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1、专题5DNA和蛋白质技术课题1DNA的粗提取与鉴定1.说出DNA的物理、化学性质。2.阐述DNA粗提取及鉴定的原理。一、提取DNA的方法1.提取生物大分子的基本思路选用一定的物理或化学方法分离具有不同_性质的_。对于DNA的粗提取而言,就是要利用DNA与_、_和_等在_性质方面的差异,提取DNA,去除其他成分。物理或化学生物大分子RNA蛋白质脂质物理和化学DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的_中溶解度不同,利用这一特点,选择适当的盐浓度就能使_充分溶解,而使杂质沉淀,或者相反,以达到分离目的。在_NaCl溶液浓度下,DNA的溶解度最小。此外,DNA不溶于_溶液,但是细胞中的某些蛋白质能溶于其中
2、。利用这一原理,可以将DNA与蛋白质进一步分离。NaCl溶液DNA0.14molL-1酒精2.DNA粗提取主要利用了DNA的溶解性和耐受性两个方面(1)利用DNA的溶解性。(2)利用DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性。蛋白酶能水解_,但是对_没有影响。大多数蛋白质不能忍受_的高温,而DNA在_以上才会变性。洗涤剂能够_,但对DNA没有影响。蛋白质DNA608080瓦解细胞膜二、DNA的鉴定在_的条件下,DNA遇_会被染成_色,因此_可以作为鉴定DNA的试剂。沸水浴二苯胺二苯胺蓝三、实验设计1.实验材料的选取原则上,凡是含有_的生物材料都可以考虑,但是,选用_的生物组织,成功的可能性更大。思考:生
3、活在牧区的人们,采集牛、羊和马血比较方便,他们用牛、羊、马血做实验材料合适吗?为什么?提示:不合适。因为哺乳动物成熟的红细胞中无细胞核,仅靠白细胞和淋巴细胞中的少数DNA,在实验中很难提取到。DNADNA含量相对较高2.破碎细胞,获取含DNA的滤液动物细胞的破碎比较容易,以鸡血为例,在鸡血细胞液中加入一定量的_,同时用_搅拌,过滤后收集_即可。如果实验材料是植物细胞,需要先用_溶解_。例如,提取洋葱的DNA时,在切碎的洋葱中加入一定的_和_,进行充分地搅拌和研磨,过滤后收集_蒸馏水玻璃棒滤液洗涤剂细胞膜洗涤剂食盐研磨液。NaCl溶液物质的量浓度为_,析出_,过滤去除_的杂质;再用物质的量浓度为
4、_的NaCl溶液溶解DNA。方案二:利用蛋白酶分解蛋白质,不分解DNA的特点。在滤液中加入嫩肉粉,嫩肉粉中的_能够分解蛋白质。方案三:利用蛋白质和DNA的变性温度不同的特点。将滤液放在_的恒温水浴箱中保温1015min,过滤获得DNA滤液。0.14molL-1DNA2molL-1木瓜蛋白酶6075溶液中3.去除滤液中的杂质最初获得的DNA滤液含有蛋白质、脂质等杂质,需要进一步提纯DNA。方案一:利用DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度的不同,在滤液中加入NaCl,使NaCl溶液物质的量浓度为_,过滤除去_的杂质;再调节2molL-1不溶4.DNA的析出与鉴定将处理后的溶液过滤,加入与滤液体积
5、_的、冷却的_(体积分数为95%),静置23min,溶液中会出现_,这就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿_搅拌,卷起丝状物,并用滤纸吸去上面的水分。取两支20mL的试管,各加入物质的量浓度为_的NaCl溶液5mL,将丝状物放入其中一支试管中,用玻璃棒搅拌,使丝状物溶解。然后,向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后,将试管置于沸水中加热5min,待试管冷却后,比较两支试管中溶液颜色的变化,看看溶解有DNA的溶液是否变_。相等酒精溶液白色丝状物一个方向2molL-1蓝四、操作提示1.以血液为实验材料时,每100mL血液中需要加入3g_,防止_。2.加入洗涤剂后,动作要_、_,否则容易产生_,
