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1、Contents1.现代生物技术概述现代生物技术概述 2.酶工程基本原理酶工程基本原理 3.基因工程基本原理基因工程基本原理 4.微生物细胞工程微生物细胞工程 第1页/共124页5.1 现代生物技术概述5.1.1 现代生物技术定义19861986年国家科委制订中国生物技术政策纲要时，将生物技术定义为：以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其他基础学科的科学原理，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需产品或达到某种目的。第2页/共124页现代生物技术定义先进的工程技术手段是指基因工程、酶工程、细胞工程和发酵工程等新技术。改造生物体是指获得优良品质的动物、植物或微生物品系
2、。生物原料则是指生物体的某一部分或生物生长过程中所能利用的物质，如淀粉、糖蜜、纤维素等有机物，也包括一些无机化合物，甚至某些矿石。第3页/共124页现代生物技术定义为人类生产出所需的产品包括粮食、医药、食品、化工原料、能源、金属等各种产品。目的则包括疾病的预防、诊断与治疗，环境污染的检测与治理等。第4页/共124页5.1 现代生物技术概述5.1.2 现代生物技术及应用现代生物技术主要包括：基因工程、酶工程、细胞工程和发酵工程。这些技术并不是各自独立的，而是相互联系、相互渗透的（图5-15-1）。其中基因工程技术是核心技术，它能带动其他技术的发展，如通过基因工程对细菌或细胞改造后获得的工程菌或细
3、胞，必须通过发酵工程或细胞工程来生产有用物质。第5页/共124页现代生物技术及应用图5-1 基因工程、酶工程、细胞工程与发酵工程之间的关系第6页/共124页现代生物技术及应用生物技术已广泛应用于农业、医药、化工、食品、环境保护等众多领域。生物技术的应用过程示意图如图5-25-2所示。第7页/共124页现代生物技术及应用图5-2 生物技术的应用过程示意图第8页/共124页5.1 现代生物技术概述5.1.3 现代环境生物技术 （1）环境生物技术的产生由于人口的快速增长，自然资源的大量消耗，全球环境状况目前正在急剧恶化：水资源短缺、土壤荒漠化、有毒化学品污染、臭氧层破坏、酸雨肆虐、物种灭绝、森林减少
4、等。人类的生存和发展面临着严峻的挑战，迫使人类进行一场“环境革命”来拯救人类自身。在这场环境革命中，环境生物技术担负着重大使命，并且作为一种行之有效、安全可靠的手段和方法，起着核心的作用。第9页/共124页现代环境生物技术现代环境生物技术是现代生物技术应用于环境污染防治的一门新兴边缘学科。它诞生 与2020世纪8080年代末期，以高新技术为主体，并包括对传统生物技术的强化与创新。环境生物技术涉及众多的学科领域，主要由生物技术、工程学、环境学和生态学等组成。它是由生物技术与环境污染防治工程及其他工程技术紧密结合形成的，既具有较强的基础理论，又具有鲜明的技术应用特点。第10页/共124页现代环境生
5、物技术广义上讲，凡是自然界中涉及环境污染控制的一切与生物技术有关的技术，都可称为环境生物技术。德国国家生物技术研究中心的K.Timmis博士将环境生物技术定义为应用生物圈的某些部分使环境得以控制，或治理预定要进入生物圈的污染物的生物技术。第11页/共124页包括以下三方面1在环境中应用的生物技术，这是相对于一些在高度控制条件下的密闭反应器中进行的生物技术而言；2涉及到环境中某些可以看作为一个生物反应器部分的生物技术.3作用于一些必定要进入环境的材料的生物技术.第12页/共124页现代环境生物技术美国密歇根州立大学的J.M.TiedjeJ.M.Tiedje教授认为，环境生物技术的核心是微生物学过
6、程。近年来，环境生物技术发展极其迅猛，已成为一种经济效益和环境效益俱佳的、解决复杂环境问题的最有效手段。国际上认为21世纪生物技术产业化的十大热点中，环境污染监测、有毒污染物的生物降解和生物降解塑料三项属于环境生物技术的内容。第13页/共124页现代环境生物技术严格地说，环境生物技术指的是直接或间接利用生物或生物体的某些组成部分或某些机能，建立降低或消除污染物产生的生产工艺，或者能够高效净化环境污染，同时又生产有用物质的工程技术。环境生物技术作为生物技术的一个分支学科，它除了包括生物技术所有的基础和特色之外，还必须与污染防治工程及其他工程技术相结合。第14页/共124页现代环境生物技术环境生物
