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1、会计学1鼠疫病原学及鼠疫实验室管理和运行鼠疫病原学及鼠疫实验室管理和运行鼠疫病原学鼠疫病原学 一、鼠疫菌的生物学特性一、鼠疫菌的生物学特性一、鼠疫菌的生物学特性一、鼠疫菌的生物学特性 （一）（一）（一）（一）形态和染色：形态和染色：形态和染色：形态和染色：典型的鼠疫菌呈短而粗，中段膨大，两典型的鼠疫菌呈短而粗，中段膨大，两端钝圆，且两极浓染的卵圆形小杆菌端钝圆，且两极浓染的卵圆形小杆菌,菌体长约菌体长约1 12 2 mm，宽宽0.50.50.7 0.7 m m。有荚膜，无鞭毛，无芽胞。革兰氏染色。有荚膜，无鞭毛，无芽胞。革兰氏染色阴性。阴性。由于涂片材料来源不同，形态特点亦不同。由于涂片材料来
2、源不同，形态特点亦不同。用染疫动物或鼠疫患者及其尸体的新鲜材料所做涂片，用染疫动物或鼠疫患者及其尸体的新鲜材料所做涂片，一般可见到典型菌体形态，常散在，或成双排列，或呈群聚，一般可见到典型菌体形态，常散在，或成双排列，或呈群聚，偶见有短链状排列。偶见有短链状排列。用琼脂培养物制备的涂片标本，鼠疫杆菌呈球杆状，用琼脂培养物制备的涂片标本，鼠疫杆菌呈球杆状，着色比较均匀，两极浓染不明显或无两极浓染。用肉汤培着色比较均匀，两极浓染不明显或无两极浓染。用肉汤培养物涂片，可见呈散在或者短链状排列的两端钝圆，两极养物涂片，可见呈散在或者短链状排列的两端钝圆，两极浓染的小杆菌。浓染的小杆菌。鼠疫菌在跳蚤消化
3、道内的形态常发生变化，常呈近似鼠疫菌在跳蚤消化道内的形态常发生变化，常呈近似球状的卵圆形的球杆菌，有时也呈现两端浓染。球状的卵圆形的球杆菌，有时也呈现两端浓染。陈旧性病灶、腐败材料或在外界环境中生长的鼠疫菌陈旧性病灶、腐败材料或在外界环境中生长的鼠疫菌可有多形性变化，这一特性应在镜检过程中应引起足够的可有多形性变化，这一特性应在镜检过程中应引起足够的注意。注意。（二）（二）（二）（二）培养特性：培养特性：培养特性：培养特性：鼠疫菌为典型的异养菌，鼠疫菌为典型的异养菌，生长时需要多种有机物作为营养物生长时需要多种有机物作为营养物质，不过质，不过普通培养基就能满足鼠疫菌的生长。普通培养基就能满足鼠
4、疫菌的生长。鼠疫菌为需氧菌，也能在厌氧条件下生长，但适量供氧生长鼠疫菌为需氧菌，也能在厌氧条件下生长，但适量供氧生长最好，氧压过高反而对生长有害。在厌氧环境生长时，发育缓慢最好，氧压过高反而对生长有害。在厌氧环境生长时，发育缓慢且常出现变形。且常出现变形。鼠疫菌最适生长温度为鼠疫菌最适生长温度为28283030，在此温度下培育的菌落表，在此温度下培育的菌落表面干燥，易于用白金耳从培养基表面刮取，也较容易均匀地悬浮面干燥，易于用白金耳从培养基表面刮取，也较容易均匀地悬浮在生理盐水中。在在生理盐水中。在3737条件下生长缓慢，培养出的菌落表面湿润、条件下生长缓慢，培养出的菌落表面湿润、粘稠，不易刮
