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1、1 1 1 1涵盖范围涵盖范围 本单元包括选修本单元包括选修1 1全部内容全部内容微生物的培养与传统发酵技术及实践应用；植物微生物的培养与传统发酵技术及实践应用；植物组织培养技术及组织培养技术及DNADNA和蛋白质的提取与分离技术；酶的研究和实践应用；植物有效成和蛋白质的提取与分离技术；酶的研究和实践应用；植物有效成分的提取方法、过程及注意事项。分的提取方法、过程及注意事项。单元教学分析单元教学分析第1页/共68页2 2 2 2考情分析考情分析 考查力度：考查力度：相对固定，如山东理综只出一个相对固定，如山东理综只出一个8 8分的简答题。分的简答题。考查内容及形式考查内容及形式 微生物的培养与
2、应用多以简答题形式考查；微生物的培养与应用多以简答题形式考查；酶的研究与应用，常与必修酶的研究与应用，常与必修1 1中酶的本质、特性等知识有机结合考查；中酶的本质、特性等知识有机结合考查；植物组织培养常与植物有效成分提取相结合考查；植物组织培养常与植物有效成分提取相结合考查；传统发酵技术及实践应用多以简答题形式考查；传统发酵技术及实践应用多以简答题形式考查；酶的研究、酶的研究、DNADNA和蛋白质提取技术多以选择题形式考查。和蛋白质提取技术多以选择题形式考查。第2页/共68页3 3 3 3复习指导复习指导 (1)(1)复习线索复习线索 以转基因以转基因微生物培养微生物培养酶生产酶生产酶应用为线
3、索，系统复习微生物培酶应用为线索，系统复习微生物培养技术、酶的研究和实践应用。养技术、酶的研究和实践应用。以技术手段、技术流程为主线，复习发酵、组织培养、有效成分及以技术手段、技术流程为主线，复习发酵、组织培养、有效成分及DNADNA、蛋白、蛋白质提取有关知识。质提取有关知识。(2)(2)复习方法复习方法 列表比较法列表比较法DNADNA、蛋白质的提取与分离。、蛋白质的提取与分离。实践联系实践联系发酵技术、植物有效成分提取技术。发酵技术、植物有效成分提取技术。实验联系实验联系植物组织培养、微生物培养实验过程。植物组织培养、微生物培养实验过程。第3页/共68页第 4343 课时生物技术在组织培养
4、、DNADNA和蛋白质分离及有效成分提取中的应用第4页/共68页突破考点提炼方法第5页/共68页考点考点134 134 134 134 生物技术实践应用生物技术实践应用植物组织培养植物组织培养1 1植物组织培养的过程植物组织培养的过程(1)(1)菊花组织培养过程菊花组织培养过程(2)(2)月季的花药培养月季的花药培养第6页/共68页2.2.植物组织培养技术和花药离体培养技术的异同植物组织培养技术和花药离体培养技术的异同植物组织培植物组织培养技术养技术花药离体培花药离体培养技术养技术 相相同同点点理论依据理论依据植物细胞的全能性植物细胞的全能性 基本过程基本过程外植体愈伤组织丛芽生根外植体愈伤组
5、织丛芽生根移栽；无菌技术及接种移栽；无菌技术及接种操作基本相同操作基本相同 影响因素影响因素选材、营养、激素、选材、营养、激素、pHpH、温、温度、光照等度、光照等 不不同同点点选材选材体细胞体细胞生殖细胞生殖细胞(精子精子)生殖方式生殖方式无性生殖无性生殖有性生殖有性生殖 提醒提醒提醒提醒同一株绿色植物不同部分的细胞经培养获得的愈伤组织的基因相同。同一株绿色植物不同部分的细胞经培养获得的愈伤组织的基因相同。第7页/共68页 3 3植物激素与组织培养植物激素与组织培养 (1)(1)生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键性激素，其作生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化
6、的关键性激素，其作用及特点：用及特点：在生长素存在的情况下，细胞分裂素的作用呈现加强的趋势。在生长素存在的情况下，细胞分裂素的作用呈现加强的趋势。使用顺序不同，结果不同，具体如下：使用顺序不同，结果不同，具体如下：使用顺序使用顺序实验结果实验结果先使用生长素，后使用细胞分裂先使用生长素，后使用细胞分裂素素有利于细胞分裂，但细胞不分有利于细胞分裂，但细胞不分化化先使用细胞分裂素，后使用生长先使用细胞分裂素，后使用生长素素细胞既分裂又分化细胞既分裂又分化同时使用同时使用分化频率提高分化频率提高用量比例不同，结果也不同用量比例不同，结果也不同第8页/共68页 4 4影响植物组织培养的因素影响植物组织