7、技术可分为高、中、低三个层次。高层次是指以基因工程为主导的现代污染防治生物技术，如基因工程菌的构建、抗污染型转基因植物的培育等；中层次是指传统的生物处理技术，如活性污泥法、生物膜法，及其在新的理论和技术背景下产生的强化处理技术和工艺，如生物流化床、生物强化工艺等；第15页/共124页现代环境生物技术低层次是指利用天然处理系统进行废物处理的技术，如氧化塘、人工湿地系统等。第16页/共124页现代环境生物技术环境生物技术的三个层次均是污染治理不可缺少的生物技术手段。高层次的环境生物技术需要以现代生物技术知识为背景，为寻求快速有效的污染治理与预防新途径提供了可能，是解决目前出现的日益严重且复杂的环境
8、问题的强有力手段。中层次的环境生物技术是当今废物生物处理中应用最广泛的技术，中层次的技术本身也在不断改进，高技术也不断渗入，因此，它仍然是目前环境污染治理中的主力军。低层次的环境生物技术，其最大特点是充分发挥自然界生物净化环境的功能，投资运行费用低，易于管理，是一种省力、省费用、省能耗的技术。第17页/共124页现代环境生物技术各种工艺与技术之间可能存在相互渗透或交叉应用的现象，有时难以确定明显的界限。某项环境生物技术可能集高、中、底三个层次的技术于一身。为了解决日益严重的环境污染问题，需配合使用高、中、低三个层次的技术，针对不同的问题，采用不同的技术或不同技术的组合。第18页/共124页现代
9、环境生物技术（2）环境生物技术的研究范围现代环境生物技术应用现代生物技术服务于环境保护，目前环境生物技术面临的任务有：解决基因工程菌从实验室进入模拟系统和现场应用过程中，其遗传稳定性、功能高效性和生态安全性等方面的问题；第19页/共124页现代环境生物技术开发废物资源化和能源化技术，利用废物生产单细胞蛋白、生物塑料、生物肥料以及利用废物生产生物能源，如甲烷、氢气、乙醇等；建立无害化生物技术清洁生产新工艺，如生物制浆、生物絮凝剂、煤的生物脱硫、生物冶金等；发展对环境污染物的生理毒性及其对生态影响的检测技术。第20页/共124页现代环境生物技术现代生物技术的发展，给环境生物技术的纵深发展增添了强大
10、的动力，生物技术无论是在生态环境保护方面，还是在污染预防和治理方面以及环境监测方面，都显示出独特的功能和优越性。环境生物技术也面临许多难题，而这些难题的解决，依赖于现代生物技术的发展去开辟道路。人们有理由、有信心相信，最终环境问题解决的希望寄托在现代环境生物技术的进展和突破上。第21页/共124页5.2酶工程基本原理酶工程是研究酶的生产和应用的一门新的技术性学科，是利用酶的催化作用进行物质转化（合成有用物、分解有害物）的技术，是将酶学理论与化工技术结合而形成的新技术。酶工程的内容包括：酶的生产与分离纯化、酶分子修饰、酶固定化、酶反应动力学与反应器和酶的应用等方面。第22页/共124页5.2酶工
11、程基本原理酶工程的主要任务是：通过预先设计，经过人工操作控制而获得大量所需的酶，并通过各种方法使酶发挥其最大的催化功能，即利用酶的特定功能，借助工程学手段为我们提供产品或分解有害物质。第23页/共124页5.2酶工程基本原理酶工程的目的是：为我们提供产品或以特定的功能来为我们服务。本节主要介绍酶固定化、固定化酶反应动力学及酶在污染治理中的应用等方面。第24页/共124页酶固定化概念5.2.1 酶固定化概念酶的固定化技术就是通过物理或化学方法将酶束缚在一定区间内制成仍具有催化活性的酶的衍生物即固定化酶(immobilized enzyme)。第25页/共124页酶固定化概念酶是生物体为维持自身的
12、生命活动而产生的，它适于在生物体内进行化学反应。但是，作为人类用于生产所需要的催化剂还不够理想。例如，酶在一般情况下，对热、强酸、强碱和有机溶剂等均不够稳定，即使给予合适的条件也会随着反应时间的延续，反应速度逐渐下降最后导致失括。同时，酶也不能反复利用且酶只能在水溶液中使用，不能在有机溶剂中使用。而固定化酶能克服上述的缺点，它像有机化学反应中所使用的固体催化剂一样，同时仍具有生物体内酶一样强的催化活性。第26页/共124页酶固定化概念固定化酶具有下列优点：可以使反应过程管道化、自动化，产物易从反应液中回收；酶的稳定性有所改进；酶的使用效率提高。第27页/共124页酶固定化概念酶的固定化使酶的应
