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1、第一节第一节 培养基的成分培养基的成分培养基培养基(Medium):(Medium):是植物组织培养的重要基质是植物组织培养的重要基质.在离体培养条件下，不同种植物的组织对营养有在离体培养条件下，不同种植物的组织对营养有不同的要求不同的要求.同一种植物不同部位的组织对营养的要求也不相同一种植物不同部位的组织对营养的要求也不相同同.没有一种培养基能够适合一切类型的植物组织或没有一种培养基能够适合一切类型的植物组织或器官器官.在建立一项新的培养系统时，首先必须找到一合在建立一项新的培养系统时，首先必须找到一合适的培养基，培养才有可能成功适的培养基，培养才有可能成功.第1页/共40页一、培养基的成分
2、一、培养基的成分培养基的成分主要可以分水、无机盐、有机物、天然培养基的成分主要可以分水、无机盐、有机物、天然复合复合物、培养体的支持材料等五大类。物、培养体的支持材料等五大类。1 1水水 配制培养基母液时要用蒸馏水，以保持母液配制培养基母液时要用蒸馏水，以保持母液及培养基成分的精确性，防止贮藏过程发霉变质。及培养基成分的精确性，防止贮藏过程发霉变质。2 2、无机元素、无机元素(inorganicnutrition)大量元素，指浓度大于大量元素，指浓度大于0.5mmol0.5mmolL L的元素，的元素，有有N N，P P，K K，CaCa，MgMg，S S等。其作用是：等。其作用是：第2页/共
3、40页(1)N:(1)N:蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、生物蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、生物碱等的组成成分。碱等的组成成分。氮（氮（N N）：细胞中核酸的组成部分，也是生物体许多酶的成分，）：细胞中核酸的组成部分，也是生物体许多酶的成分，氮被植物吸收后转化为氨基酸再转化为蛋白质，然后被植物利用。氮被植物吸收后转化为氨基酸再转化为蛋白质，然后被植物利用。氮还是叶绿素、维生素和植物激素的组成成分。氮还是叶绿素、维生素和植物激素的组成成分。氮主要以铵态氮、销态氮两种形式被使用，实际中常常将两者混氮主要以铵态氮、销态氮两种形式被使用，实际中常常将两者混合使用，以调节培养基中的离子
4、平衡，利于细胞的生长发育。有合使用，以调节培养基中的离子平衡，利于细胞的生长发育。有KN03KN03、NHNH4 4NONO3 3，Ca(NOCa(NO3 3)2 2等。等。一般认为，铵态氮的含量超过一般认为，铵态氮的含量超过8 mmolL-18 mmolL-1时容易伤害培养物，但时容易伤害培养物，但这种情况也依植物种类、培养部位、培养类型而定。这种情况也依植物种类、培养部位、培养类型而定。第3页/共40页(2)P:(2)P:是磷脂的主要成分。而磷脂又是原生质、细胞核的重要是磷脂的主要成分。而磷脂又是原生质、细胞核的重要组成部分。组成部分。磷也是磷也是ATPATP、ADPADP等的组成成分。等
5、的组成成分。促进对促进对N N的吸收。的吸收。参与植物生命活动中核酸和蛋白质合成、光合作用、呼参与植物生命活动中核酸和蛋白质合成、光合作用、呼吸作用以及能量的储存、转化与释放等重要的生理生化吸作用以及能量的储存、转化与释放等重要的生理生化过程，增强植物的抗逆能力，促进早熟。过程，增强植物的抗逆能力，促进早熟。组织培养过程中需大量的磷。磷常以盐的形式供给。组织培养过程中需大量的磷。磷常以盐的形式供给。常用的物质有常用的物质有KHKH2 2P0P04 4或或NaHNaH2 2P0P04 4等。等。第4页/共40页(3)K(3)K：许多酶的活化剂。许多酶的活化剂。促进器官和不定胚的分化，促进器官和不
6、定胚的分化，促进叶绿体促进叶绿体ATPATP的合成，的合成，增强植物的光合作用和产物的运输，增强植物的光合作用和产物的运输，能调节植物细胞水势，能调节植物细胞水势，调控气孔运动，调控气孔运动，提高植物的抗逆能力。提高植物的抗逆能力。浓度不易过大，一般为浓度不易过大，一般为1-3mg1-3mgL L为好。为好。制备培养基时，常以制备培养基时，常以KClKCl、KNOKNO3 3，等盐类提供。，等盐类提供。第5页/共40页(4)Mg(4)Mg、S S和和CaCa：MgMg是叶绿素的组成成分，又是激酶的活化剂；是叶绿素的组成成分，又是激酶的活化剂；S S是含是含S S氨基酸和蛋白质的组成成分。氨基酸
