为180200bp特征性的DNA ladders 凋亡细胞 tTG（组织转谷氨酰胺酶 tissue Transglutaminase）积累并达到较高水平第16页/共40页17程程序序性性死死亡亡细细胞胞的的D DN NA A降降解解第17页/共40页18细胞凋亡的检测形态学观测：染色法、透射和扫描电镜观察DNA电泳：DNA片段就呈现出梯状条带TUNEL测定法，即DNA断裂的原位末端标记法彗星电泳法（comet assay）流式细胞分析 根据凋亡细胞DNA断裂和丢失，采用碘化丙啶使DNA 产生激发荧光，用流式细胞仪检出凋亡的亚二倍体细 胞，同时又能观察细胞的周期状态。第18页/共
8、40页1913.3 13.3 程序性细胞死亡的机理程序性细胞死亡的机理程序性细胞死亡相关基因程序性细胞死亡相关基因程序性细胞死亡遗传学相关基因程序性细胞死亡遗传学相关基因程序性死亡的遗传控制程序性死亡的遗传控制程序性死亡抑制基因程序性死亡抑制基因程序性细胞死亡的过程程序性细胞死亡的过程死亡激活期死亡激活期死亡执行期死亡执行期第19页/共40页20雌雄同体的秀丽新小杆线虫雌雄同体的秀丽新小杆线虫第20页/共40页21秀丽新小杆线虫中参与秀丽新小杆线虫中参与程序性细胞死亡控制的基程序性细胞死亡控制的基因因决决定定死死亡亡的的两两个个基基因因，即即ces-1ces-1(ces(ces表表示示CECE
9、细胞存活的调控基因细胞存活的调控基因)和和ces-2ces-2基因基因执执 行行 死死 亡亡 的的 4 4个个 基基 因因：ced-3ced-3、ced-4ced-4、ced-9ced-9和和egl-1egl-1基因。基因。7 7个个与与死死亡亡细细胞胞被被吞吞噬噬细细胞胞所所吞吞噬噬的的基基因因，即即ced-1ced-1、ced-2ced-2、ced-5ced-5、ced-6ced-6、ced-7ced-7、ced-10ced-10和和ced-11ced-11。死亡细胞在吞噬体中被降解的基因死亡细胞在吞噬体中被降解的基因第21页/共40页22ced-3ced-3、ced-4ced-4、ced
10、-9ced-9和和egl1-4egl1-4个个基基因因构构成成了了线线虫虫执执行行死死亡亡的的“死死亡亡机器机器”(death machinery);(death machinery);ced-3 ced-3 和和ced-4ced-4是细胞杀手是细胞杀手;ced-9ced-9可可抵抵消消ced-3ced-3和和ced-4ced-4 的的作作用用，防防止止细细胞胞被被杀杀死死，因因此此是是存存活活因因子子;进一步的研究发现真正的细胞杀手是进一步的研究发现真正的细胞杀手是ced-3ced-3而不是而不是ced-4ced-4。第22页/共40页23程序性细胞死亡途径及相关基因程序性细胞死亡途径及相关
11、基因第23页/共40页24Caspase家族与凋亡Caspase活化胞外信号分子诱导的细胞凋亡途径天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶自自杀杀性性蛋蛋白白水水解解酶酶是是天天冬冬氨氨酸酸特特异异性性半半胱胱氨氨酸酸蛋蛋白白酶酶(cysteine-containing(cysteine-containing aspartateaspartatespecific specific protease),protease),简简 称称caspasecaspase;caspase-3caspase-3、6 6、7 7和和8 8 在在FAS/TNFFAS/TNF介介导导的的程程序序性细
12、胞死亡途径中起作用；性细胞死亡途径中起作用；caspase-9caspase-9和和3 3 一一起起参参与与线线粒粒体体中中Apaf-IApaf-I、细细胞色素胞色素c c介导的程序性细胞死亡介导的程序性细胞死亡;在人类，已经鉴定了在人类，已经鉴定了1010种不同的种不同的caspasecaspase。第24页/共40页25执行者执行者caspasecaspase在程序性细胞死亡中的作用在程序性细胞死亡中的作用第25页/共40页26能够被能够被caspasecaspase切割的靶蛋白切割的靶蛋白蛋白激酶蛋白激酶核纤层蛋白核纤层蛋白细胞结构蛋白细胞结构蛋白与与DNADNA修复相关的酶类修复相关的
