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1、第10章吸光光度法本讲稿第一页，共四十九页吸光光度法：分子光谱分析法的一种，又称分光光度吸光光度法：分子光谱分析法的一种，又称分光光度法，属于分子吸收光谱分析方法法，属于分子吸收光谱分析方法 基于外层电子跃迁基于外层电子跃迁10.1 概述概述n吸收光谱吸收光谱n发射光谱发射光谱n散射光谱散射光谱n分子光谱分子光谱n原子光谱原子光谱本讲稿第二页，共四十九页10.2 吸光光度法基本原理吸光光度法基本原理1 吸收光谱产生的原因吸收光谱产生的原因 光光:一种电磁波一种电磁波,波粒二象性波粒二象性 光谱名称波长范围X射线0.110nm远紫外光10200nm近紫外光200400nm可见光400750nm近
2、红外光0.752.5um中红外光2.55.0um远红外光5.01000um微波0.1100cm无线电波11000m当光子的能量与分子的当光子的能量与分子的 E匹配时，匹配时，就会吸收光子就会吸收光子 E=hu u=hc/l l本讲稿第三页，共四十九页a 跃迁类型跃迁类型 价电子跃迁价电子跃迁：*,*;n*,n*E(h)顺序:n*n*104)c.产物的化学组成稳定产物的化学组成稳定d.化学性质稳定化学性质稳定e.反应和产物有明显的颜色差别反应和产物有明显的颜色差别(l l60nm)没有颜色的化合物，需要通过适当的反应定量生没有颜色的化合物，需要通过适当的反应定量生成有色化合物再测定成有色化合物再
3、测定 显色反应显色反应1 显色反应显色反应本讲稿第十九页，共四十九页络合反应络合反应氧化还原反应氧化还原反应2 显色反应类型显色反应类型本讲稿第二十页，共四十九页离子缔合反应离子缔合反应成盐反应成盐反应 本讲稿第二十一页，共四十九页褪色反应褪色反应 Zr(IV)-偶氮胂偶氮胂III络合物测定草酸络合物测定草酸吸附显色反应吸附显色反应 达旦黄测定达旦黄测定Mg(II),Mg(OH)2吸附达旦黄呈红色吸附达旦黄呈红色 本讲稿第二十二页，共四十九页3 显色剂显色剂无机显色剂无机显色剂:过氧化氢，硫氰酸铵，碘化钾过氧化氢，硫氰酸铵，碘化钾有机显色剂：有机显色剂：偶氮类：偶氮胂偶氮类：偶氮胂III本讲稿
4、第二十三页，共四十九页三苯甲烷类三苯甲烷类 三苯甲烷酸性染料三苯甲烷酸性染料 铬天菁铬天菁S S 三苯甲烷碱性染料三苯甲烷碱性染料 结晶紫结晶紫 本讲稿第二十四页，共四十九页邻菲罗啉类：新亚铜灵邻菲罗啉类：新亚铜灵 肟类：丁二肟肟类：丁二肟 本讲稿第二十五页，共四十九页4 多元络合物多元络合物混配化合物混配化合物 Nb-5-Br-PADAP-酒石酸 V-PAR-H2O 离子缔合物离子缔合物 AuCl4-罗丹明B金属离子金属离子-配体配体-表面活性剂体系表面活性剂体系 Mo-水杨基荧光酮-CTMAB 本讲稿第二十六页，共四十九页5 影响因素影响因素a 溶液酸度（溶液酸度（pH值及缓冲溶液）值及缓
5、冲溶液）u 影响显色剂的平衡浓度及颜色，改变lu 影响待测离子的存在状态，防止沉淀u 影响络合物组成形式形式 pH max(nm)形式形式 pH max(nm)H4L+1.2 462-465 Sn4+1.0 530H3L 4.8-5.2 462,490 Ga3+5.0 550H2L-8.4-9.0 512HL2-11.4-12.0 532-538pH对苯芴酮及其络合物的颜色影响对苯芴酮及其络合物的颜色影响 本讲稿第二十七页，共四十九页b 显色剂的用量显色剂的用量稍过量，处于平台区稍过量，处于平台区 c 显色反应时间显色反应时间针对不同显色反应确定显示时间 显色反应快且稳定；显色反应快但不稳定；
