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1、第十四章第十四章基因重组和基因工程基因重组和基因工程授课教师授课教师 郑志竑郑志竑第一节第一节 DNA DNA的重组的重组 DNA Recombination一、同源重组一、同源重组 发生在同源序列间的重组称为发生在同源序列间的重组称为同源重同源重组组(homologous recombination)，又称，又称基基本重组本重组。是最基本的。是最基本的DNA重组方式，通重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个过链的断裂和再连接，在两个DNA分子分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。同源序列间进行单链或双链片段的交换。二、细菌的基因转移与重组二、细菌的基因转移与重组（一）（一）接合作用接合作用
2、(conjugation)：当细胞或当细胞或细菌通过菌毛相互接触时，质粒细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNADNA从一从一个细胞个细胞(细菌细菌)转移至另一细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）,这种类型的这种类型的DNADNA转移称为转移称为接合作用接合作用。质粒质粒：细菌染色体外的环状双链：细菌染色体外的环状双链DNADNA分子。分子。可接合质粒，如可接合质粒，如 F 因子因子(F factor)（二）（二）转化作用转化作用(transformation)：通过通过自动获取或人为地供给外源自动获取或人为地供给外源DNADNA，使细胞，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型。或培养的受体细胞获得新
3、的遗传表型。（三）（三）转导作用转导作用(transduction)：当病毒从当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（受体）细胞时，发生在供体细胞染另一（受体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即转移及基因重组即为为转导作用转导作用。第二节第二节 重组重组DNADNA技术技术一、重组一、重组DNA技术相关概念技术相关概念（一）（一）DNADNA克隆（也称基因克隆或重组克隆（也称基因克隆或重组DNADNA）应用酶学的方法应用酶学的方法,在体外将各种来源的遗在体外将各种来源的遗传物质传物质DNADNA与载体与载
4、体DNADNA接合成具有自我复制能力接合成具有自我复制能力的的DNADNA分子，再通过转化或转染宿主细胞，筛分子，再通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，经扩增提取选出含有目的基因的转化子细胞，经扩增提取获得大量同一获得大量同一DNADNA分子。分子。生物技术工程生物技术工程:基因工程、蛋白质工程、基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等酶工程、细胞工程等基因工程基因工程-实现基因克隆所采用的方法实现基因克隆所采用的方法 及相关的工作称基因工程及相关的工作称基因工程,又称重组又称重组DNADNA工艺学。工艺学。目的目的：1 1、分离获得某一感兴趣的基因或、分离获得某一感兴趣的
5、基因或DNADNA序列序列 2 2、获得感兴趣基因的表达产物、获得感兴趣基因的表达产物(蛋白质蛋白质)（二）（二）工具酶工具酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 DNA聚合酶聚合酶I 逆转录酶逆转录酶 T4DNA 连接酶连接酶 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 末端转移酶末端转移酶 Taq DNA聚合酶聚合酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)：识别识别DNADNA的特异序列的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链并在识别位点或其周围切割双链DNADNA的的一类内切酶。一类内切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+BamHBamH类酶识别序列
6、特点类酶识别序列特点回文结构回文结构BamHBamHGTCCAGGCCTAGGATCC G+GGATCCCCTAGGHindHindGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口平端切口粘端切口粘端切口（三）目的基因（又称外源（三）目的基因（又称外源DNADNA）cDNA：经反转录合成的、与：经反转录合成的、与RNA（mRNA或病毒或病毒RNA）互补的单链）互补的单链DNA。基因组基因组DNA：在真核生物体，基因组是在真核生物体，基因组是指一套完整单倍体指一套完整单倍体DNADNA（染色体（染色体DNADNA）和）和线粒体线粒体DNADNA的全部序列。的全部序列。（四）基因载体（克隆载体）（四