13、用达到新的水平，可把酶直接应用于化学工业的反应系统。固定化酶的研究不仅具有实用价值，在探索酶的作用机制方面也提供了新的研究途径。第28页/共124页酶固定化概念固定化酶的研究开始于20世纪50年代。1953年格仑布霍费(Grubhofer)和施莱思(schleith)将聚氨苯乙烯树脂重氮化，并将羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶或核糖核酸酶等结合固定到该树脂上，第一次实现了酶的固定化。经过十多年的努力，到了60年代后期，固定化酶已经广泛应用于食品、医药和发酵等工业的生产。1978年，我国首次使用固定化5磷酸二酯酶生产5核苷酸。到70年代初，出现了固定化细胞，细胞的固定化包括微生物细胞、动物细胞、植物细胞
14、或各种细胞器的固定化。第29页/共124页酶固定化概念固定化酶和固定化细胞研究的第一阶段主要是载休的开发，固定化方法的研究及其应用技术的开发。目前，第一阶段已基本完成，进入了第二阶段的研究。第二阶段的主要研究内容可归纳如下：在需要辅酶(NAD+或FAD)或ATP、ADP、AMP的酶反应体系的固定化中，辅酶系或ATP、ADP、AMP系和其再生系的建立；疏水体系或含水很低的体系里固定化酶的催化反应的研究；为了防止固定化过程中酶活力下降，添加辅助物的研究：固定化活细胞的研究。总之，酶和细胞固定化技术发展迅猛，它的应用将会引起应用酶学及生物工程学的巨大变革。第30页/共124页酶固定化概念固定化酶的制
15、备酶的催化活性依赖于酶的空间结构及活性中心。所以在固定化时，要选择适当的条件，力图不使其活性中心的基团受到影响。操作时应尽量在温和条件下进行，避免高温、强酸、强碱处理，以尽量保持酶蛋白天然的高级结构。第31页/共124页酶固定化概念酶固定化的方法很多，但没有一种对任何酶都适用的通用方法。目前采用的固定化方法大致可分为3类，载体结合法(包括共价结合法、离子结合法、物理吸附法)、交联法和包埋法（包括聚合物包埋法、微胶囊包埋法)。图5-3为几种常用的酶固定化方法示意图。第32页/共124页酶固定化概念图5-3 酶固定化方法示意图(1)离子结合，(2)共价结合；(3)交联；(4)聚合物包埋；(5)疏水
16、作用i(6)脂质体包埋；(7)微胶囊 第33页/共124页酶固定化概念上述几种方法也可并用，称为混合法。例如：交联和包埋并用，离子结合和包埋并用，共价结合和包埋并用等。现将各种方法的原理及优缺点简要介绍如下：第34页/共124页酶固定化概念裁体结合法 载体结合法是用共价键、离子键和物理吸附法把酶固定在纤维素、琼脂糖、左旋糖酐、甲壳质、多孔性玻璃和离子交换树脂等载体的固定化。第35页/共124页酶固定化概念a共价结合法：利用酶蛋白分子中的氦基酸残基与载体上的基团通过化学反应形成共价键而使酶固定化的方法。共价结合的具体方法很多，可分为重氮法、肽法、烷化法和载体交联法等。其中，重氮法最为常用。共价结
17、合法要求控制条件较苛刻，反应激烈，操作复杂，常常引起酶蛋白的高级结构发生变化，并导致活性中心破坏，难以制得高活力的标准品，有时会使酶原来具有的底物特异性发生变化。但此方法制得的固定化酶的酶分子和裁体间结合极牢固，即使用高浓度底物溶液或盐溶液处理也不会使酶分子从载体上脱落。第36页/共124页酶固定化概念b离子结合法：通过离子效应，将酶固定到具有离子交换基团的非水溶性载体上。常用的载体有DEAF纤维素、TEAE纤维素、ECTROLA纤维素及DEAE-交联葡聚糖等阴离子交换性载体。与共价结合法相比较，离子结合法的操作简便，处理条件较温和，酶分子的高级结构和活性中心很少改变，可得到活性较高的固定化酶
18、。但载体和酶分子之间的结合力不够牢固，易受缓冲液种类和pH的影响，在离子强度较大的状态下进行反应，有时酶分子会从载体上脱落下。第37页/共124页酶固定化概念c物理吸附法：是将酶分子吸附到不溶于水的惰性载体上。常用的载体有活性炭、多孔玻璃、酸性白土、漂白土、高岭土、矾土、硅胶、磷酸钙凝胶、羟基磷灰石、淀粉等。其中以活性炭应用最广，例如把吸附有霉菌糖化酶的活性炭装入柱内，以适当流速道人淀粉溶液，流出液中可以获得葡萄糖。物理吸附法不会明显改变酶分子的高级结构，因此不易使酶分子活性中心受到破坏。其缺点是酶分子与载体的相互作用较弱，被吸附的酶分子极易从载体上脱落。第38页/共124页酶固定化概念交联法
19、 交联法是利用双功能试剂的作用，在酶分子之间发生交联，凝集成网状结构而制成的固定化酶。双功能试剂主要有戊二醛、顺丁烯二酸酐和乙烯共聚物。酶蛋白中游离氨基、酚基、咪唑基及巯基均可参与交联反应。其中以戊二醛法最为常用。戊二醛和酶蛋白的游离氨基形成席夫(Schiff)碱而使酶分子交联。交联法与共价结合法一样，反应条件比较剧烈，固定化酶的活力较低。又由于交联法制备的固定化酶颗粒较细，此法不宜单独使用，如与吸附法或包埋法联合使用好效果。又由于交联法制备，则可达到加固的良好效果。第39页/共124页酶固定化概念包埋法包埋法是将酶包埋在聚合物凝胶的微细网格中或被半透性的聚合物膜所包围，使酶分子不能从凝胶的网