6、显色反应慢，稳定需时间；显色反应慢但不稳定d 显色反应温度显色反应温度加热可加热可加快反应速度，导致显色剂或产物分解本讲稿第二十八页，共四十九页e 溶剂溶剂f 干扰离子干扰离子 有机溶剂，提高灵敏度、显色反应速率有机溶剂，提高灵敏度、显色反应速率消除办法：消除办法：提高酸度，加入隐蔽剂，改变价态提高酸度，加入隐蔽剂，改变价态 选择合适参比选择合适参比 褪色空白褪色空白(铬天菁铬天菁S测测Al，氟化铵褪色，消除锆、镍、钴干扰，氟化铵褪色，消除锆、镍、钴干扰)选择适当波长选择适当波长 本讲稿第二十九页，共四十九页10.5 光度分析法的设计光度分析法的设计1.选择显色反应选择显色反应2.选择显色剂选
7、择显色剂3.优化显色反应条件优化显色反应条件4.选择检测波长选择检测波长5.选择合适的浓度选择合适的浓度6.选择参比溶液选择参比溶液7.建立标准曲线建立标准曲线测量条件选择测量条件选择本讲稿第三十页，共四十九页1 测定波长选择测定波长选择选择原则：选择原则：“吸收最大，干扰最小吸收最大，干扰最小”灵敏度选择性本讲稿第三十一页，共四十九页2 测定浓度控制测定浓度控制控制浓度控制浓度 吸光度吸光度A：0.20.8减少测量误差减少测量误差本讲稿第三十二页，共四十九页3 参比溶液选择参比溶液选择仪器调零仪器调零消除吸收池壁和溶液对入射光的反射消除吸收池壁和溶液对入射光的反射 扣除干扰扣除干扰试剂空白试
8、剂空白试样空白试样空白褪色空白褪色空白 本讲稿第三十三页，共四十九页4 标准曲线制作标准曲线制作理论基础：朗伯理论基础：朗伯-比尔定律比尔定律 相同条件下相同条件下测定不同浓度标准溶液测定不同浓度标准溶液的吸光度的吸光度AAc 作图作图本讲稿第三十四页，共四十九页10.6 吸光光度法的误差吸光光度法的误差非单色光引起的偏移非单色光引起的偏移物理化学因素：非均匀介质及化学反应物理化学因素：非均匀介质及化学反应吸光度测量的误差吸光度测量的误差 对朗伯对朗伯-比尔定律的偏移比尔定律的偏移本讲稿第三十五页，共四十九页1 非单色光引起的偏移非单色光引起的偏移复合光由复合光由l l1和和l l2组成，对于
9、浓度不同的溶液组成，对于浓度不同的溶液a和和b,引引起的吸光度的偏差不一样，浓度大，复合光引起起的吸光度的偏差不一样，浓度大，复合光引起的误差大，故在高浓度时线性关系向下弯曲。的误差大，故在高浓度时线性关系向下弯曲。本讲稿第三十六页，共四十九页非均匀介质非均匀介质 胶体，悬浮、乳浊等对光产生散射，使实测吸胶体，悬浮、乳浊等对光产生散射，使实测吸光度增加，导致线性关系上弯光度增加，导致线性关系上弯2 物理化学因素物理化学因素离解、缔合、异构等离解、缔合、异构等如：如：Cr2O72-+H2O-=2HCrO4-=2H+2CrO42-PAR的偶氮醌腙式的偶氮醌腙式 化学反应化学反应本讲稿第三十七页，共
10、四十九页吸光度标尺刻度不均匀吸光度标尺刻度不均匀3 吸光度测量的误差吸光度测量的误差A0.434，T36.8%时，测量的相对误差最小时，测量的相对误差最小A=0.20.8,T=1565%，相对误差，相对误差4%dc/c=dA/A=dT/TlnT Er=dc/c100=dA/A100=dT/TlnT100本讲稿第三十八页，共四十九页令令ST=0.01,计算计算T不同值时的不同值时的Sc/c，当，当TlnT对对T进行微进行微分时，其值为零时，分时，其值为零时，Sc/c最小，此时最小，此时T=0.368。本讲稿第三十九页，共四十九页1.示差吸光光度法示差吸光光度法目的：提高光度分析的准确度和精密度目
11、的：提高光度分析的准确度和精密度 解决高解决高(低低)浓度组分浓度组分(i.e.A在在0.20.8以外以外)问题问题分类：高吸光度差示法、低吸光度差示法、分类：高吸光度差示法、低吸光度差示法、精密差示吸光度法精密差示吸光度法特点：特点：以标准溶液作空白以标准溶液作空白原理：原理：A相对相对=A=bcx-bc0=b c准确度：读数标尺扩展准确度：读数标尺扩展,相对误差减少相对误差减少,c0愈接近愈接近cx,准确度提高愈显著准确度提高愈显著10.7 常用的吸光光度法常用的吸光光度法本讲稿第四十页，共四十九页例：硫脲还原硫氰酸盐比色法测定钢铁中的钼。酸溶，例：硫脲还原硫氰酸盐比色法测定钢铁中的钼。酸