7、和蛋白质的组成成分。它们常以它们常以MgS0MgS04 47H7H2 20 0提供。提供。用量为用量为1-3mg1-3mgL L较为适宜。较为适宜。CaCa是构成细胞壁的一种成分。是构成细胞壁的一种成分。CaCa对细胞分裂、保护质膜不受破坏有显著作用，对细胞分裂、保护质膜不受破坏有显著作用，常以常以CaClCaCl2 22H2H2 20 0提供。提供。第6页/共40页(5)(5)微量元素微量元素 指小于指小于0.5mmol0.5mmolL L的元素，的元素，FeFe，B B，MnMn，CuCu，MoMo，CoCo等等。铁铁是一些氧化酶、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶等的是一些氧化酶、细胞色素氧化酶
8、、过氧化氢酶等的组成成分。同时，它又是叶绿素形成的必要条件。培组成成分。同时，它又是叶绿素形成的必要条件。培养基中的铁对胚的形成、芽的分化和幼苗转绿有促进养基中的铁对胚的形成、芽的分化和幼苗转绿有促进作用。作用。在制做培养基时用在制做培养基时用FeS0FeS04 47H7H2 20 0和和NaNa2 2-EDTA-EDTA结合成螯结合成螯合物使用，避免合物使用，避免FeFe2+2+氧化产生氧化产生Fe(OH)Fe(OH)3 3沉淀。沉淀。第7页/共40页硼能促进生殖器官的正常发育，参与蛋白质合成或糖类硼能促进生殖器官的正常发育，参与蛋白质合成或糖类运输，可调节和稳定细胞壁结构，促进细胞伸长和细
9、胞运输，可调节和稳定细胞壁结构，促进细胞伸长和细胞分裂；分裂；锰参与植物的光合作用、呼吸代谢过程，影响根系生长，锰参与植物的光合作用、呼吸代谢过程，影响根系生长，对维生素对维生素C C的形成以及加强茎的机械组织优良好作用；的形成以及加强茎的机械组织优良好作用；锌是各种酶的构成要素，增强光合作用效率，参与生长锌是各种酶的构成要素，增强光合作用效率，参与生长素的代谢，促进生殖器官发育和提高抗逆性；素的代谢，促进生殖器官发育和提高抗逆性；铜能促进花器官的发育；铜能促进花器官的发育；钼是氮素代谢的重要元素，参与繁殖器官的建成。钼是氮素代谢的重要元素，参与繁殖器官的建成。第8页/共40页缺素症：缺素症：
10、当某些营养元素供应不足时，愈伤组织表现出一定当某些营养元素供应不足时，愈伤组织表现出一定的缺素症状。的缺素症状。l缺氮，缺氮，会表现出一种花色素苷的颜色，不能形成导管；会表现出一种花色素苷的颜色，不能形成导管；l缺铁，缺铁，细胞停止分裂；细胞停止分裂；l缺硫，缺硫，表现出非常明显的褪绿；表现出非常明显的褪绿；l缺锰或钼，缺锰或钼，则影响细胞的伸长。则影响细胞的伸长。第9页/共40页3 3有机化合物有机化合物(organiccompound)培养基中若只含有大量元素与微量元素，常称为培养基中若只含有大量元素与微量元素，常称为基本培养基基本培养基。常加入的有机成分主要有以下几类：常加入的有机成分主
11、要有以下几类：(1)碳水化合物（碳水化合物（carbohydrate）最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖和果糖也是较好的碳源，麦芽糖、最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖和果糖也是较好的碳源，麦芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖在组织培养中也有应用。半乳糖、甘露糖和乳糖在组织培养中也有应用。蔗糖使用浓度在蔗糖使用浓度在2 2-3-3，常用，常用3 3，胚培养时采用，胚培养时采用4 4-15-15的高的高浓度，因蔗糖对胚状体的发育起重要作用。浓度，因蔗糖对胚状体的发育起重要作用。不同糖类对生长的影响不同。从各种糖对水稻根培养的影响来看，不同糖类对生长的影响不同。从各种糖对水稻根培养的影响来看，以葡萄糖效果最好，果糖和蔗糖
12、相当，麦芽糖差一些。以葡萄糖效果最好，果糖和蔗糖相当，麦芽糖差一些。不同植物不同组织的糖类需要量也不同，不同植物不同组织的糖类需要量也不同，高压灭菌时一部分糖发生分解。高压灭菌时一部分糖发生分解。在大规模生产时，可用食用的绵白糖代替。在大规模生产时，可用食用的绵白糖代替。第10页/共40页(2)(2)维生素维生素(vitamin)(vitamin)u在植物细胞里主要是以各种辅酶的形式参与多种代谢在植物细胞里主要是以各种辅酶的形式参与多种代谢活动，对生长、分化等有很好的促进作用。活动，对生长、分化等有很好的促进作用。u大多数的植物细胞在培养中都能合成所必需的维生素，大多数的植物细胞在培养中都能合