20、格中或膜中漏出，而小分子的底物和产物则可以自由通过凝胶网格和半透膜。第40页/共124页酶固定化概念a a聚合物包埋法：将酶包埋在聚合物的凝胶格中的方法。最常用的凝胶有聚丙烯酰胺凝胶、淀粉凝胶、明胶、海藻胶等，其中以聚丙烯酰胺凝胶为最好。制备时，在酶溶液中加入丙烯酰胺单体和交联剂N N，N-N-甲叉双丙酰胺，在通入氮气的条件下，加聚合反应催化剂四甲基二胺和聚合引发剂过硫酸钾等进行聚合，酶分子便被包埋在聚合的凝胶内。第41页/共124页酶固定化概念b b微胶囊法：微胶囊法是以半透性的高聚物薄膜包围含有酶分子的液滴。制备方法有3 3类：界面聚合法、液中干燥法和相分离法。第42页/共124页酶固定化
21、概念界面聚合法是应用亲水性单体和疏水性单体在界面上发生聚合而将酶包围起来。液中干燥法是把酶液在含有高聚物的有机溶剂中进行乳化分散，然后再把该乳化液转移到水溶液中，使之干燥，形成高聚物半透膜而将酶分子包裹起来。相分离法是将聚合物溶解在不与水混溶的有机溶液中，然后将酶乳化分散在此溶液中，再在搅拌下徐徐加入引起相分离的非极性溶剂，聚合物的浓厚溶液将酶液包围，聚合物相继析出，形成半透膜，酶就被包裹在内。第43页/共124页酶固定化概念包埋法操作简便，酶分子仅仅是包埋起来而未起化学反应可用来制备各种固定化酶，一般酶活力较高。但有时在化学聚合反应时，需要在比较苛刻的条件下进行，容易导致酶的失话，所以要设计
22、好包埋条件。另外，此法对作用于大分子底物的酶类不适用。第44页/共124页酶固定化概念固定化酶的性质游离酶在水溶液中，酶分子与底物分子同处于液相，几乎是十分邻近的。酶固定化后，酶分子牢固地结合于载体，处于与游离酶不同的微环境中，因此，固定化的结果往往引起酶性质的改变。原因主要来自两方面：一方面是酶本身的变化，主要由于活性中心的氨基酸残基、空间结构和电荷状态发生了变化；另一方面是载体的物理和化学性质的影响，主要由于在固定化酶的周围，形成了能对底物产生立体障碍的扩散层以及静电的相互作用等引起的。第45页/共124页酶固定化概念固定化酶性质的变化主要表现在以下几方面：底物特异性的改变最适pH的改变最
23、适温度的变化动力学常数的变化稳定性变化第46页/共124页酶固定化概念底物特异性的改变 同定化酶的活力一般比天然酶低，其底物特异性也可能发生变化。例如，用羧甲基纤维素作载体，肽法固定化的胰蛋白酶，对高分子底物酪蛋白只显示原酶活力的3，而对低分子底物苯酰精氨酸对-硝基酰替苯胺的活力保持100。所以，一般认为酶被固定到载体后可引起立体障碍，使高分子底物与酶分子表面的邻近效应受到干扰，从而显著降低了酶的活性。而低分子底物则受到立体障碍的影响较小，底物分子容易接近酶分子，因而与原酶活力无显著差别。对以低分子物质为底物的酶，经固定化后，多数情况下底物特异性不发生变化。第47页/共124页酶固定化概念最适
24、pH的改变由带负电载体制备的固定化酶的最适pH比游离酶的最适pH高，而用带正电载体制备的则情况相反，而用不带电的载体，最适pH不变(但也有最适pH改变的例子)。这可能解释为：当酶分子被结合到带负电(或带正电)载体上时，酶蛋白的阳离子(或阴离子)数增多，从而造成固定化酶反应区域的pH值比外部溶液的pH值偏酸(或偏碱)，这样，造成酶的反应是在比反应液的pH偏酸(或偏碱)一侧进行的，从而使最适pH值转移到碱性(或酸性)一侧。最适pH改变而pH活性曲线的形状不变的现象，称为最适pH的平行移动。第48页/共124页酶固定化概念最适温度的变化酶固定化后，最适温度有时会发生变化。例如，以共价结合法固定化色氨
25、酸酶的最适温度比固定化前高5-15，而以烷化法固定化氨基酰化酶的最适温度则比固定化前有所降低，多数情况下，最适温度并不发生变化。第49页/共124页酶固定化概念动力学常数的变化酶固定化于电中性载体后，固定化酶的表观米氏常数往往比游离酶的米氏常数高，而最大反应速度变小。具有与载体电荷相反的底物由于静电相吸，固定化酶与游离酶相比，表观米氏常数往往减小。若载体与底物有一方不带电，则往住表观米氏常数不变或稍有增加。表观米氏常数的减少，对固定化酶的实际应用是有利的，可使反应更为完全。第50页/共124页酶固定化概念稳定性变化酶固定化后，稳定性普遍增加，主要表现在对热的稳定性及贮藏的稳定性增加，且在蛋白质