12、溶，硫酸高氯酸介质中，硫脲还原铁（硫酸高氯酸介质中，硫脲还原铁（III）为铁）为铁(II),除干除干扰，还原钼（扰，还原钼（VI）为五价，）为五价，2.00mg/100ml的钼标准溶液的钼标准溶液为参比溶液，用为参比溶液，用2.00-2.30mg/100ml的钼标准溶液，绘制的钼标准溶液，绘制工作曲线和测定样品溶液的吸光度工作曲线和测定样品溶液的吸光度,480nm测定测定A。本讲稿第四十一页，共四十九页2.双波长吸光光度法双波长吸光光度法 目的：解决浑浊样品光度分析目的：解决浑浊样品光度分析 消除背景吸收的干扰消除背景吸收的干扰 多组分同时检测多组分同时检测 原理：原理：A=Al l1-Al
13、l2=（l l1-l l2）b c 波长对的选择：波长对的选择：a.等吸光度点法，等吸光度点法，b.系数倍率法系数倍率法3.导数吸光光度法导数吸光光度法本讲稿第四十二页，共四十九页选选l l1为参比波长为参比波长,l l2为测量波长为测量波长得得 Al l1=xl l1bcx+yl l1bcy Al l2=xl l2bcx+yl l2bcy A=Al l2-Al l1=(x2bcx+yl l2bcy)-(xl l1bcx+yl l1bcy)在等吸光度的位置在等吸光度的位置(G,F),yl l2 yl l1，则上式成为，则上式成为 A=(xl l2-xl l1）bcx A与与cx成正比成正比,可
14、用于测定可用于测定例例,苯酚与苯酚与2,4,6-三氯苯酚三氯苯酚(y)混合物中混合物中苯酚苯酚(x)的双波长分光光度法测定。的双波长分光光度法测定。本讲稿第四十三页，共四十九页3.导数吸光光度法导数吸光光度法 目的：提高分辨率目的：提高分辨率 去除背景干扰去除背景干扰 原理：原理：dnA/dl ln l l 本讲稿第四十四页，共四十九页10.8 吸光光度法的应用吸光光度法的应用1 测定弱酸和弱碱的离解常数测定弱酸和弱碱的离解常数 AHB和AB-分别为有机弱酸HB在强酸和强碱性时的吸光度，它们此时分别全部以HB或B-形式存在。HB H+B-H+B-Ka=HBpKa=pH+lg HBB-A=AHB
15、+AB-pKa=pH+lg AB-AA-AHBlg AB-AA-AHB对对pH作图即可求得作图即可求得pKa 本讲稿第四十五页，共四十九页2 络合物组成确定络合物组成确定 饱和法（摩尔比法）饱和法（摩尔比法）制备一系列含钌制备一系列含钌3.010-5 mol/L(固定不变固定不变)和不同浓度和不同浓度（小于（小于12.010-5 mol/L）的）的PDT溶液，按实验条件，溶液，按实验条件，485nm测定吸光度测定吸光度,作图。作图。PDT:Ru=2:1本讲稿第四十六页，共四十九页等摩尔连续变化法等摩尔连续变化法固固定定M+L,改改变变M,获获得得一一系系列列吸吸光光度度值值，吸吸光光度度最最大
16、的值所对应的大的值所对应的M与与L的比值，即获得的比值，即获得M:L比值。比值。Co(III)与与3，5二氯二氯PADAT的比值为的比值为1:2本讲稿第四十七页，共四十九页平衡移动法平衡移动法固固定定M,不不断断改改变变L，以以lgMLn/M为为纵纵坐坐标标，lgL为为横横坐坐标标，作作图图，斜斜率率n即即是是络络合合物物中中L:M的的比比值；纵轴上的截距值；纵轴上的截距lgK是络合物的稳定常数。是络合物的稳定常数。lgK+nlgL=lg(MLn/M)MLn K=MLnlgK+nlgL=lgA/(Amax-A)本讲稿第四十八页，共四十九页3 分析应用分析应用 痕量金属分析痕量金属分析临床分析临床分析食品分析食品分析本讲稿第四十九页，共四十九页