5、取，不易制成均匀菌悬液。粘稠，不易刮取，不易制成均匀菌悬液。培养基的最适培养基的最适pHpH值为值为6.96.97.17.1，但是，但是pHpH值在值在5.85.88.08.0范范围内鼠疫菌均可发育。围内鼠疫菌均可发育。鼠疫菌虽然在普通培养基上生长良好，但是发育缓慢，鼠疫菌虽然在普通培养基上生长良好，但是发育缓慢，一般需要一般需要24244848小时才能形成肉眼可见的灰白色小菌落，小时才能形成肉眼可见的灰白色小菌落，如果培养基质量差或者接种菌量过少，发育至成熟菌落的如果培养基质量差或者接种菌量过少，发育至成熟菌落的时间将会更长。时间将会更长。鼠疫菌在普通培养基上的发育，其群体形态具有一定鼠疫菌
6、在普通培养基上的发育，其群体形态具有一定的稳定性，的稳定性，在最适温度条件下在普通培养基上经在最适温度条件下在普通培养基上经16161818小小时培养可见形状不一，呈碎玻璃样小菌落，时培养可见形状不一，呈碎玻璃样小菌落，24244848小时后小时后形成肉眼可见灰白色小菌落。在显微镜下，成熟的菌落中形成肉眼可见灰白色小菌落。在显微镜下，成熟的菌落中心发暗、突起，有黄褐色粗糙颗粒，菌落周边围绕一圈宽心发暗、突起，有黄褐色粗糙颗粒，菌落周边围绕一圈宽窄不等、边缘不整、薄而透明的锯齿状花边。鼠疫菌的这窄不等、边缘不整、薄而透明的锯齿状花边。鼠疫菌的这一发育过程及成熟菌落的形态特点，是细菌学诊断的重要一
7、发育过程及成熟菌落的形态特点，是细菌学诊断的重要依据。依据。二、鼠疫检验材料的采集、保存和运输二、鼠疫检验材料的采集、保存和运输二、鼠疫检验材料的采集、保存和运输二、鼠疫检验材料的采集、保存和运输 （一）（一）（一）（一）鼠疫检验材料的采集鼠疫检验材料的采集鼠疫检验材料的采集鼠疫检验材料的采集：1.1.1.1.人体标本材料的采集人体标本材料的采集人体标本材料的采集人体标本材料的采集：凡疑似鼠疫患者，应争取在服用抗：凡疑似鼠疫患者，应争取在服用抗菌药物前采取被检材料标本，各型鼠疫患者除采静脉血液菌药物前采取被检材料标本，各型鼠疫患者除采静脉血液3 35 5 mlml供细菌学及血清学检验用外，可按
8、临床类型采取以下供细菌学及血清学检验用外，可按临床类型采取以下检验材料标本检验材料标本.1.1 1.1 1.1 1.1 疑似鼠疫患者和密切接者的取材疑似鼠疫患者和密切接者的取材疑似鼠疫患者和密切接者的取材疑似鼠疫患者和密切接者的取材：（1 1 1 1）疑似腺鼠疫患者）疑似腺鼠疫患者）疑似腺鼠疫患者）疑似腺鼠疫患者：选选取取肿肿大大淋淋巴巴结结，局局部部皮皮肤肤经经碘碘酒酒、酒酒精精消消毒毒后后用用注注射射器器刺刺入入腺腺体体中中央央，抽抽取取适适量量组组织织液液，保保存存于于灭灭菌菌试试管管中中或或直直接接培养在斜面或平板上；培养在斜面或平板上；如如腺腺肿肿过过小小取取组组织织液液困困难难，可
9、可用用无无菌菌注注射射器器抽抽取取0.30.30.50.5mlml灭灭菌菌生生理理盐盐水水注注入入腺腺肿肿内内，停停留留片片刻刻后后，再再缓缓慢慢抽抽取液体；取液体；如如腺腺肿肿开开放放或或有有波波动动感感，应应在在腺腺肿肿周周围围浸浸润润部部位位穿穿刺刺抽取组织渗出液。抽取组织渗出液。（2 2）疑似肺鼠疫患者）疑似肺鼠疫患者:疑疑似似鼠鼠疫疫患患者者如如有有咳咳痰痰时时，应应用用无无菌菌试试管管、平平皿皿或或广广口瓶收集痰液；口瓶收集痰液；患患者者无无痰痰时时用用无无菌菌棉棉签签取取咽咽喉喉分分泌泌物物装装入入无无菌菌试试管管内内送检。送检。（3 3）疑似败血型鼠疫患者）疑似败血型鼠疫患者:
10、该型患者除采静脉血该型患者除采静脉血1 1 mlml以上以上保存于无菌试管送检外，还应采集咽喉分泌物进行检验。保存于无菌试管送检外，还应采集咽喉分泌物进行检验。1.2 1.2 1.2 1.2 密密密密切切切切接接接接触触触触者者者者取取取取材材材材:一一般般采采用用灭灭菌菌棉棉签签自自咽咽喉喉部部取取材材检检查，同时可采取淋巴穿刺液。查，同时可采取淋巴穿刺液。1.3 1.3 1.3 1.3 疑疑疑疑似似似似鼠鼠鼠鼠疫疫疫疫尸尸尸尸体体体体的的的的取取取取材材材材:经经流流行行病病学学调调查查和和临临床床检检查查，不不能能排排除除鼠鼠疫疫的的尸尸体体应应以以细细菌菌学学检检查查作作为为最最后后诊
11、诊断断，取取材材方方法法以以解解剖剖取取材材为为主主，不不能能解解剖剖取取材材的的可可行行局局部部解解剖剖取取材材或穿刺取材。取材时注意以下事项：或穿刺取材。取材时注意以下事项：（1 1）取取材材前前应应准准备备好好取取材材的的所所有有器器械械、试试剂剂和和容容器器等等，如如剪剪刀刀、镊镊子子、手手术术刀刀、骨骨钳钳、穿穿刺刺针针、注注射射器器、生生理理盐盐水水、酒酒精精、灭灭菌菌广广口口瓶瓶、试试管管等等。以以及及消消毒毒处处理理、个个人防护的器械和药品等；人防护的器械和药品等；（2 2）取取材材应应选选取取病病变变损损害害最最明明显显的的部部分分采采集集。肝肝、脾脾、肺肺分分别别置置于于灭
12、灭菌菌广广口口瓶瓶中中，心心血血置置于于灭灭菌菌试试管管中中；取取口口腔腔和和鼻鼻腔腔分分泌泌物物于于灭灭菌菌试试管管中中；若若尸尸体体已已腐腐败败，可可取取股股骨、胫骨、胸骨、肋骨骨髓。骨、胫骨、胸骨、肋骨骨髓。（3 3）如如不不能能进进行行尸尸体体解解剖剖时时，可可行行局局部部取取材材。可可在在尸尸体体的的肝、脾、肺相应部位做局部小切口，采集相应的组织材料；肝、脾、肺相应部位做局部小切口，采集相应的组织材料；（4 4）对对鼠鼠疫疫尸尸体体在在不不能能进进行行解解剖剖取取材材时时，也也可可行行穿穿刺刺取取材材。方方法法是是将将要要行行取取材材的的淋淋巴巴腺腺、肝肝、脾脾、肺肺、心心等等脏脏器
13、器组组织织部部位位皮皮肤肤经经局局部部70%70%酒酒精精消消毒毒后后，用用腰腰椎椎穿穿刺刺针针抽抽取取淋淋巴巴腺腺、肝肝、脾脾、肺肺、心心等等脏脏器器组组织织液液和和心心血血，分分别别保保存存备备检检。若尸体腐败时，则应从胸骨柄或髂骨抽取骨髓液送检。若尸体腐败时，则应从胸骨柄或髂骨抽取骨髓液送检。2 2 2 2 动动动动物物物物标标标标本本本本材材材材料料料料的的的的采采采采集集集集:动动物物标标本本材材料料取取材材前前必必须须做做详详细细登登记记，主主要要记记录录动动物物名名称称、捕捕获获地地点点、捕捕获获时时间间、捕捕获获数数量量和和采采集集者者等等信信息息数数据据。取取材材时时可可根根