7、培养的因素 (1)(1)材料：植物的种类、材料的年龄和保存时间的长短等都会影响实验结果。一材料：植物的种类、材料的年龄和保存时间的长短等都会影响实验结果。一般来说，容易进行无性繁殖的植物容易进行组织培养。嫩枝生理状态好，容易诱导脱般来说，容易进行无性繁殖的植物容易进行组织培养。嫩枝生理状态好，容易诱导脱分化和再分化。分化和再分化。(2)(2)营养：常用的培养基是营养：常用的培养基是MSMS培养基，其中含有的大量元素是培养基，其中含有的大量元素是N N、P P、S S、K K、CaCa、MgMg，微量元素是，微量元素是FeFe、MnMn、B B、ZnZn、CuCu、MoMo、I I、CoCo，有
8、机物有甘氨酸、烟酸、肌醇、维，有机物有甘氨酸、烟酸、肌醇、维生素、蔗糖等。生素、蔗糖等。提醒提醒提醒提醒培养基中添加蔗糖的目的是提供营养和调节渗透压。培养基中添加蔗糖的目的是提供营养和调节渗透压。第9页/共68页 (3)(3)环境条件：环境条件：pHpH、温度、光照等环境条件。如菊花组织培养所需、温度、光照等环境条件。如菊花组织培养所需pHpH为为5.85.8，温度为温度为18182222，光照条件为每日用日光灯照射，光照条件为每日用日光灯照射1212小时。小时。第10页/共68页 1 1(2011201120112011江苏卷，江苏卷，16161616)下列有关植物组织培养的叙述，正确的是下
9、列有关植物组织培养的叙述，正确的是 ()A A愈伤组织是一团有特定结构和功能的薄壁细胞愈伤组织是一团有特定结构和功能的薄壁细胞 B B二倍体植株的花粉经脱分化与再分化后得到稳定遗传的植株二倍体植株的花粉经脱分化与再分化后得到稳定遗传的植株 C C用人工薄膜将胚状体、愈伤组织等分别包装可制成人工种子用人工薄膜将胚状体、愈伤组织等分别包装可制成人工种子 D D植物耐盐突变体可通过添加适量植物耐盐突变体可通过添加适量NaClNaCl的培养基培养筛选而获得的培养基培养筛选而获得对位训练对位训练第11页/共68页 答案答案答案答案 D D 解析解析解析解析在普通培养基中添加适量的在普通培养基中添加适量的
10、在普通培养基中添加适量的在普通培养基中添加适量的NaClNaClNaClNaCl，制成选择，制成选择，制成选择，制成选择培养基，可用来筛选植物耐盐突变体，故选项培养基，可用来筛选植物耐盐突变体，故选项培养基，可用来筛选植物耐盐突变体，故选项培养基，可用来筛选植物耐盐突变体，故选项D D D D正确。愈正确。愈正确。愈正确。愈伤组织的细胞排列疏松而无规则，是一种高度液泡化的呈伤组织的细胞排列疏松而无规则，是一种高度液泡化的呈伤组织的细胞排列疏松而无规则，是一种高度液泡化的呈伤组织的细胞排列疏松而无规则，是一种高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞；二倍体植株的花粉经离体培养后无定形状态的薄壁细胞；二
11、倍体植株的花粉经离体培养后无定形状态的薄壁细胞；二倍体植株的花粉经离体培养后无定形状态的薄壁细胞；二倍体植株的花粉经离体培养后得到单倍体植株，该单倍体高度不育，不能稳定遗传；用得到单倍体植株，该单倍体高度不育，不能稳定遗传；用得到单倍体植株，该单倍体高度不育，不能稳定遗传；用得到单倍体植株，该单倍体高度不育，不能稳定遗传；用人工薄膜将胚状体等进行包装可制成人工种子，愈伤组织人工薄膜将胚状体等进行包装可制成人工种子，愈伤组织人工薄膜将胚状体等进行包装可制成人工种子，愈伤组织人工薄膜将胚状体等进行包装可制成人工种子，愈伤组织不能作为制作人工种子的材料，故选项不能作为制作人工种子的材料，故选项不能作
12、为制作人工种子的材料，故选项不能作为制作人工种子的材料，故选项A A A A、B B B B、C C C C错误。错误。错误。错误。第12页/共68页 排雷排雷(1)(1)菊花的组织培养实验中，应选择未开花植物的茎上部新萌生的侧枝；菊花的组织培养实验中，应选择未开花植物的茎上部新萌生的侧枝；月季花药的离体培养实验中，应选择花粉发育过程中的单核靠边期的花粉进行培养。月季花药的离体培养实验中，应选择花粉发育过程中的单核靠边期的花粉进行培养。(2)(2)植物组织培养过程应该在无菌的条件下进行，外植体消毒所用消毒剂为体积植物组织培养过程应该在无菌的条件下进行，外植体消毒所用消毒剂为体积分数为分数为70