26、变性剂，如尿素、盐酸胍及有机溶剂中仍保持相当活性，对蛋白水解酶的抵抗性也增加等。这些特性都有利于酶的应用。第51页/共124页固定化酶反应动力学5.2.2固定化酶反应动力学酶经固定化后，其反应动力学发生显著的变化。固定化酶反应动力学较酶反应动力学复杂得多，影响因素也是多方面的，有些目前还处于研究探讨阶段。本节根据有关文献著作的报道，进行简要介绍。第52页/共124页固定化酶反应动力学固定化对酶反应系统的影响通常，大多数酶在固定化后，反应速度有所下降（个别除外）。其原因如下：酶构象改变：由于酶分子在固定化过程中发生了某种扭曲，影响了酶分子的三维结构，导致酶与底物结合能力或酶催化底物转化能力的改变
27、。第53页/共124页固定化酶反应动力学立体障碍：酶经固定化后，由于载体的存在，给酶的活性部位或调节部位造成了某种空间障碍，干扰与影响了酶与底物或其他效应物的接触。特别是当底物分子量较大时，影响就更大。微扰效应：由于载体的疏水、亲水及荷电性质，使得紧邻固定化酶的环境区域（称微环境）发生变化，与宏观反应体系不同，对酶产生微扰效应，改变了酶的催化能力及酶对效应物作出调节反应的能力。第54页/共124页固定化酶反应动力学分配效应：由于底物与其他各种效应物（包括H十与OH一）和载体间产生了静电、亲水或疏水之类的相互作用，造成了它们在载体内外侧浓度的不等分配，从而影响酶反应速度。扩散限制：酶固定化后，底
28、物、产物和其他效应物在载体内外之间的迁移扩散速度受到了某种限制，造成了不等分布。扩散限制与这些物质的分子量大小、载体的结构及酶反应性质有关。第55页/共124页固定化酶反应动力学扩散限制分为外扩散限制和内扩散限制。外扩散限制是指底物、产物和其他效应物在宏观体系与酶颗粒表面间的扩散受到了限制，此限制主要存在于酶颗粒周围的处于层流状态的液膜（NernstNernst）层。内扩散限制是指在多孔性固定化载体内，底物、产物和其他效应物在载体颗粒表面与载体内的酶活性部位间的扩散受到的限制。第56页/共124页固定化酶反应动力学就外扩散限制来说，由于催化反应是在底物到酶活性部位以后才进行的，因此底物浓度在液
29、膜层中的不等分布是线性梯度（产物浓度的不等分布也如此，但方向相反）。而就内扩散限制来说，由于催化反应与扩散过程几乎是同时进行的，所以底物在多孔载体内形成一种非线性梯度分布。第57页/共124页固定化酶反应动力学以上各种原因是相互交叉、相互关联地存在着的，它们综合在一起决定着固定化酶的动力学性态。其中构象改变、立体障碍及微扰效应是直接影响酶的因素，这些因素对动力学的影响很难加以定量分析和概括，只能通过实验加以测定。它们的消除或改善只有依赖于选择合适的固定化条件、方法和载体。分配效应和扩散限制则是通过底物、产物和效应物在载体内外的不等分布来影响固定化酶的催化反应速度。第58页/共124页固定化酶反
30、应动力学固定化酶反应动力学假定酶被均匀地固定分布于载体内部，在稳定状态下进行不可逆的S P 的反应。反应时，外部的流动状况不影响载体内部，底物一边扩散，通过载体内的细孔，一边进行反应，底物在转移过程中将逐渐消耗。因此底物浓度的分布以及单位体积载体中酶反应速度也将随载体表面到载体内部的距离的增大而降低，且降低是非线性的。我们可用微分底物衡算导出其反应速度方程。第59页/共124页5.3 基因工程概述 第60页/共124页5.3.1基因工程概述基因工程的诞生基因工程的诞生在理论上得益于三大发现：Avevy(1934)等人的研究成果证明了遗传物质是DNA而不是蛋白质，从而解决了遗传信息的来源问题；W
31、atson-Crick(1953)的双螺旋结构学说阐明了信息载体DNA的复制并解决了信息传递的方式问题;Monod和Jacob（1961）提出操纵子学说，Nireberg(1966)等破译了遗传密码，叙述了“中心法则”，解决了遗传信息流向和表达的问题。第61页/共124页基因工程的诞生在技术理论上得益于三大发明：Smith、Wilcox（1970）和Boyer（1972）等发现了限制性核酸内切酶和Khorana(1970)等发现了DNA连接酶，使DNA分子的切割和连接成为可能，从而为基因工程的技术操作奠定了良好的基础；Lederberg(1946)发现细菌的F-性因子，以后相继发现和建立了其它