14、据据标标本本的的类类型型采采取取相相应应的方法。的方法。2.1 2.1 2.1 2.1 病病病病、死死死死动动动动物物物物的的的的取取取取材材材材:病病、死死动动物物标标本本取取材材的的原原则则是是按按先先皮皮下下、后后胸胸腔腔、最最后后腹腹腔腔的的顺顺序序进进行行取取材材，并并在在取取材材时时观观察皮下淋巴结及各脏器的病理变化。取材注意以下事项：察皮下淋巴结及各脏器的病理变化。取材注意以下事项：（1 1）用用3%3%来来苏苏尔尔液液消消毒毒解解剖剖部部位位的的皮皮毛毛，但但不不宜宜过过湿湿，以免来苏尔液进入体内，影响检验结果；以免来苏尔液进入体内，影响检验结果；（2 2）取取材材时时应应选选
15、取取病病变变明明显显处处取取材材，主主要要是是腹腹股股沟沟肿肿大大的淋巴结、肝脏、脾脏、肺脏和心血等。的淋巴结、肝脏、脾脏、肺脏和心血等。（3 3）若若脏脏器器腐腐败败或或残残缺缺不不全全，则则应应取取骨骨髓髓检检验验，其其方方法法 是是剥剥去去骨骨外外肌肌肉肉，再再用用酒酒精精棉棉包包裹裹，然然后后在在近近股股骨骨头头端端用用骨骨钳钳剪剪断断，以以接接种种针针取取红红骨骨髓髓检检查查。如如骨骨髓髓已已干干枯枯，可可用用灭灭菌菌注注射射器器注注入入少少许许生生理理盐盐水水抽抽取取之之，或或将将另另一一端端打打开开，用生理盐水直接冲入平皿内培养。用生理盐水直接冲入平皿内培养。（4 4）取取材材时
16、时注注意意每每取取完完一一个个脏脏器器后后均均应应将将剪剪刀刀、镊镊子子经经来来苏苏尔尔棉棉块块、清清水水棉棉块块、干干棉棉块块一一一一擦擦拭拭干干净净，用用火火焰焰灼灼烧烧，最后沾酒精过火焰冷却后备用；最后沾酒精过火焰冷却后备用；（5 5）病、死动物的材料应采取两份，一份自检，一份送自）病、死动物的材料应采取两份，一份自检，一份送自治区疾控中心鼠防科复检。治区疾控中心鼠防科复检。2.2 2.2 2.2 2.2 活体动物的取材活体动物的取材活体动物的取材活体动物的取材：捕获活体动物原则上只采取肝、脾：捕获活体动物原则上只采取肝、脾或有病变的组织进行检查。每份材料需独立存放于灭菌小或有病变的组织
17、进行检查。每份材料需独立存放于灭菌小瓶内。瓶内。2.3 2.3 2.3 2.3 昆虫材料的采集昆虫材料的采集昆虫材料的采集昆虫材料的采集：可进行鼠疫检验的昆虫材料包括：可进行鼠疫检验的昆虫材料包括：蚤类、蜱类、螨类、吸虱等，其中以蚤类为重点。在进行蚤类、蜱类、螨类、吸虱等，其中以蚤类为重点。在进行昆虫标本材料采集时需注意以下事项：昆虫标本材料采集时需注意以下事项：（1 1）宿宿主主动动物物要要单单只只装装袋袋，并并注注明明采采集集时时间间、地地点点、宿宿主主名称和生境等。名称和生境等。（2 2）同同体体或或同同穴穴的的昆昆虫虫在在分分类类鉴鉴定定后后，分分组组或或单单只只拣拣入入装装有蚤类保存
18、液有蚤类保存液1/201/20万龙胆紫万龙胆紫2%2%盐水的小瓶内送检。盐水的小瓶内送检。（二）鼠疫检验材料的保存（二）鼠疫检验材料的保存（二）鼠疫检验材料的保存（二）鼠疫检验材料的保存 鼠疫材料的检验应遵循就近检验的原则，但在无条件时，鼠疫材料的检验应遵循就近检验的原则，但在无条件时，应采取以下方法妥善保存检验材料。应采取以下方法妥善保存检验材料。1 1 1 1 组织块的保存组织块的保存组织块的保存组织块的保存：（1 1）将将组组织织块块保保存存于于生生理理盐盐水水中中，用用石石蜡蜡密密封封容容器器，可可保保存存几日。几日。（2 2）将将组组织织块块保保存存于于中中性性甘甘油油保保存存液液（