13、%70%的酒精和质量分数为的酒精和质量分数为0.1%0.1%的氯化汞溶液，所使用的清洗液是无菌水。的氯化汞溶液，所使用的清洗液是无菌水。(3)(3)组织培养时不用天然激素而是用人工合成的激素，是因为植物中存在相应的组织培养时不用天然激素而是用人工合成的激素，是因为植物中存在相应的分解天然激素的酶而没有分解相应的人工合成激素的酶，所以天然激素在植物体内分解天然激素的酶而没有分解相应的人工合成激素的酶，所以天然激素在植物体内作用和存在的时间短，人工合成激素的作用和存在的时间长，作用效果明显。作用和存在的时间短，人工合成激素的作用和存在的时间长，作用效果明显。(4)(4)在初期，菊花的组织培养需光照
14、，月季花药的离体培养不需光照，而在后期在初期，菊花的组织培养需光照，月季花药的离体培养不需光照，而在后期均需光照。均需光照。第13页/共68页考点考点135135135135 生物技术实践应用生物技术实践应用DNADNADNADNA的粗提取与鉴定的粗提取与鉴定 1 1原理、方法和目的原理、方法和目的基本原理基本原理方法方法目的目的DNADNA在不同浓度在不同浓度的的NaClNaCl溶液中的溶液中的溶解度不同，在溶解度不同，在0.14 mol/L0.14 mol/L的的NaClNaCl溶液中的溶溶液中的溶解度最低解度最低溶于溶于NaClNaCl溶液中溶液中并稀释并稀释NaClNaCl溶液为溶液为
15、2 mol/L2 mol/L时，时，DNADNA溶溶解，而部分蛋白质发生盐析生成沉解，而部分蛋白质发生盐析生成沉淀，通过过滤可除去部分蛋白质及不淀，通过过滤可除去部分蛋白质及不溶于溶于NaClNaCl溶液的杂质溶液的杂质当当NaClNaCl溶液稀释至溶液稀释至0.14 mol/L0.14 mol/L时，时，DNADNA析出，过滤可除去溶于析出，过滤可除去溶于NaClNaCl溶溶液的部分蛋白质和其他杂质液的部分蛋白质和其他杂质DNADNA不被蛋白酶不被蛋白酶所水解所水解加入嫩肉粉加入嫩肉粉嫩肉粉中含木瓜蛋白酶，水解蛋白质嫩肉粉中含木瓜蛋白酶，水解蛋白质DNADNA不溶于酒精不溶于酒精溶液溶液加入
16、冷却酒精加入冷却酒精(95%)(95%)DNADNA析出，除去溶于酒精的蛋白质析出，除去溶于酒精的蛋白质DNADNA可被二苯胺可被二苯胺染成蓝色染成蓝色加入二苯胺，并加入二苯胺，并沸水浴沸水浴鉴定鉴定DNADNA第14页/共68页 2.2.实验步骤及注意事项实验步骤及注意事项 (1)(1)步骤：提取血细胞核物质步骤：提取血细胞核物质(蒸馏水涨破蒸馏水涨破)溶解溶解(2 mol/L(2 mol/L的的NaClNaCl溶液溶液)过滤过滤(除杂质除杂质)析出析出(滴蒸馏水，降滴蒸馏水，降NaClNaCl溶液浓度至溶液浓度至0.14 mol/L)0.14 mol/L)过滤过滤再溶解再溶解(2(2 mo
17、l/Lmol/L的的NaClNaCl溶液溶液)过滤过滤进一步提纯进一步提纯(体积分数为体积分数为95%95%的冷却酒精的冷却酒精)鉴定。鉴定。(2)(2)鉴定鉴定不变蓝不变蓝对照组对照组溶液逐渐溶液逐渐变蓝变蓝丝状丝状物物(DNA)(DNA)均加入：均加入：4mL4mL二苯胺二苯胺试剂试剂2mol/L2mol/LNaClNaCl溶液溶液5mL5mL实验组实验组图示图示结果结果加入物质加入物质比较比较第15页/共68页第16页/共68页 (3)(3)注意事项注意事项 制备鸡血细胞液时，要在取鸡血的同时加入柠檬酸钠，静置后上层是血清，制备鸡血细胞液时，要在取鸡血的同时加入柠檬酸钠，静置后上层是血清
18、，下层为所需要的血细胞。下层为所需要的血细胞。两次加蒸馏水的目的不同，一是涨破细胞，二是稀释溶液。两次加蒸馏水的目的不同，一是涨破细胞，二是稀释溶液。鉴定鉴定DNADNA时需沸水浴加热。时需沸水浴加热。二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。第17页/共68页对位训练对位训练 2 2(2010201020102010江苏卷，江苏卷，32323232)某生物兴趣小组开展某生物兴趣小组开展DNADNA粗提取的相关探究活动，具体粗提取的相关探究活动，具体步骤如下：步骤如下：材料处理：称取新鲜的花菜、辣椒和蒜黄各材料处理：称取新鲜的花菜、辣椒和蒜黄各2
19、2份，每份份，每份10 g10 g。剪碎后分成两组，。剪碎后分成两组，一组置于一组置于2020、另一组置于、另一组置于2020条件下保存条件下保存24 h24 h。DNADNA粗提取：粗提取：第一步：将上述材料分别放入研钵中，各加入第一步：将上述材料分别放入研钵中，各加入15 mL15 mL研磨液，充分研磨。用两研磨液，充分研磨。用两层纱布过滤，取滤液备用。层纱布过滤，取滤液备用。第二步：先向第二步：先向6 6只小烧杯中分别注入只小烧杯中分别注入10 mL10 mL滤液，再加入滤液，再加入20 mL 20 mL 体积分数为体积分数为95%95%的冷酒精溶液，然后用玻璃棒缓缓地向一个方向搅拌，使