13、成所必需的维生素，但数量上不足，通常需加入一至数种维生素。但数量上不足，通常需加入一至数种维生素。u主要有主要有VBVBl l(盐酸硫胺素盐酸硫胺素)、VBVB6 6(盐酸吡哆醇盐酸吡哆醇)、B5(B5(烟酸烟酸)、VC(VC(抗坏血酸抗坏血酸)、有时还使用生物素、有时还使用生物素(维生素维生素H)H)、叶、叶酸（维生素酸（维生素M M）、）、VBVB2 2(核黄素核黄素)等。一般用量为等。一般用量为0.1-1.O 0.1-1.O mgmgL L。uVBVB1 1对愈伤组织的产生和生活力有重要作用，对愈伤组织的产生和生活力有重要作用，VBVB6 6能促能促进根的生长，进根的生长，VppVpp与
14、植物代谢和胚的发育有一定关系。与植物代谢和胚的发育有一定关系。VcVc有防止组织变褐的作用，用量为有防止组织变褐的作用，用量为1-100 1-100 mgmgL L 。第11页/共40页(3)(3)肌醇肌醇 (inositol):(inositol):又叫环己六醇，在糖类的相互转化中起重要作又叫环己六醇，在糖类的相互转化中起重要作用。用。用于构建细胞壁用于构建细胞壁,参与细胞膜的构建。参与细胞膜的构建。使用浓度一般为使用浓度一般为50-lOOmg50-lOOmgL L，适当使用肌醇，适当使用肌醇，能促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽的形成。能促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽的形成。对组织和细胞的
15、繁殖、分化有促进作用，对细对组织和细胞的繁殖、分化有促进作用，对细胞壁的形成也有作用。胞壁的形成也有作用。第12页/共40页(4)(4)氨基酸氨基酸(amino acide)(amino acide)u是很好的有机氮源，可直接被细胞吸收利用。是很好的有机氮源，可直接被细胞吸收利用。u培养基中最常用的氨基酸是甘氨酸，其他的如培养基中最常用的氨基酸是甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸、谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰精氨酸、谷氨酸、谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等也常用。胺、丙氨酸等也常用。u有时应用水解乳蛋白（有时应用水解乳蛋白（LHLH）或水解酪蛋白）或水解酪蛋白（CHCH），是含有约），是含有约20
16、20种氨基酸的混合物，用量种氨基酸的混合物，用量在在10-1000mg10-1000mgL L之间。之间。第13页/共40页(5)(5)天然复合物天然复合物:1)1)椰乳椰乳 是椰子的液体胚乳。使用浓度在是椰子的液体胚乳。使用浓度在1010-20-20，它在愈，它在愈伤组织和细胞培养中有促进作用。伤组织和细胞培养中有促进作用。2)2)香蕉汁香蕉汁 用量为用量为150-200mg/L150-200mg/L。对。对pHpH值的缓冲作用大值的缓冲作用大,对发对发育有促进作用。育有促进作用。3)3)马铃薯马铃薯(potato):(potato):用量为用量为150-200g150-200gL L。对。
17、对pHpH值缓冲作用值缓冲作用也大。添加后可得到健壮的植株。也大。添加后可得到健壮的植株。4)4)水解酪蛋白水解酪蛋白:为蛋白质的水解物，主要成分为氨基酸，使为蛋白质的水解物，主要成分为氨基酸，使用浓度为用浓度为100-200mg100-200mgL L。5)5)其他其他:酵母提取液酵母提取液(YE)(0.01(YE)(0.01-0.05-0.05)，主要成分为，主要成分为氨基酸和维生素类氨基酸和维生素类.第14页/共40页4 4植物激素植物激素(hormone)(hormone)是培养基中不可缺少的关键物质，用量虽少，但对是培养基中不可缺少的关键物质，用量虽少，但对外植体愈伤组织的诱导和根、
18、芽等器官分化起着重要的外植体愈伤组织的诱导和根、芽等器官分化起着重要的调节作用。调节作用。(1)(1)生长素类生长素类(auxin)(auxin)在组织培养中，生长素主要被用于诱在组织培养中，生长素主要被用于诱导愈伤组织形成，诱导根的分化和促进细胞分裂、伸长导愈伤组织形成，诱导根的分化和促进细胞分裂、伸长生长生长根对生长素最敏感根对生长素最敏感,其次是茎和芽。其次是茎和芽。作用的强弱依次为作用的强弱依次为2,4-D2,4-DNAANAAIBAIBAIAAIAA。生长素的使用量通常为生长素的使用量通常为0.05-5mg/L0.05-5mg/L。第15页/共40页uIAA(indoaceticac