13、酶类caspasecaspase激活的激活的DNaseDNase抑制蛋白。抑制蛋白。第26页/共40页27Caspase活化 Caspase自身以非活化的Procaspase存在，其激活依赖于其他的Caspase在它的天冬氨酸位点裂解活化或自身活化第27页/共40页28胞外信号分子诱导的细胞凋亡途径凋亡信号通路 当细胞接受凋亡信号分子(Fas,TNF(Fas,TNF等)后，凋亡细胞表面信号 分 子 受 体 相 互 聚 集 并 与 细 胞 内 的 衔 接 蛋 白(Adaptor(Adaptor protein)protein)结合，这些衔接蛋白又募集Procaspases聚集在受体部位，Proc
14、aspase相互活化并产生级联反应，使细胞凋亡下游Caspases活化后，作用底物：裂解核纤层蛋白，导致细胞核形成凋亡小体；裂解DNase结合蛋白，使DNase释放，降解DNA形成DNA Ladder;裂解参与细胞连接或附着的骨架和其他蛋白，使凋亡细胞皱缩、脱落，便于细胞吞噬；导致膜脂PS重排，便于吞噬细胞识别并吞噬。第28页/共40页29细细胞胞内内源源信信号号激激发发细细胞胞程程序序性性死死亡亡第29页/共40页30 Regulators and effectors apoptosis 第30页/共40页31Bcl-2家族、线粒体与细胞凋亡Bcl-2是一种原癌基因，是ced-9在哺乳类中的
15、同源物，能抑制细胞凋亡；与线粒体及内质网膜相结合；Bcl-2蛋白的羧基末端有一穿膜的结构域；Bcl-2家族成员的基因中，常常含有三个保守的Bcl-2同源区，即BH1，BH2和BH3Bcl-2、线粒体与细胞凋亡哺乳动物细胞中发现的Apaf2即是CytC第31页/共40页32基因产物功 能BCL-2凋亡抑制剂，可和 Bax及 Bak结合BCL-x其 L 型抑制凋亡，S 型促进凋亡，与 Bax及 Bak结合BCL-w凋亡抑制剂Bax凋亡促进剂，可与 BCL-2，BCL-XL，EIB19K 结合Bak凋亡促进剂，亦可作抑制剂，可与BCL-2，BCL-X和E1B19K结合MCL-1凋亡抑制剂Bad凋亡促
16、进剂，与 BCL-2 和 BCL-XL结合Ced-9线虫中的凋亡抑制剂，BCL-2同源物E1B19K腺病毒凋亡抑制剂，与 Bax和 Bak结合BCL-2家族成员第32页/共40页33Bcl-2、线粒体与细胞凋亡当Caspase8Caspase8活化后，它一方面作用于Procaspase3Procaspase3，另 一方面使BidBid裂解成2 2个片段，其中含BH3BH3结构域的C-C-端 片段被运送到线粒体，与Bcl-2/BaxBcl-2/Bax的BH3BH3结构域形成 复合物，导致细胞色素C C释放。CytCCytC与胞质中Ced4Ced4同源 物Apaf-1(凋亡蛋白酶活化因子apopt
17、osis protease activating factor)结合并活化Apaf-1，活化的Apaf-1再活 化Procaspase9，最后引起细胞凋亡第33页/共40页34第34页/共40页3514.2.4 14.2.4 程序性细胞死亡的意义程序性细胞死亡的意义动动物物机机体体靠靠对对细细胞胞增增殖殖和和细细胞胞周周期期的的正正负负控控制制以以及及对对程程序序性性细细胞死亡的正负控制来维持细胞总数的平衡和机体的生命活力。胞死亡的正负控制来维持细胞总数的平衡和机体的生命活力。程序性细胞死亡在形态建成中起重要作用。程序性细胞死亡在形态建成中起重要作用。第35页/共40页36动物细胞数量控制的途径动物细胞数量控制的途径第36页/共40页37程序性细胞死亡在小鼠程序性细胞死亡在小鼠脚趾形成中的作用脚趾形成中的作用第37页/共40页38蝌蚪向蛙发育的变态反应中蝌蚪向蛙发育的变态反应中程序性细胞死亡的作用程序性细胞死亡的作用第38页/共40页39程序性细胞死亡对发育中程序性细胞死亡对发育中神经细胞数量的调节神经细胞数量的调节第39页/共40页40感谢您的观看！第40页/共40页