20、絮的冷酒精溶液，然后用玻璃棒缓缓地向一个方向搅拌，使絮状物缠绕在玻璃棒上。状物缠绕在玻璃棒上。第18页/共68页 第三步：取第三步：取6 6支试管，分别加入等量的支试管，分别加入等量的2 mol/L NaCl2 mol/L NaCl溶液溶解上述絮状物。溶液溶解上述絮状物。DNADNA检测：在上述试管中各加入检测：在上述试管中各加入4 mL4 mL二苯胺试剂，混合均匀后，置于沸水中加二苯胺试剂，混合均匀后，置于沸水中加热热5 min5 min，待试管冷却后比较溶液的颜色深浅，结果如下表：，待试管冷却后比较溶液的颜色深浅，结果如下表：材料保存温度材料保存温度花菜花菜辣椒辣椒蒜黄蒜黄20202020
21、 (注：注：“”越多表示蓝色越深越多表示蓝色越深)分析上述实验过程，回答下列问题：分析上述实验过程，回答下列问题：第19页/共68页 (1)(1)该探究性实验课题的名称是该探究性实验课题的名称是_ _。(2)(2)第二步中第二步中“缓缓地缓缓地”搅拌，这是为减少。搅拌，这是为减少。(3)(3)根据实验结果，得出结论并分析。根据实验结果，得出结论并分析。结论结论1 1：与：与2020相比，相同实验材料在相比，相同实验材料在2020条件下保存，条件下保存，DNADNA的提取量较多。的提取量较多。结论结论2 2：_ _。针对结论针对结论1 1，请提出合理的解释：，请提出合理的解释：_ _。(4)(4
22、)氯仿密度大于水，能使蛋白质变性沉淀，与水和氯仿密度大于水，能使蛋白质变性沉淀，与水和DNADNA均不相溶，且对均不相溶，且对DNADNA影影 响极小。为了进一步提高粗提取时响极小。为了进一步提高粗提取时DNA DNA 的纯度，在第三步的基础上继续操作的步骤：的纯度，在第三步的基础上继续操作的步骤：温度对温度对DNADNA提取量的影响提取量的影响DNADNA断裂断裂等质量的不同实验材料，在相同的保存温度下，等质量的不同实验材料，在相同的保存温度下，活性，活性，DNADNA降解速率慢降解速率慢探究不同材料和不同保存探究不同材料和不同保存从蒜黄提取的从蒜黄提取的DNADNA量最多量最多低温抑制了相
23、关酶的低温抑制了相关酶的第20页/共68页_ _，然后用，然后用体积分数为体积分数为95%95%的冷酒精溶液使的冷酒精溶液使DNADNA析出。析出。将第三步获得的溶液与等量的氯仿充分混合，将第三步获得的溶液与等量的氯仿充分混合，静置一段时间，静置一段时间，吸取上清液吸取上清液 解析解析根据步骤中选择了不同的材料，在不同温度下的处理，可判断出本实验根据步骤中选择了不同的材料，在不同温度下的处理，可判断出本实验的目的是探究不同材料和不同温度对的目的是探究不同材料和不同温度对DNADNA提取量的影响，是提取量的影响，是DNADNA粗提取与鉴定实验的粗提取与鉴定实验的应用；应用；“缓缓地缓缓地”搅拌能
24、够有效防止因搅拌能够有效防止因DNADNA断裂而影响实验结果；结论可以从表格断裂而影响实验结果；结论可以从表格中颜色深浅得出，低温下获得的中颜色深浅得出，低温下获得的DNADNA含量较多是因为低温抑制了相关酶的活性，使含量较多是因为低温抑制了相关酶的活性，使DNADNA降解速率减慢；依据氯仿的特性，可以在第三步获得的溶液中加入等量氯仿，降解速率减慢；依据氯仿的特性，可以在第三步获得的溶液中加入等量氯仿，静置并吸取蛋白质含量较少的静置并吸取蛋白质含量较少的DNADNA上清液，获得纯度更高的上清液，获得纯度更高的DNADNA。排雷排雷 (1)(1)实验材料实验材料 动物动物 鸡血细胞鸡血细胞液的优
25、点液的优点第21页/共68页 提醒提醒：人和哺乳动物成熟的红细胞中不含细胞核，也没有：人和哺乳动物成熟的红细胞中不含细胞核，也没有DNADNA，不适于作为，不适于作为DNADNA提取的材料，但却是提取血红蛋白的理想材料。提取的材料，但却是提取血红蛋白的理想材料。植物：新鲜菜花、蒜黄、菠菜等。植物：新鲜菜花、蒜黄、菠菜等。(2)(2)步骤中注意问题：步骤中注意问题：实验中有多个步骤要用到玻璃棒搅拌，使用时注意玻璃棒不要碰到烧杯底。实验中有多个步骤要用到玻璃棒搅拌，使用时注意玻璃棒不要碰到烧杯底。实验中所用的二苯胺是一种有毒性的试剂，使用时注意不要让药液接触到皮实验中所用的二苯胺是一种有毒性的试剂