19、idIAA(indoaceticacid吲哚乙酸吲哚乙酸:是生长素中活力最弱是生长素中活力最弱的激素，对器官形成的副作用小，高温高压易被破坏，的激素，对器官形成的副作用小，高温高压易被破坏，也易被细胞中的也易被细胞中的IAAIAA分解酶降解，受光也易分解。分解酶降解，受光也易分解。uNAA(naphthaleneaceticacidNAA(naphthaleneaceticacid萘乙酸萘乙酸):):在组织培养中在组织培养中的起动能力要比的起动能力要比IAAIAA高出高出3-43-4倍，耐高温高压，不易被倍，耐高温高压，不易被分解破坏，所以应用较普遍。分解破坏，所以应用较普遍。NAANAA和和
20、IBAIBA广泛用于生根，广泛用于生根，并与细胞分裂素互作促进芽的增殖和生长并与细胞分裂素互作促进芽的增殖和生长uIBA(indolebutyric acidIBA(indolebutyric acid吲哚丁酸吲哚丁酸):):是促进发根能力是促进发根能力较强的生长调节物质。较强的生长调节物质。u2,4-D(2,4-2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸二氯苯氧乙酸):):起动能力比起动能力比IAAIAA高高1010倍，倍，特别在促进愈伤组织的形成上活力最高，但它强烈抑制特别在促进愈伤组织的形成上活力最高，但它强烈抑制芽的形成，影响器官的发育。芽的形成，影响器官的发育。u生长素配制时可先用少量生长素配
21、制时可先用少量9595酒精助溶。酒精助溶。2 2，4-D4-D可用可用0 01mol1molL L的的NaOHNaOH或或KOHKOH助溶。助溶。第16页/共40页(2)(2)细胞分裂素类细胞分裂素类(cytokinin):(cytokinin):主要功能是促进细胞分裂、抑制衰老，组织内细胞分裂素主要功能是促进细胞分裂、抑制衰老，组织内细胞分裂素/生长素的比值高时，可诱导芽的分化。生长素的比值高时，可诱导芽的分化。常见的细胞分裂素有激动素（常见的细胞分裂素有激动素（KTKT）、异戊烯基嘌呤）、异戊烯基嘌呤（2iP2iP）、）、6-6-苄基腺嘌呤（苄基腺嘌呤（6-BA6-BA）、玉米素（）、玉米
22、素（ZTZT）、噻重）、噻重氮苯基脲（氮苯基脲（TDZTDZ）。）。它们作用的强弱依次为它们作用的强弱依次为TDZTDZZTZT2iP2iP6-BA6-BAKTKT。细胞分裂素的使用量通常为细胞分裂素的使用量通常为0.05-10 mg0.05-10 mg L-1L-1。在培养基中添加细胞分裂素有三个作用：在培养基中添加细胞分裂素有三个作用：诱导芽的分化促进侧芽萌发生长，细胞分裂素与生长素诱导芽的分化促进侧芽萌发生长，细胞分裂素与生长素相互作用，当组织内细胞分裂素生长素的比值高时，诱相互作用，当组织内细胞分裂素生长素的比值高时，诱导愈伤组织或器官分化出不定芽。导愈伤组织或器官分化出不定芽。促进细
23、胞分裂与扩大。促进细胞分裂与扩大。抑制根的分化。抑制根的分化。第17页/共40页生长素与细胞分裂素的比例决定着发育的方向，生长素与细胞分裂素的比例决定着发育的方向，是愈伤组织、是长根还是长芽。是愈伤组织、是长根还是长芽。促进芽器官的分化，应除去或降低生长素的浓促进芽器官的分化，应除去或降低生长素的浓度，或者调整培养基中生长素与细胞分裂素的度，或者调整培养基中生长素与细胞分裂素的比例。比例。一般生长素浓度的使用为一般生长素浓度的使用为0.05-5mg0.05-5mgL L，细细胞分裂素胞分裂素0.05-10mg0.05-10mgL L。第18页/共40页(3)GA(gibberellicacid
24、(3)GA(gibberellicacid赤霉素赤霉素):):有有2020多种，生理活性及作用的种类、部位、效应等各有多种，生理活性及作用的种类、部位、效应等各有不同、培养基中添加的是不同、培养基中添加的是GA3GA3，促进幼苗茎的伸长生长，促进不定胚发育成小植株；促进幼苗茎的伸长生长，促进不定胚发育成小植株；赤霉素和生长素协同作用，对形成层的分化有影响，当赤霉素和生长素协同作用，对形成层的分化有影响，当生长素赤霉素比值高时有利于木质部分化，比值低时生长素赤霉素比值高时有利于木质部分化，比值低时有利于韧皮部分化；有利于韧皮部分化；赤霉素还用于打破休眠，促进种子、块茎、鳞茎等提前赤霉素还用于打破