6、不利于后续步骤的操作。加入酒精和用玻璃棒搅拌时,动作要_,以免加剧DNA分子的_,导致DNA分子不能形成_。3.二苯胺试剂要_,否则会影响鉴定的效果。柠檬酸钠血液凝固轻缓柔和大量的泡沫轻缓断裂絮状沉淀现配现用1.制备鸡血细胞液时,要在新鲜的鸡血中加入柠檬酸钠的原因制备鸡血细胞液时,要在新鲜的鸡血中加入抗凝剂柠檬酸钠,防止血液凝固。其原理是柠檬酸钠能与血浆中Ca2+发生反应,生成柠檬酸钙络合物,血浆中游离的Ca2+大大减少,血液便不会凝固。因为鸡血红细胞和白细胞都有细胞核,DNA主要存在于细胞核中,所以在离心或静置沉淀后,要弃出上层清液血浆。2.实验成功的关键及注意事项(1)实验材料选用鸡血细胞
7、液,而不用鸡全血的主要原因是遗传物质DNA主要存在于血细胞的细胞核内。(2)盛放鸡血细胞液的容器,最好是塑料容器。玻璃表面带电荷,鸡血细胞破碎以后释放出的DNA中的磷酸基也带电荷,因而容易被玻璃容器吸附,提取到的DNA就会更少。因此,实验过程中最好使用塑料的烧杯和试管,可以减少提取过程的DNA的损失。(3)破碎细胞,释放DNA过程中,若是血细胞液,加水后必须充分搅拌,否则血细胞核不会充分破碎,溶解出的DNA量就会减少;若是植物细胞,需先用洗涤剂溶解细胞膜。(4)洗涤剂是多组分的混合物,在严格的科学实验中很少使用。实验室提取高纯度的DNA时,通常使用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、十二烷基硫酸
8、钠(SDS)或吐温等化学试剂。(5)实验过程中两次加入蒸馏水,操作目的各不相同:第一次向鸡血细胞液中加蒸馏水,目的是使血细胞通过吸水涨破,释放出核内的DNA。第二次向溶有DNA的滤液中加蒸馏水,目的是稀释NaCl溶液,使其浓度降至0.14molL-1,最终使大量DNA析出。(6)实验过程中几次过滤的目的:制备鸡血细胞液时过滤的目的是除去破裂的细胞膜等物质;在去杂时,将溶有DNA的高浓度NaCl溶液过滤的目的是除去不溶于NaCl溶液的杂质;去杂时,用低浓度NaCl溶液析出DNA后过滤的目的是除去溶于NaCl溶液中的杂质。过滤时采用单层纱布或尼龙布,不能使用滤纸,以减少DNA的损失。(7)提取DN
9、A丝状物用玻璃棒搅拌时,要缓缓沿一个方向搅拌,而且不能直接触碰烧杯壁,以便获得较完整的DNA分子。(8)用冷酒精浓缩和沉淀DNA时,所用的体积分数为95%的酒精必须充分预冷才能使用,冷酒精与含有DNA的氯化钠溶液的体积比是11。低温可抑制核酸水解酶的活性,防止降解DNA;低温可降低分子的运动,易于形成沉淀析出;低温有利于增加DNA分子柔韧性,减少断裂。(9)鉴定实验所得的丝状物的主要成分是DNA,可用二苯胺做鉴定试剂,鉴定出现蓝色,说明实验基本成功,如果不出现蓝色,可能所提取的DNA含量低,或是实验操作中出现错误。因为与DNA相比,蛋白质对温度、盐浓度、pH等条件要敏感得多,很容易失活;并且蛋
10、白质的空间结构多种多样,理化性质各不相同,使得蛋白质的提取没有一种统一的方法,只能根据特定蛋白质的特性摸索提取的条件,设计特定的方法。3.蛋白质提取与DNA提取的比较蛋白质提取难度大。题型一DNA提取、分离与鉴定原理【例题1】现代生物学已向两个方面发展,宏观研究的水平为生态系统水平,微观研究的水平为分子水平,对于分子的研究,其物质的提取和分离显得尤为重要。下面是关于DNA分子的提取和分离的相关问题,请回答:(1)在提取菜花细胞中的DNA时,采用的是研磨法,为什么不能像用鸡血那样,用蒸馏水使其破裂?(2)在提取实验过程中用到两种浓度的NaCl溶液,说明其作用:2molL-1NaCl溶液:;0.1
11、4molL-1NaCl溶液:。(3)在整个操作过程中,每100mL血液中加入3g柠檬酸钠的作用是。(4)鉴定DNA所用的试剂是。解析:(1)DNA分子提取中理想的材料为富含DNA的细胞,动物中鸡血红细胞具有细胞核,放入蒸馏水中会使细胞涨破释放出DNA,而植物细胞中含有细胞壁,不能因吸水而涨破。(2)实验过程中两次用到NaCl溶液,初次为2molL-1NaCl溶液,用于溶解DNA,而0.14molL-1NaCl溶液会使DNA析出。(3)为了防止凝血现象的发生应加入柠檬酸钠。(4)鉴定DNA所用的试剂为二苯胺试剂。答案:(1)植物细胞具有细胞壁,不会吸水涨破,只有通过研磨,才能释放出DNA。(2)