26、，使用时注意不要让药液接触到皮肤或身体的其他部位。肤或身体的其他部位。第22页/共68页考点考点136 136 136 136 生物科技新手段生物科技新手段PCRPCRPCRPCR扩增技术扩增技术 1 1 1 1原理：原理：DNADNADNADNA复制。复制。2 2 2 2条件：模板、原料、酶、条件：模板、原料、酶、ATPATPATPATP。3 3 3 3场所：体外场所：体外PCRPCRPCRPCR扩增仪。扩增仪。4 4 4 4方向：方向：DNADNADNADNA复制的具体过程涉及复制的具体过程涉及DNADNADNADNA双链的方向。双链的方向。DNADNADNADNA的两条链是反向平行的，为
27、了明确地表示的两条链是反向平行的，为了明确地表示DNADNADNADNA的方向，的方向，通常将通常将DNADNADNADNA的羟基的羟基(OH)(OH)(OH)(OH)末端称为末端称为3333端，两磷酸基团的端，两磷酸基团的末端称为末端称为5555端。端。DNADNADNADNA聚合酶不能从头开始合成聚合酶不能从头开始合成DNADNADNADNA，而，而只能从只能从3333端延伸端延伸DNADNADNADNA链，因此，链，因此，DNADNADNADNA复制需要引物。当复制需要引物。当引物与引物与DNADNADNADNA母链通过碱基互补配对结合后，母链通过碱基互补配对结合后，DNADNADNAD
28、NA聚合酶就聚合酶就能从引物的能从引物的3333端开始延伸端开始延伸DNADNADNADNA链，链，DNADNADNADNA的合成方向总是的合成方向总是从子链的从子链的5555端向端向3333端延伸。端延伸。第23页/共68页 5 5过程过程 (1)(1)变性：当温度上升到变性：当温度上升到9090以上时，双链以上时，双链DNADNA解旋为单链，如下图：解旋为单链，如下图：(2)(2)复性：温度下降到复性：温度下降到5050左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNADNA结结合，如下图：合，如下图：第24页/共68页 (3)(3)延伸：温度上升到延伸
29、：温度上升到7272左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在DNADNA聚合酶的作用聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的下，根据碱基互补配对原则合成新的DNADNA链，如下图：链，如下图：6 6检测检测PCRPCR扩增效果扩增效果 (1)(1)将样品进行将样品进行5050倍稀释：取倍稀释：取2 L PCR2 L PCR反应液，加入反应液，加入98 L98 L蒸馏水。蒸馏水。(2)(2)以蒸馏水作为空白对照，在波长以蒸馏水作为空白对照，在波长260 nm260 nm处，将紫外分光光度计的读数调节至处，将紫外分光光度计的读数调节至零。零。(3)(3)将步骤将步骤中的中的
30、DNADNA稀释液加入到厚度为稀释液加入到厚度为1 cm1 cm的比色杯中，测定其在的比色杯中，测定其在260nm260nm处的处的光吸收值光吸收值(用用A260nmA260nm表示表示)。第25页/共68页第26页/共68页 注意注意DNADNA在在260nm260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，可以利用的紫外线波段有一强烈的吸收峰，可以利用DNADNA的这一特点的这一特点进行进行DNADNA含量的测定。含量的测定。(4)(4)根据下面的公式计算根据下面的公式计算DNADNA含量。含量。DNADNA含量含量(g/mL)(g/mL)50A50A260nm260nm稀释倍数稀释倍数 注意注意据
31、测定，据测定，1 g/mL1 g/mL的的DNADNA在厚度为在厚度为1 cm1 cm比色杯中，比色杯中，ODOD260260为为1 1相当于相当于50 50 g/mLg/mL的双链的双链DNADNA。以此为标准，可以计算出样品中的。以此为标准，可以计算出样品中的DNADNA浓度。浓度。7 7PCRPCR技术的应用技术的应用 PCRPCR技术模拟细胞内技术模拟细胞内DNADNA的复制过程，实现对某一段的复制过程，实现对某一段DNADNA的扩增。的扩增。PCRPCR技术能在几技术能在几小时内将极微量的小时内将极微量的DNADNA特异性地扩增上百万倍，从而有效地解决了因为样品中特异性地扩增上百万倍