25、休眠，促进种子、块茎、鳞茎等提前萌发。一般在器官形成后，添加赤霉素可促进器官或胚萌发。一般在器官形成后，添加赤霉素可促进器官或胚状体的生长。状体的生长。赤霉素溶于酒精，配制时可用少量赤霉素溶于酒精，配制时可用少量9595酒精助溶。赤霉酒精助溶。赤霉素不耐热，高压灭菌后将有素不耐热，高压灭菌后将有7070-100-100失效，应当采用失效，应当采用过滤灭菌法加入。过滤灭菌法加入。第19页/共40页脱落酸（脱落酸（abscissic acid,ABAabscissic acid,ABA）抑制细胞分裂和伸长，促进脱落和衰老，抑制细胞分裂和伸长，促进脱落和衰老，促进促进休眠。休眠。主要用于种质资源的超
26、低温保存。主要用于种质资源的超低温保存。多胺（多胺（polyamines,PApolyamines,PA）主要包括腐胺（主要包括腐胺（PutPut）,精胺（精胺（SpmSpm）,亚精胺亚精胺（ApdApd）及尸胺）及尸胺(Cad)(Cad)是生物代谢过程中产生的小分子脂肪族含氮碱是生物代谢过程中产生的小分子脂肪族含氮碱对植物生长发育、形态建成及抗逆性有调节作对植物生长发育、形态建成及抗逆性有调节作用。用。第20页/共40页4 4、琼脂、琼脂(agar)(agar)琼脂是从红藻等海藻中提取的一种高分子碳水化合物，其琼脂是从红藻等海藻中提取的一种高分子碳水化合物，其主要作用是使培养基在常温下凝固，
27、它不参与代谢、不提主要作用是使培养基在常温下凝固，它不参与代谢、不提供营养（但不纯的琼脂中常会有一些微量元素），在植物供营养（但不纯的琼脂中常会有一些微量元素），在植物离体培养中一直被作为首选的固化剂。离体培养中一直被作为首选的固化剂。琼脂的用量一般在琼脂的用量一般在4 410g/L10g/L之间。之间。在离体培养中，增加琼脂的用量可以克服在离体培养中，增加琼脂的用量可以克服“玻璃化现象玻璃化现象”的发生。的发生。琼脂的凝固能力除与原料、厂家和加工方式有关外，还与琼脂的凝固能力除与原料、厂家和加工方式有关外，还与高压灭菌的温度、时间、高压灭菌的温度、时间、pHpH值等因素有关，长时间的高温值等
28、因素有关，长时间的高温会使凝固能力下降，过酸及高温会使琼脂发生水解，失去会使凝固能力下降，过酸及高温会使琼脂发生水解，失去凝固能力。存放时间过久，也会逐渐失去凝固力，在使用凝固能力。存放时间过久，也会逐渐失去凝固力，在使用中应注意。中应注意。第21页/共40页5 5 活性碳活性碳(activated carbon)(activated carbon)与硝酸银与硝酸银活性碳（活性碳（ACAC）可吸附植物的有害泌出物，但其对物质吸）可吸附植物的有害泌出物，但其对物质吸附的选择性很低，同时也能吸附某些植物的必需化合物附的选择性很低，同时也能吸附某些植物的必需化合物.活性碳的用量一般为活性碳的用量一般
29、为0.50.53 3。在高压灭菌之前加入活。在高压灭菌之前加入活性碳会降低培养基的性碳会降低培养基的pHpH值，使琼脂不易凝固，在培养基值，使琼脂不易凝固，在培养基配制时应注意。配制时应注意。第22页/共40页AgNOAgNO3 3离体培养中的植物组织会产生乙烯，乙烯在培养容器中离体培养中的植物组织会产生乙烯，乙烯在培养容器中的积累会影响培养物的生长和分化，严重时甚至会导致的积累会影响培养物的生长和分化，严重时甚至会导致培养物的衰老和落叶。培养物的衰老和落叶。AgNO3AgNO3中的中的Ag+Ag+通过竞争性地结合于细胞膜上的乙烯受通过竞争性地结合于细胞膜上的乙烯受体蛋白，能起到抑制乙烯活性的
30、作用。体蛋白，能起到抑制乙烯活性的作用。在培养基中加入适量的在培养基中加入适量的AgNO3AgNO3，有促进愈伤组织分化器，有促进愈伤组织分化器官或胚状体的作用，能使某些原来再生困难的物种再生官或胚状体的作用，能使某些原来再生困难的物种再生植株，并对克服试管苗玻璃化、早衰及落叶等有明显效植株，并对克服试管苗玻璃化、早衰及落叶等有明显效果。果。AgNO3AgNO3的使用浓度一般为的使用浓度一般为1 110mg/L10mg/L。不可把培养物长期保存在不可把培养物长期保存在AgNO3AgNO3培养基上培养基上第23页/共40页6、抗氧化物、抗氧化物(antioxide)植物组织在切割时会溢泌一些酚类
31、物质，接触空气中的植物组织在切割时会溢泌一些酚类物质，接触空气中的氧气后，自动氧化或由酶类催化氧化为相应的醌类，产氧气后，自动氧化或由酶类催化氧化为相应的醌类，产生可见的茶色、褐色以致黑色，这就是酚污染。生可见的茶色、褐色以致黑色，这就是酚污染。这些物质渗出细胞外就造成自身中毒，使培养的材料生这些物质渗出细胞外就造成自身中毒，使培养的材料生长停顿，失去分化能力，最终变褐死亡。长停顿，失去分化能力，最终变褐死亡。在木本，尤其是热带木本及少数草本植物中较为严重。在木本，尤其是热带木本及少数草本植物中较为严重。抗酚类氧化常用的药剂有半胱氨酸及抗酚类氧化常用的药剂有半胱氨酸及VcVc，可用，可用50-