32、外源基因运载体，Cohen（1973）首次将质粒作为基因工程的运载体使用；Baltimore和Temin(1970)等人发现了逆转录酶，打破了中心法则，使真核基因的制备成为可能。第62页/共124页具备了以上的理论与技术基础，基因工程诞生的条件已经成熟。1972年Berg(伯格)等人在世界上首次进行了DNA的体外重组，得到了包含SV40和DNA的重组DNA分子。1973年Cohen(科恩)等人将编码卡那霉素的质粒DNA和编码四环素抗性的基因进行重组并转化大肠杆菌，结果转化菌同时表现出了卡那霉素和四环素的双重抗性，至此基因工程技术宣告诞生。随着分子生物学基础技术的发展，随后又出现了杂交技术、序列
33、测定技术、PCR技术等一系列新技术，从而使基因工程技术日臻完善，第63页/共124页基因工程的定义基因工程（Genetic engineering)是将不同生物的基因在体外人工剪切组合并和载体（质粒、噬菌体、病毒）DNA连接，然后转入适当的宿主细胞中进行扩增，并使转入的基因在细胞内表达，产生所需要的蛋白质。第64页/共124页目前基因工程的发展极为迅速，为生物学、医学、农学和环境科学等学科的理论研究及工业、农业和人类日常生活都带来了革命性的变化，其意义毫不逊色于有史以来任何一次技术革命，概括起来体现在以下三个方面：用于大规模生产生物分子；改造现有物种及设计构建新物种；寻找、分离和鉴定生物体的遗
34、传信息资源。第65页/共124页基因工程的主要内容一个完整的体外DNA重组过程主要包括以下步骤；获取目的基因并进行必要的改造；选择合适的载体并加以适当的修饰;将目的基因与载体连接，获得含有目的基因的重组载体；将重组载体导入相应细胞(称为宿主细胞)并筛选出合重组DNA的细胞第66页/共124页DNA重组流程示意图第67页/共124页获得含有重组载体的细胞后，通过大量培养重组细胞，可以获得目的基因的大量拷贝或目的基因的表达产物。通常将来自于同一始祖的一群相同分子、细菌、细胞或动物称为克隆，获取大量单一克隆的过程称为克隆化，也称无性繁殖。广义的重组DNA技术不仅包括DNA体外重组技术及操作过程，还包
35、括表达产物的后续处理过程和技术，如：蛋白质的分离纯化、第68页/共124页5.3.2目的基因的获得(1)从基因组DNA中分离此法适用于结构简单的原核生物中的多拷贝基因，可直接从组织或供体中用理化方法或合适的限制性内切酶将DNA消化后分离获得。第69页/共124页基因的随机断裂方法采用一定的理化方法将基因组DNA随机断裂，可以得到大小基本一致的DNA片段。这些方法有用专一性核酸酶酶解，化学处理或普遍使用的机械切割法。DNA在溶液状态是呈细长线性分子，刚性强，在受到机械剪切作用时很容易断裂。用超声波处理DNA溶液，可得到平均长度在一定范围的DNA片段，使用组织捣碎，控制一定的条件，也可以使基因组D
36、NA得到可控的剪切，如在1500rpm下，捣碎30min，可以得到平均大小为8kb的DNA片段。第70页/共124页限制性内切酶降解一般多采用“鸟枪法”，即限制性内切酶部分酶解法。限制性内切酶降解所产生的片段的长短与其识别序列的长短直接相关。理论上讲，一个识别几个碱基的限制酶位点在基因组的分布几率为1/4n(n为限制性内切酶所识别的特异序列中的核苷酸个数)，因此采用基因组DNA进行限制酶的不完全酶解，可以得到长短不一的片段，用于构建基因文库。第71页/共124页基因的化学合成法化学合成法是利用自动DNA合成仪直接合成基因序列的方法，适合于长度较短的基因，其前提条件是:该基因的核苷酸序列已知。对
37、于较大的基因，可以分段合成DNA短片段，再经过DNA连接酶作用依次连接成一个完整的基因链。第72页/共124页目前核酸的合成方法中，固相合成法是最为常用的。其原理是：首先将寡核昔酸链3末端的第1个核苷酸先固定在一个不溶性的高分子(例硅胶微粒)上；然后，从此末端开始逐一加上脱氧核苷酸以延长DNA链，每延长1个核苷酸经历1个循环，合成的核苷酸被固定在固相载体上，而过量的未接上的反应物或分解物则经过过滤或洗涤除去；至合成所需的长度后，再将寡核苷酸链从固相载体上洗脱，经分离纯化后得到所需的最后产物。第73页/共124页通过RNA合成cDNA以从细胞中提取的mRNA为模扳，借逆转录酶反转录生成cDNA，
38、然后进行基因克隆，从而获得某种特定基因。合成cDNA技术的应用不仅依赖于分离得到相当纯的mRNA，而且还取决于mRNA的含量。如果种mRNA在总则RNA中的含量高，就比较容易提取纯化。反之如果种mRNA在总则RNA中的含量低，直接获得就相当困难。第74页/共124页 c-DNA 合成原理示意图第75页/共124页用聚合酶链反应(PCR)方法扩增目的基因片段聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction,PCR)是一种在体外模拟天然DNA复制过程的核酸扩增技术，用于扩增位于两段已知序列之间的DNA区段。它的基本原理是以分别位于待扩增DNA区段两侧的两段序列互不相同并分别与模板