32、，从而有效地解决了因为样品中DNADNA含含量太低而难以对样品进行分析研究的难题，大大提高了对量太低而难以对样品进行分析研究的难题，大大提高了对DNADNA分子的分析和检测能力，分子的分析和检测能力，被广泛地应用于基因克隆、基因序列分析、遗传病诊断、古生物学研究以及刑侦破被广泛地应用于基因克隆、基因序列分析、遗传病诊断、古生物学研究以及刑侦破案、亲子鉴定等诸多方面。案、亲子鉴定等诸多方面。第27页/共68页 3 3 3 3多聚酶链式反应多聚酶链式反应(PCR)(PCR)(PCR)(PCR)是一种体外迅速扩增是一种体外迅速扩增DNADNADNADNA片片段的技术。请回答下列有关段的技术。请回答下
33、列有关PCRPCRPCRPCR技术的基本原理及应用问技术的基本原理及应用问题。题。(1)DNA(1)DNA(1)DNA(1)DNA的两条链是反向平行的，通常将的两条链是反向平行的，通常将_ _ _ _的末端称为的末端称为5555端，当引物与端，当引物与DNADNADNADNA母链通过碱基互补配对结母链通过碱基互补配对结合后，合后，DNADNADNADNA聚合酶就能从引物的开始延伸聚合酶就能从引物的开始延伸DNADNADNADNA链。链。(2)PCR(2)PCR(2)PCR(2)PCR利用利用DNADNADNADNA的热变性原理解决了打开的热变性原理解决了打开DNADNADNADNA双链的双链的
34、问题，但又导致了问题，但又导致了DNADNADNADNA聚合酶失活的新问题。到聚合酶失活的新问题。到20202020世纪世纪80808080年代，科学家从一种年代，科学家从一种TaqTaqTaqTaq细菌中分离到细菌中分离到_ _ _ _，它的发现和应用解决了上述问题。要将，它的发现和应用解决了上述问题。要将TaqTaqTaqTaq细菌细菌从其他普通的微生物中分离出来，所用的培养基叫从其他普通的微生物中分离出来，所用的培养基叫_ _ _ _。对位训练对位训练磷酸基团磷酸基团33端端耐高温的耐高温的TaqTaq DNA DNA聚合酶聚合酶选择培养基选择培养基第28页/共68页 (3)PCR (3
35、)PCR的每次循环可以分为三步。假设在的每次循环可以分为三步。假设在PCRPCR反应中，只反应中，只有一个有一个DNADNA片段作为模板，请计算在片段作为模板，请计算在5 5次循环后，反应物中大约有个这样的次循环后，反应物中大约有个这样的DNADNA片段。片段。(4)(4)请用简图表示出一个请用简图表示出一个DNADNA片段片段PCRPCR反应中第二轮的产物。反应中第二轮的产物。(5)(5)简述简述PCRPCR技术的主要应用。技术的主要应用。变性、复性和延伸变性、复性和延伸3232 遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和DNADNA序列测定
36、序列测定(要求要求3 3项项以上以上)。第29页/共68页 解析解析 (1)DNA(1)DNA聚合酶只能把新的核苷酸加到已经存在的核酸的聚合酶只能把新的核苷酸加到已经存在的核酸的33 羟基上，与羟基上，与DNADNA母链结合的引物就提供这个羟基。母链结合的引物就提供这个羟基。(2)(2)因因PCRPCR利用了利用了DNADNA的热变性原理解决了打开的热变性原理解决了打开DNADNA双链的问题，所以用于催化双链的问题，所以用于催化DNADNA复制过程的复制过程的DNADNA聚合酶要具有耐高温的特性。用选择培养基可将聚合酶要具有耐高温的特性。用选择培养基可将TaqTaq细菌从其他细菌从其他普通的微
37、生物中分离出来。普通的微生物中分离出来。(3)DNA(3)DNA复制时两条链均作为模板，进行半保留式复制，所以复制复制时两条链均作为模板，进行半保留式复制，所以复制5 5次后得到的次后得到的子代子代DNADNA分子数为分子数为25253232个。个。(4)(4)新合成的新合成的DNADNA链带有引物，而最初的模板链带有引物，而最初的模板DNADNA的两条链不带有引物。的两条链不带有引物。(5)PCR(5)PCR技术可以对技术可以对DNADNA分子进行扩增，所以可用于遗传疾病的诊断、刑侦破案、分子进行扩增，所以可用于遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和古生物学、基因克隆和DNADNA序
38、列测定等方面。序列测定等方面。第30页/共68页 排雷排雷 PCRPCR扩增技术和扩增技术和DNADNA复制的比较复制的比较DNADNA复制复制PCRPCR扩增技术扩增技术场所场所细胞核内细胞核内生物体外生物体外原理原理碱基互补配对碱基互补配对碱基互补配对碱基互补配对酶酶DNADNA聚合酶、解旋酶聚合酶、解旋酶耐热的耐热的DNADNA聚合酶聚合酶(TaqTaq酶酶)条件条件模板、模板、ATPATP、引物链、引物链(RNA)(RNA)、常温常温模板、模板、ATPATP、引物链、引物链(DNA(DNA及及RNARNA片段片段)、温度变化、温度变化(90(9095955555606070707575