32、200 50-200 mg/Lmg/L的浓度洗涤刚切割的外植体伤口表面，或过滤灭菌的浓度洗涤刚切割的外植体伤口表面，或过滤灭菌后加入固体培养基的表层。后加入固体培养基的表层。其他抗氧化剂有二硫苏糖醇、谷胱甘肽、硫乙醇、及二其他抗氧化剂有二硫苏糖醇、谷胱甘肽、硫乙醇、及二乙基二硫氨基甲酸酯等。乙基二硫氨基甲酸酯等。第24页/共40页7、染色剂、染色剂(stain)在进行离体培养研究时通常需配制不同的培养基，或加在进行离体培养研究时通常需配制不同的培养基，或加入不同的植物激素，以观察培养物的变化，确定最适宜入不同的植物激素，以观察培养物的变化，确定最适宜的配方。的配方。除了用铅笔或油笔标记外，一个
33、可行的办法，是在培养除了用铅笔或油笔标记外，一个可行的办法，是在培养基中滴加基中滴加1 13 3滴滴1 1的活体染色剂，如亚甲兰、中性红、的活体染色剂，如亚甲兰、中性红、甲基紫等，将培养基染成不同的淡颜色，由于染色剂用甲基紫等，将培养基染成不同的淡颜色，由于染色剂用量极微，不会对培养物产生影响，利用此法能够节约大量极微，不会对培养物产生影响，利用此法能够节约大量的标注时间。量的标注时间。甲基紫除供染色之外，还具有较强的杀菌作用，甲基紫除供染色之外，还具有较强的杀菌作用，0.0010.001即可有效地抑制细菌和部分真菌的生长。即可有效地抑制细菌和部分真菌的生长。第25页/共40页8、抗生素、抗生
34、素(antibiotic)对于内生菌的情况，可使用抗生素类物质进行抑菌，经试验，甲基对于内生菌的情况，可使用抗生素类物质进行抑菌，经试验，甲基托布津、多菌灵、百菌清都有较好的效果，另据报道，链霉素、青托布津、多菌灵、百菌清都有较好的效果，另据报道，链霉素、青霉素、地霉素、新霉素、夹竹桃霉素、抗菌肽等物质都具有降低内霉素、地霉素、新霉素、夹竹桃霉素、抗菌肽等物质都具有降低内生菌污染的效果。生菌污染的效果。常用的抗生素有青霉素、链霉素、土霉素、四环素、氯霉素、利福常用的抗生素有青霉素、链霉素、土霉素、四环素、氯霉素、利福平、卡那霉素、庆大霉素等，用量为平、卡那霉素、庆大霉素等，用量为5-20mg/
35、L5-20mg/L。大部分抗生素要求。大部分抗生素要求过滤灭菌。过滤灭菌。不同抗生素抑菌效果不同，需针对性选择；不同抗生素抑菌效果不同，需针对性选择；通常需几种配合使用；通常需几种配合使用；第26页/共40页第二节第二节 培养基的种类培养基的种类(1)MS(1)MS培养基培养基 19621962年由年由MurashigeMurashige和和SkoogSkoog为培养烟草细胞而设计的为培养烟草细胞而设计的特点特点:u无机盐和离子浓度较高，为较稳定的平衡溶液。无机盐和离子浓度较高，为较稳定的平衡溶液。u其养分的数量和比例较合适，可满足植物的营养和生理其养分的数量和比例较合适，可满足植物的营养和生
36、理需要。需要。u它的硝酸盐含量较其他培养基为高，它的硝酸盐含量较其他培养基为高，u广泛地用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养，广泛地用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养，效果良好。有些培养基是由它演变而来的。效果良好。有些培养基是由它演变而来的。第27页/共40页(2)B5(2)B5培养基培养基 19681968年由年由GamborgGamborg等为培养大豆根细胞而设计的。等为培养大豆根细胞而设计的。特点特点:含有较低的铵，这可能对不少培养物的生长有含有较低的铵，这可能对不少培养物的生长有抑制作用。从实践得知有些植物在抑制作用。从实践得知有些植物在B5B5培养基上生长培养基上生长更适
37、宜，如双子叶植物特别是木本植物更适宜，如双子叶植物特别是木本植物(3)White(3)White培养基培养基 1943 1943年由年由WhiteWhite为培养番茄根尖而设计的。为培养番茄根尖而设计的。19631963年又作了改良，称作年又作了改良，称作WhiteWhite改良培养基，提高了改良培养基，提高了MgSO4MgSO4的浓度和增加了硼素。的浓度和增加了硼素。特点特点:无机盐数量较低，适于生根培养。无机盐数量较低，适于生根培养。第28页/共40页(4)N6(4)N6培养基培养基 1974 1974年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计的。年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计