39、DNA两条链上的各一段互补的寡核苷酸为引物。第76页/共124页反应分三步：变性(denaturation)-通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA；退火(annealling)-随之将反应混合液突然冷却至某一温度，反应体系中摩尔数大大过量的引物DNA可与其互补的模板在局部形成杂交链；延伸(extension)-在DNA聚合酶、4种dNTP底物及Mg2+存在下，催化以引物为起始点的53的DNA链延伸反应。第77页/共124页聚合酶链式反应示意图第78页/共124页利用PCR技术可以直接从染色体DNA或cDNA快速简便地获得待克隆的目的基因片段，快速地进行外源基因的克隆操作。P
40、CR技术扩增目的基因的前提是必须知道目的基因片段两侧或附近的DNA序列，并据此合成扩增引物。由PCR体外扩增的片段可经克隆作进一步分析用，也可直接纯化作各种探针用。该法也解决了微量基因片段的来源问题。第79页/共124页基因文库与cDNA文库的构建大部分未知基因不能用上述方法获得，需要先构建文库，再经筛选获得目的基因。文库分为基因文库和cDNA文库两种。第80页/共124页基因文库(genomic library)是指含有某种生物体全部基因片段的重组DNA克隆群体。构建基因组文库时，先将细胞染色体DNA提纯，用限制性内切酶将染色体DNA切割成大小不等的许多片段，与同一类载体拼接，继而转入受体菌
41、扩增，这样就构建了含有多个克隆的基因组DNA文库。基因组DNA文库理论上可以涵盖基因组的全部基因信息。第81页/共124页如果以细胞总mRNA为模板，经反转录生成互补DNA(cDNA)，酶切后的DNA片段与合适的载体连接，转入受体菌，这样建立的就是cDNA文库(cDNA library)。cDNA文库理论上包含了细胞全部mRNA信息，可以利用适当方法从cDNA文库中筛选出目的cDNA，这是获取结构基因的主要方法。第82页/共124页基因文库与cDNA文库的构建步骤第83页/共124页5.3.3基因工程载体载体是指可以携带目的基因进入宿主细胞的运载工具。基因工程的载体应该符合以下条件：具有自主复
42、制能力，能带动外原基因在宿主细胞内复制和扩增；具有较多的拷贝数，易于分离提纯：分子质量相对较小，便于操作，并有足够的接纳目的基因的容量；有供外原基因插入的多个单一限制性核酸内切酶位点，即多克隆位点(MCS)，用于目的基因的克隆；有一个或多个筛选标记(如：对抗菌素的抗性、营养缺陷型或显色表型反应等)。第84页/共124页按照来源不同，可以将载体分为质粒载体、噬菌体载体、黏粒载体、病毒载体和人工染色体载体等类型；按照用途不同，可将载体分为克隆载体和表达载体。以下简要介绍几类常用的载体。第85页/共124页质粒载体质粒是某些细胞中独立于染色体以外的共价闭环的小分子双链DNADNA，它具有独立的复制能
43、力，并可在细胞分裂中与染色体一道分配到子细胞中。不同质粒的分子质量大小不同，大的可达数百千碱基对(kb)(kb)，小的只有23kb23kb。在革兰氏阴性和阳性细菌、酵母菌以及其他一些真菌中都发现有质粒的存在。此外，质粒往往携带一些抗性基因，这为重组子的选择提供极大便利。第86页/共124页早期以天然质粒作为裁体，现在使用的均为改造过的人工质粒，常用的有：pBR322pBR322、pUCpUC及pGEMpGEM等多种系列的质粒载体。质粒载体不仅可以用于细菌，也可以用于酵母、哺乳动物细胞及昆虫细胞等，既可用于目的基因的克隆，也可用于目的基因的表达。第87页/共124页pBR322pBR322是经典
44、质粒的代表，它是由3 3个天然质粒的不同部分拼接而成，全长4.36kb4.36kb，是环状双链DNADNA分子。在细菌中的拷贝数多，便于制备：有多克隆位点，用于插入外源DNADNA片段;有四环素(TcR)(TcR)和氨苄青霉素(ApR)(ApR)两个抗药性基因标记，缺失抗药性基因的大肠杆菌被pBR322pBR322质粒转化后便从其获得了抗生素抗性。两个抗生素抗性基因中均含有外源DNADNA克隆位点，插入外源DNADNA后，相应抗性基因即失活。第88页/共124页质粒pBR322的结构图第89页/共124页噬菌体载体噬菌体的生活周期包括溶菌周期和溶原周期：当噬菌体侵入大肠杆菌后，可以在细菌内扩增