39、)原料原料四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸特点特点形成的是整个形成的是整个DNADNA分子，一个分子，一个细胞周期只复制一次细胞周期只复制一次短时间内形成大量目的基因短时间内形成大量目的基因DNADNA片段，呈指数增长片段，呈指数增长2 2n n第31页/共68页考点考点137137137137 生物科技实践应用生物科技实践应用血红蛋白的提取和分离血红蛋白的提取和分离 1 1 1 1蛋白质分离的依据蛋白质分离的依据 蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子带电荷的性质和多少、
40、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等，可以用来提取和分离不同种类的蛋白质。的亲和力等，可以用来提取和分离不同种类的蛋白质。2 2 2 2凝胶色谱原理凝胶色谱原理 (1)(1)(1)(1)识图析图识图析图 凝胶色谱法分离蛋白质凝胶色谱法分离蛋白质的原理的原理第32页/共68页图图A A，相对分子质量较小的蛋白质由于扩散作用进入凝胶颗粒内部而被滞留；相对，相对分子质量较小的蛋白质由于扩散作用进入凝胶颗粒内部而被滞留；相对分子质量较大的蛋白质被排阻在凝胶颗粒外面，在颗粒之间迅速通过。分子质量较大的蛋白质被排阻在凝胶颗粒外面，在颗粒之间迅速通过。图图B B，蛋白质混合物上柱；蛋白质混合物上柱；洗脱开
41、始，相对分子质量较小的蛋白质扩散进洗脱开始，相对分子质量较小的蛋白质扩散进入凝胶颗粒内；相对分子质量较大的蛋白质则被排阻于颗粒之外；入凝胶颗粒内；相对分子质量较大的蛋白质则被排阻于颗粒之外；相对分子质相对分子质量较小的蛋白质被滞留，相对分子质量较大的蛋白质向下移动；量较小的蛋白质被滞留，相对分子质量较大的蛋白质向下移动；相对分子质量相对分子质量不同的分子完全分开；不同的分子完全分开；相对分子质量较大的蛋白质行程较短，已从层析柱中洗相对分子质量较大的蛋白质行程较短，已从层析柱中洗脱出来，相对分子质量较小的蛋白质还在行进中。脱出来，相对分子质量较小的蛋白质还在行进中。相对分子质量不同的蛋白质分子因
42、此得以分离。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。第33页/共68页 蛋白质蛋白质比较比较相对分子质量大相对分子质量大相对分子质量小相对分子质量小凝胶内部凝胶内部不能进入不能进入能进入能进入运动方式运动方式垂直向下垂直向下垂直向下和无规则扩散运动垂直向下和无规则扩散运动经过路程经过路程较短较短较长较长洗脱次序洗脱次序先流出先流出后流出后流出 (2)(2)列表比较列表比较 提醒提醒凝胶色谱柱的直径大小不影响分离效果，但直径过大造成洗脱液体积凝胶色谱柱的直径大小不影响分离效果，但直径过大造成洗脱液体积大，样品稀释度大；凝胶色谱柱的高度与分离度有关。大，样品稀释度大；凝胶色谱柱的高度与分离度有关
43、。第34页/共68页 3 3凝胶电泳法原理凝胶电泳法原理 凝胶电泳法的原理是不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同，在电凝胶电泳法的原理是不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速率不同。如下表：和运动速率不同。如下表：决定运决定运动方向动方向形成库仑力形成库仑力形成阻力形成阻力决定运决定运动速率动速率电荷性质电荷性质电荷量电荷量分子形状分子形状分子大小分子大小第35页/共68页 4.4.实验操作流程实验操作流程 样品的处理样品的处理 粗
44、分离粗分离透析透析(去除小分子杂质去除小分子杂质)纯化纯化凝胶色谱法进行分离和纯化凝胶色谱法进行分离和纯化 纯度鉴定纯度鉴定SDS SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量第36页/共68页 提醒提醒红细胞洗涤过程中，洗涤三次后，上清液仍有黄色，可增加洗涤次数，红细胞洗涤过程中，洗涤三次后，上清液仍有黄色，可增加洗涤次数，否则无法除去血浆蛋白；离心时转速要低，时间要短，否则白细胞等会一同沉淀，否则无法除去血浆蛋白；离心时转速要低，时间要短，否则白细胞等会一同沉淀，达不到分离效果。达不到分离效果。血红蛋白释放过程中，蒸馏水的作用是使红细胞吸水涨破，甲苯的作