38、的。特点特点:成分较简单，成分较简单，KN03KN03和和(NH4)(NH4)：S04S04含量高。在国内已广含量高。在国内已广泛应泛应用于小麦、水稻及其他植物的花药培养和其他组织培养。用于小麦、水稻及其他植物的花药培养和其他组织培养。(5)KM-8P(5)KM-8P培养基培养基 19741974年为原生质体培养而设计的。年为原生质体培养而设计的。特点特点:有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素，广有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素，广泛泛用于原生质融合的培养。用于原生质融合的培养。第29页/共40页一一培养基选择培养基选择培养基类型：培养基类型：1 1 普普通通培培养养基基（平平
39、衡衡培培养养基基）：MSMS（Murashige Murashige and and Skoog,Skoog,19621962）培培养养基基，无无机机盐盐浓浓度度高高、缓缓冲冲性性能能好好、营营养养丰丰富富、微微量量元素种类全，使用最广泛。改良元素种类全，使用最广泛。改良MSMS：LSLS、BLBL、BMBM、ERER等。等。2 2 富富含含硝硝酸酸钾钾培培养养基基：B5B5、N6N6、SHSH等等培培养养基基，硝硝酸酸钾钾含含量量高高、铵态氮含量低（某些植物生长受抑制）。铵态氮含量低（某些植物生长受抑制）。3 3 中中等等无无机机盐盐培培养养基基：如如MAMA、H H培培养养基基等等，无无机
40、机盐盐约约为为MSMS的的半半量量、微量元素种类少含量高、维生素种类增加（生物素、叶酸等）。微量元素种类少含量高、维生素种类增加（生物素、叶酸等）。4 4 低低无无机机盐盐培培养养基基：WhiteWhite、WSWS、HEHE等等培培养养基基，无无机机盐盐含含量量低低（MSMS的的1/4 1/4）、有机成分低，主要用于生根。）、有机成分低，主要用于生根。第30页/共40页二二激素选择激素选择生生长长素素：节节间间伸伸长长、顶顶端端优优势势、促促进进生生根根等等，组组培培中中用用于于促促进进细细胞胞分分裂裂、诱诱导导愈愈伤伤和和生生根根。常常用用的的生生长长素素类类激激素素有有：2,4-D2,4
41、-D、2,4,5-T2,4,5-T、NAANAA、NOANOA、IBAIBA、IAAIAA等等。2,4-D2,4-D、2,4,5-T2,4,5-T主主要要用用于诱导愈伤；于诱导愈伤；IBAIBA、IAAIAA常用于生根培养。常用于生根培养。细细胞胞分分裂裂素素：促促进进细细胞胞分分裂裂、打打破破顶顶端端优优势势、促促进进芽芽分分化化。常常用的细胞分裂素有：用的细胞分裂素有：ZTZT、BAPBAP、6-BA6-BA、2-iP2-iP、KTKT等。等。细细胞胞分分裂裂素素与与生生长长素素的的比比例例及及含含量量是是激激素素使使用用的的关关键键：原原则则上上生长素水平高促进愈伤，反之利于分化。另外生
42、长素用于生根。生长素水平高促进愈伤，反之利于分化。另外生长素用于生根。此此外外选选择择脱脱落落酸酸或或激激素素抑抑制制物物（AgNO3AgNO3、三三碘碘苯苯甲甲酸酸）等等，可可促进愈伤诱导或芽分化。促进愈伤诱导或芽分化。第31页/共40页Auxin-Cytokinin InteractionAuxinHighLowCytokininHighLowRootformationoncuttingsFirststageofembryogenesisAdventitious(外来外来)rootformationCallusInitiationindicotsAdventitiousshootforma
43、tionAxillaryshootproliferationinshootculturesCallusinitiationinmonocots第32页/共40页第三节第三节 培养基的制备培养基的制备一、母液一、母液(stock s1ution)(stock s1ution)的配制和保存的配制和保存u母液是欲配制液的浓缩液，一般母液配成比所母液是欲配制液的浓缩液，一般母液配成比所需浓度高需浓度高10-20010-200倍。倍。u母液配制时可分别配成大量元素、微量元素、母液配制时可分别配成大量元素、微量元素、铁盐、有机物和激素类等。铁盐、有机物和激素类等。第33页/共40页二、培养基的配制和保存二