45、，并使细胞裂解，释放出大量的噬菌体颗粒；也可通过溶原途径，使其DNA整合到大肠杆菌的染色体上，以前噬菌体的形式潜伏下来。在某些特定条件下，整合的噬菌体被切割下来，进入裂解周期第90页/共124页噬菌体感染途径第91页/共124页噬菌体的基因组DNADNA长约48kb48kb，在宿主体外与蛋白质结合包装为含有双链线状DNADNA分子的颗粒。由于受到包装效率的限制，其连接目的基因后的总长度应为噬菌体基因组总长度的7575一105105，超过这一范围，重组噬菌体的活力会大大降低。第92页/共124页根据克隆的方式不同，噬菌体载体可以分为插入型载体和取代(置换)型载体两类：插入型载体适合克隆6-8kb
46、大小的DNA片段，常用于cDNA的克隆或cDNA文库的构建，如：gt10、gtll等；置换型载体可以允许插入长度达30 kb的外派DNA片段，因而适用于基因组DNA的克隆及基因组DNA文库和cDNA文库的构建，典型代表为EMBL系列和Charon系列载体。第93页/共124页黏性质粒与人工染色体黏性质粒(Cosmid)(Cosmid)又叫柯斯质粒，它是由质粒和噬菌体的coscos黏性末端构建而成的载体系列。黏粒大小为46kb46kb，兼有噬菌体和质粒两方面的优点，可以克隆3145kb3145kb的外源DNADNA片段，而且能被包装成为具有感染能力的噬菌体颗粒。黏粒主要用于真核细胞基因组文库的构
47、建。第94页/共124页人工染色体是为了克隆更大的DNA片段而发展起来的新型载体，其中YAC(酵母人工染色体)是在酵母细胞中用于克隆外源DNA大片段的克隆载体。YAC可以接受1002000kb的外源DNA的插入，是人类基因组计划中物理图谱绘制采用的主要载体。另外还有BAC(细菌人工染色体)以及目前正在发展的MAC(哺乳动物人工染色体)，这些载体在人类基因组计划和其他基因组项目中起到了关键性作用。第95页/共124页上述载体主要为克隆载体，用于目的基因的克隆、扩增、序列分析及体外定点突变等。为了在宿主细胞中表达外源目的基因，获得大量表达产物而应用的载体被称为表达载体。表达载体除了含有克隆载体中的
48、主要元件外，还含有表达目的基因所需要的各种元件第96页/共124页5.3.4基因工程工具酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶，简称为限制酶，是能够识别和切割双链DNA中特定核苷酸序列的一类核酸酶。限制性内切酶与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰体系，其功能为限制(切割)外源DNA和保护自身DNA，维持细菌自身遗传性状的稳定。第97页/共124页限制性核酸内切酶，按照其对辅助因子的需求和切割双链DNA的特性，可以分为I、和型，三种不同的限制性核酸内切酶具有不同的特性第98页/共124页基因工程技术中所用的主要是型限制性内切酶，其特点为：识别与切割特定的核苷酸序列，因而产生特异性切口。型限制性内切酶的识
49、别序列常为4646个核苷酸的回文结构，即同一条单链以中心轴对折可形成互补的双链。限制性内切酶消化后的DNADNA可以形成没有单链突出的末端，称为平端或钝端，如：SmaSma；也可以形成有单链突出的所谓黏性末端。黏性末端中有5 5突出的黏性末端，如：BamH;BamH;也有3 3突出的黏性末端第99页/共124页限定性内切酶切割DNA产生的DNA片段末端第100页/共124页DNA聚合酶DNA聚合酶催化以DNA为模板合成DNA的反应，在基因工程技术中用于DNA的体外合成。经常使用的DNA聚合酶有大肠杆菌DNA聚合酶I(全酶)、大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段(KIenow酶)、T4DNA
50、聚合酶及耐高温DNA聚合酶等。这些DNA聚合酶的共同特点是，它们都能够把脱氧核糖核苷酸连续地加到双链DNA分子引物链的3-羟基末端上。第101页/共124页 该酶具有3 3种活性：5 53 3聚合酶活性、5 53 3外切酶活性及3 35 5外切酶活性。它在分子克隆中主要用于制备供核酸分子杂交用的放射性同位素标记的DNADNA探针。大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶I I第102页/共124页 它是由大肠杆菌DNA聚合酶I(全酶)经枯草杆菌蛋白酶处理后产生出来的大片段分子。Klenow聚合酶仍具有53聚合酶活性和35外切酶活性，但是失去了53外切酶活性，主要用于填补经限制酶消化所形成的DN