45、用主要血红蛋白释放过程中，蒸馏水的作用是使红细胞吸水涨破，甲苯的作用主要是溶解细胞膜。是溶解细胞膜。为了加快干凝胶的膨胀，可将加入洗脱液的湿凝胶用沸水浴加热，逐渐升温为了加快干凝胶的膨胀，可将加入洗脱液的湿凝胶用沸水浴加热，逐渐升温至接近沸腾，通常只需至接近沸腾，通常只需1 12 h2 h。这种方法不但节约时间，而且可以除去凝胶中可能。这种方法不但节约时间，而且可以除去凝胶中可能带有的微生物，排除胶粒内的空气。带有的微生物，排除胶粒内的空气。滴加样品时，吸管管口要贴着管壁环绕移动，防止破坏凝胶面。滴加样品时，吸管管口要贴着管壁环绕移动，防止破坏凝胶面。第37页/共68页 4 4 4 4(201
46、1201120112011广东卷，广东卷，5 5 5 5)以下关于猪血红蛋白提纯的以下关于猪血红蛋白提纯的描述，不正确的是描述，不正确的是()A A A A洗涤红细胞时，使用生理盐水可防止红细胞破裂洗涤红细胞时，使用生理盐水可防止红细胞破裂 B B B B猪成熟红细胞中缺少细胞器和细胞核，提纯时杂猪成熟红细胞中缺少细胞器和细胞核，提纯时杂蛋白较少蛋白较少 C C C C血红蛋白的颜色可用于凝胶色谱法分离过程的监血红蛋白的颜色可用于凝胶色谱法分离过程的监测测 D D D D在凝胶色谱法分离过程中，血红蛋白比分子量较在凝胶色谱法分离过程中，血红蛋白比分子量较小的杂蛋白移动慢小的杂蛋白移动慢对位训练
47、对位训练答案答案D D第38页/共68页 解析解析 猪成熟红细胞中缺少细胞器和细胞核，提纯时杂蛋白较少，是提纯血红猪成熟红细胞中缺少细胞器和细胞核，提纯时杂蛋白较少，是提纯血红蛋白的理想材料。提纯血红蛋白分四步：红细胞的洗涤、血红蛋白的释放、分离血蛋白的理想材料。提纯血红蛋白分四步：红细胞的洗涤、血红蛋白的释放、分离血红蛋白溶液、透析，其中洗涤红细胞时，要用生理盐水反复洗涤，既要将红细胞洗红蛋白溶液、透析，其中洗涤红细胞时，要用生理盐水反复洗涤，既要将红细胞洗涤干净，又要不破坏红细胞，然后再用蒸馏水和甲苯使红细胞破裂，释放出血红蛋涤干净，又要不破坏红细胞，然后再用蒸馏水和甲苯使红细胞破裂，释放
48、出血红蛋白。分离提纯血红蛋白时用凝胶色谱法，其原理是根据相对分子质量的大小来分离白。分离提纯血红蛋白时用凝胶色谱法，其原理是根据相对分子质量的大小来分离蛋白质，相对分子质量大的蛋白质移动速率较快；血红蛋白的颜色可用于观察红色蛋白质，相对分子质量大的蛋白质移动速率较快；血红蛋白的颜色可用于观察红色区带的移动情况，并据此判断分离效果。区带的移动情况，并据此判断分离效果。第39页/共68页 排雷排雷(1)(1)血红蛋白的提取和分离时红细胞分层不明显，可能是洗涤次数少、血红蛋白的提取和分离时红细胞分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速率过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细未能
49、除去血浆蛋白的原因。此外，离心速率过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。(2)(2)凝胶的装填标准是紧密、均匀。检测凝胶色谱柱的装填是否成功可以在凝胶凝胶的装填标准是紧密、均匀。检测凝胶色谱柱的装填是否成功可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶大分子的有色物质，观察色带移动的情况。如果色带均
50、匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。除不了时要重新装柱。(3)G(3)G7575：“G G”代表凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围，代表凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围，7575表示凝胶得水表示凝胶得水值，即每克凝胶膨胀时吸水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5 g7.5 g。(4)(4)装填完后装填完后,立即用洗脱液洗脱的目的是使凝胶装填紧密。立即用洗脱液洗脱的目的是使凝胶装填紧密。第40页/共68页 (5)(5)实验过程中加入柠檬酸钠的目的是防