44、、培养基的配制和保存u计算所需各成分的量计算所需各成分的量u加水，琼脂煮熔，一次加入大量元素，微量元素，加水，琼脂煮熔，一次加入大量元素，微量元素，铁盐，有机物，生长调节剂及其它添加物及蔗糖铁盐，有机物，生长调节剂及其它添加物及蔗糖u定容定容u调节调节pHpHu分装分装u封口封口u灭菌灭菌第34页/共40页第四节第四节 培养基的设计培养基的设计一、单因子试验一、单因子试验 在单因子试验中，由于培养基中其他成分都维持在一在单因子试验中，由于培养基中其他成分都维持在一般水平上，所以只变动一个因子，就可以找出这个因子般水平上，所以只变动一个因子，就可以找出这个因子对试验的影响和影响的程度。对试验的影
45、响和影响的程度。二、多因子试验二、多因子试验 对培养基中两个或两个以上因素进行研究的试验称对培养基中两个或两个以上因素进行研究的试验称为多因子实验，试验可采用完全试验方案，也可选用正为多因子实验，试验可采用完全试验方案，也可选用正交设计方案，完全试验方案具有均衡完全的特点，各个交设计方案，完全试验方案具有均衡完全的特点，各个因子的每个水平都相互搭配，构成了所有可能的处理组因子的每个水平都相互搭配，构成了所有可能的处理组合。合。三、逐步添加和逐步排除的试验方法三、逐步添加和逐步排除的试验方法第35页/共40页三、逐步添加和逐步排除的试验方法三、逐步添加和逐步排除的试验方法 在植物组织分化与再生的
46、研究中，在没有在植物组织分化与再生的研究中，在没有取得可靠的分化与再生之前，往往添加各种有取得可靠的分化与再生之前，往往添加各种有机营养成分，而在取得了稳定的再生之后，就机营养成分，而在取得了稳定的再生之后，就可以逐步减少这些成分。在逐步添加时是使试可以逐步减少这些成分。在逐步添加时是使试验成功，在逐步减少时是缩小范围，以便找到验成功，在逐步减少时是缩小范围，以便找到最有影响力的因子，或是为了实用上的需要竭最有影响力的因子，或是为了实用上的需要竭力使培养基简化，以降低成本和利于推广。在力使培养基简化，以降低成本和利于推广。在寻求最佳激素配比时，也经常用到这种加加减寻求最佳激素配比时，也经常用到
47、这种加加减减的简单方法。减的简单方法。第36页/共40页PicturesoftissuecultureintheAfricanVioletThesepicturesshowtheeffectsofchangingthecompositionofatissueculturemediumthatwasdesignedoriginallyformicropropagationofthecommonhouseplant,theAfricanViolet(紫罗兰紫罗兰).Thecontrolmediumcontains:4.71g.l-1MurashigeandSkoogInorganicsaltsme
48、dium,0.5mgl-1naphthaleneaceticacid(NAA,anauxin),0.5mg.l-1benzylaminepurine(BAP,acytokinin)and3%sucrose,solidifiedby1%agar.ThisTablesummarisesthecompositionofthemedium.Eachpictureshowstheeffectonthepatternofdifferentiationofincreasingordecreasingonecomponentofthismedium.Allareofapproximatelythesamesi
49、zeoftheoriginalexplant(1cmsquare).TheFiguresareatasimilarmagnification(放大率放大率).第37页/共40页ControlGrowthmediumisoptimisedforregenerationofplantlets.Theexplantiscompletelycoveredwithgreenshoots,androotsaredevelopingonthelowersurface(somevisibleatthesides).第38页/共40页Nosucrose(0%)Veryfewshootshavedeveloped
50、ontheexplant.Norootsandnocallus.Sucrosereducedto1%Shootsdevelopedonedgesofuppersurface,andsomerootdevelopmenthasoccurred.NoBAPProfuse(丰富的丰富的)developmentofrootsandareducednumberofshoots.Undifferentiatedcallusisdevelopingattheedgesoftheexplant.Sucroseincreasedto5%Shootshavedevelopedoverthesurfaceofthe