7、）基因载体（克隆载体）：为携带目：为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些的蛋白质所采用的一些DNADNA分子。分子。常用载体常用载体：质粒：质粒DNA、噬菌体、噬菌体DNA、病、病毒毒DNA克克隆隆载载体体(cloning vector)：为为使使插插入入的的外外源源DNA序列被扩增而特意设计的载体。序列被扩增而特意设计的载体。表表达达载载体体(expression vector)：为为使使插插入入的的外外源源DNA序序列列可可转转录录翻翻译译成成多多肽肽链链而而特特意设计的载体。意设计的载体。二、重组二、重组DNADNA技术基本原理及
8、步骤技术基本原理及步骤1 1、目的基因的获取、目的基因的获取2 2、基因载体的选择与构建、基因载体的选择与构建3 3、目的基因与载体的拼接、目的基因与载体的拼接4 4、重组、重组DNADNA分子导入受体细胞分子导入受体细胞5 5、筛选并无性繁殖含重组分子、筛选并无性繁殖含重组分子 的受体分子（转化子）的受体分子（转化子）（一）目的基因的获取（一）目的基因的获取1 1、化学合成法、化学合成法 要求：已知目的基因的核苷酸序列或其要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。产物的氨基酸序列。2 2、基因组、基因组DNADNA文库文库(genomic DNA library)组织或细胞染色体组
9、织或细胞染色体DNADNA基因片断基因片断克隆载体克隆载体重组重组DNADNA分子分子含重组分子的转化菌含重组分子的转化菌限制性内切酶限制性内切酶受体菌受体菌基因组基因组DNADNA文库文库：存在于转化细胞内由存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所克隆载体所携带的所有基因组有基因组DNADNA的集合。的集合。3、cDNA文库文库：以：以mRNA为模板，利用为模板，利用反转录酶合成与反转录酶合成与mRNA互补的互补的DNA，再，再复制成双链复制成双链cDNA片段，与适当载体连接片段，与适当载体连接后转入受体菌，即获得后转入受体菌，即获得cDNA文库（文库（cDNA library）。）。组织或培养
10、细胞组织或培养细胞载载 体体mRNAcDNAcDNAcDNA与载体连接与载体连接导入大肠杆菌导入大肠杆菌鉴定鉴定cDNAcDNA文库的克隆数与特征文库的克隆数与特征（二）克隆载体的选择（二）克隆载体的选择常用载体常用载体：质粒：质粒DNA、噬菌体、噬菌体DNA、病、病毒毒DNA载体的选择标准：载体的选择标准：能自主复制；能自主复制；具有两个以上的遗传标记物，便于重组体具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；的筛选和鉴定；有克隆位点（外源有克隆位点（外源DNADNA插入点），常具有插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；多个单一酶切位点，称为多克隆位点；分子量小，以容纳较大的
11、外源分子量小，以容纳较大的外源DNADNA。（三）外源基因与载体的连接（三）外源基因与载体的连接1 1、粘性末端连接：、粘性末端连接：同一限制酶切割位点连接同一限制酶切割位点连接配伍末端连接配伍末端连接2 2、平端连接、平端连接 适用于：限制性内切酶切割产生的平端适用于：限制性内切酶切割产生的平端 粘端补齐或切平形成的平端粘端补齐或切平形成的平端3 3、同聚物加尾连接、同聚物加尾连接 由末端转移酶作用下，在由末端转移酶作用下，在DNADNA片段末端片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。进行粘端连接。4、人工接头：、人工接头：由平端加上新的酶切
12、位点，再用限制由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。（四）重组（四）重组DNA导入受体菌：导入受体菌：受体菌条件受体菌条件:安全宿主菌安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷限制酶和重组酶缺陷 处于感受态处于感受态 导入方式导入方式：转化：转化(transformation)转染转染(transfection)感染感染(infection)（五）重组体的筛选（五）重组体的筛选1 1、直接选择：、直接选择：抗药性标记选择抗药性标记选择 插入失活法插入失活法 标志补救标志补救 分子杂交法：分子杂交法：原位杂交、原位杂交、Southern印迹印
13、迹原原 位位 杂杂 交交2 2、非直接选择法：、非直接选择法：免疫学方法：如免疫化学方法免疫学方法：如免疫化学方法 酶免检测法酶免检测法重组重组DNADNA技术简单概括为：技术简单概括为：“分、切、接、转、筛分、切、接、转、筛”第三节第三节重组重组DNADNA技术与医学的关系技术与医学的关系（一）疾病基因的发现与克隆（一）疾病基因的发现与克隆（二）生物制药（二）生物制药（三）基因诊断（三）基因诊断（四）基因治疗（四）基因治疗（五）遗传病的预防（五）遗传病的预防小小 结结自然界基因转移伴发重组的形式有多种。自然界基因转移伴发重组的形式有多种。细菌的基因转移包括接合、转化、转导细菌的基因转移包括接合、转化、转导作用等，在这些过程中不同作用等，在这些过程中不同DNADNA分子间发分子间发生的共价连接即为重组。生的共价连接即为重组。重组重组DNADNA（基因克隆）技术是应用酶学的（基因克隆）技术是应用酶学的 方法方法,在体外将目的基因与载体在体外将目的基因与载体DNADNA接接 合成复制子，再导入宿主细胞，筛选出合成复制子，再导入宿主细胞，筛选出 含有目的基因的转化子，经扩增提取获含有目的基因的转化子，经扩增提取获 得大量同一得大量同一DNADNA分子。分子。重组重组DNADNA技术的基本过程可概括为技术的基本过程可概括为“分、分、切、接、转、筛切、接、转、筛”。