12、溶解DNA分子,过滤并除去不溶于NaCl溶液的杂质使DNA分子析出,过滤并除去溶于NaCl溶液中的杂质(3)防止出现凝血现象(4)二苯胺试剂反思领悟:在NaCl溶液浓度低于0.14molL-1时,DNA的溶解度随NaCl溶液浓度的增加而逐渐降低;在0.14molL-1时,DNA溶解度最小;当NaCl溶液浓度继续增加时,DNA的溶解度又逐渐增大。题型二DNA粗提取与鉴定实验中的操作【例题2】(2010江苏高考)某生物兴趣小组开展DNA粗提取的相关探究活动,具体步骤如下:材料处理:称取新鲜的花菜、辣椒和蒜黄各2份,每份10g。剪碎后分成两组,一组置于20、另一组置于-20条件下保存24h。DNA粗
13、提取:第一步:将上述材料分别放入研钵中,各加入15mL研磨液,充分研磨。用两层纱布过滤,取滤液备用。分数为95%的冷酒精溶液,然后用玻璃棒缓缓地向一个方向搅拌,使絮状物缠绕在玻璃棒上。第二步:先向6只小烧杯中分别注入10mL滤液,再加入20mL体积第三步:取6支试管,分别加入等量的2molL-1NaCl溶液溶解上述絮状物。DNA检测:在上述试管中各加入4mL二苯胺试剂,混合均匀后,置于沸水中加热5min,待试管冷却后比较溶液的颜色深浅,结果如下表:材料保存温度花菜辣椒蒜黄20+-20+(注:“+”越多表示蓝色越深)分析上述实验过程,回答下列问题:(1)该探究性实验课题名称是。(2)第二步中“缓
14、缓地”搅拌,这是为了减少。(3)根据实验结果,得出结论并分析。结论1:与20相比,相同实验材料在-20条件下保存,DNA的提取量较多。结论2:。针对结论1,请提出合理的解释:。(4)氯仿密度大于水,能使蛋白质变性沉淀,与水和DNA均不相溶,且对DNA影响极小。为了进一步提高DNA纯度,依据氯仿的特性,在DNA粗提取第三步的基础上继续操作的步骤是:,然后用体积分数为95%的冷酒精溶液使DNA析出。(2)DNA分子为链状,很容易断裂,所以应缓缓地向一个方向搅拌。(3)分析表格可看出,同种材料在-20时DNA提取量较多,不同材料在同种温度下保存时,蒜黄的DNA提取量最多。低温下酶活性较低,DNA降解
15、慢。(4)根据题意,可用氯仿将DNA溶液中的蛋白质析出,进一步提高DNA的纯度。解析:(1)分析表格可知,实验目的在于探究材料的不同和保存温度的不同对DNA提取量的影响。速度慢(4)将第三步获得的溶液与等量的氯仿充分混合,静置一段时间,吸取上清液答案:(1)探究不同材料和不同保存温度对DNA提取量的影响(2)DNA断裂(3)等质量的不同实验材料,在相同的保存温度下,从蒜黄提取的DNA量最多低温抑制了相关酶的活性,DNA降解1DNA在下列哪一浓度的NaCl溶液中,溶解度最低?()A.2molL-1B.0.015molL-1C.0.14molL-1D.5molL-1解析:DNA在不同浓度的NaCl
16、溶液中溶解度不同,当NaCl溶液的物质的量浓度为0.14molL-1时,溶解度最低。答案:C2若选择的实验材料为植物细胞,破碎细胞时要加入一定量的洗涤剂和食盐。加入洗涤剂的目的是()。A.利于DNA的溶解B.分离DNA和蛋白质C.溶解细胞膜D.溶解蛋白质解析:洗涤剂是一种离子去污剂,能溶解细胞膜,有利于DNA的释放;食盐的主要成分是NaCl,有利于DNA的溶解。答案:C3在提取DNA的过程中,最好使用塑料试管和烧杯,目的是()。A.不易破碎B.减少DNA的损失C.增加DNA的含量D.容易刷洗解析:DNA易黏附于玻璃管上,造成DNA量的损失。答案:B4在DNA的粗提取过程中,初步析出DNA和提取较纯净的DNA所用的药品的浓度及其名称分别是()。0.1gmL-1的柠檬酸钠溶液2molL-1的NaCl溶液0.14molL-1的NaCl溶液体积分数为95%的酒精溶液0.015molL-1的NaCl溶液A.B.C.D.答案:B解析:初步析出DNA和提取纯净的DNA所用的药品和浓度分别是0.14molL-1NaCl溶液和体积分数为95%的酒精溶液。