19、中中性性甘甘油油20 20 mlml，蒸蒸馏馏水水80 80 mlml，碳碳酸酸钙钙2 2g g）。将将1 12 2 cmcm3 3的的脏脏器器小小块块放放入入5 510 10 mlml上述保存液中，可保存数日。上述保存液中，可保存数日。（3 3）野野外外采采集集脏脏器器材材料料时时常常将将组组织织块块放放入入中中性性油油脂脂保保存存液液（液液体体石石蜡蜡1 1份份；羊羊毛毛脂脂1.51.5份份；凡凡士士林林或或固固体体石石蜡蜡1 1份份）。加热混匀后，置小广口瓶中高压灭菌后备用。加热混匀后，置小广口瓶中高压灭菌后备用。操操作作时时应应注注意意先先将将保保存存液液溶溶化化，待待温温度度降降至至
20、不不烫烫手手时时（约约40404545）倒倒入入放放置置脏脏器器块块的的小小瓶瓶内内，保保存存液液应应将将脏脏器块完全覆盖。该保存液在低温下保存时限不应超过一周。器块完全覆盖。该保存液在低温下保存时限不应超过一周。2 2 2 2 蚤类标本的保存蚤类标本的保存蚤类标本的保存蚤类标本的保存：（1 1）活活蚤蚤的的保保存存：将将活活蚤蚤置置于于清清洁洁的的试试管管或或小小瓶瓶中中，用用白白布布封封好好瓶瓶口口。并并放放入入几几片片无无味味的的绿绿草草，管管底底放放少少许许干干沙沙或或干干燥燥的的滤滤纸纸块块（厚厚度度约约1 1 cmcm）置置于于阴阴暗暗处处，避避免免接接触触消消毒毒液及有毒气体。液
21、及有毒气体。（2 2）保存液法：将蚤放入）保存液法：将蚤放入1/201/20万龙胆紫盐水中保存，万龙胆紫盐水中保存，（配方为（配方为2%2%氯化钠氯化钠100 100 mlml中加入中加入1:1 0001:1 000龙胆紫液龙胆紫液0.5 0.5 mlml）。）。（三）（三）（三）（三）检验检验检验检验标本（菌种）的包装与运输标本（菌种）的包装与运输标本（菌种）的包装与运输标本（菌种）的包装与运输 1 1）准确详细填写送检单。应包括：标本（菌种）种类、准确详细填写送检单。应包括：标本（菌种）种类、标本（菌种）数量、采集地点、采集时间、采取标本名称、标本（菌种）数量、采集地点、采集时间、采取标本
22、名称、采集者、送检者、菌种检验者、菌种检验时间、送检单位采集者、送检者、菌种检验者、菌种检验时间、送检单位等。等。2 2）按照国家生物安全的相关规定，将装有材料的容器按照国家生物安全的相关规定，将装有材料的容器（试管、小瓶等）用石蜡或胶布密封，外裹以塑料布，再（试管、小瓶等）用石蜡或胶布密封，外裹以塑料布，再用浸有消毒液的棉花包裹后装入特制的容器内并附上详细用浸有消毒液的棉花包裹后装入特制的容器内并附上详细送检报告单，送检报告单，指派指派2 2名人员（其中名人员（其中1 1名为专业人员）名为专业人员）用当地用当地最快的交通工具运送。最快的交通工具运送。三、鼠疫病原学检验三、鼠疫病原学检验三、鼠
23、疫病原学检验三、鼠疫病原学检验 （一）鼠疫细菌学检验和鉴定程序（一）鼠疫细菌学检验和鉴定程序 常规的鼠疫病原体检验包括：菌体形态检查、细菌常规的鼠疫病原体检验包括：菌体形态检查、细菌培养、鼠疫噬菌体裂解试验和动物试验四步，通称培养、鼠疫噬菌体裂解试验和动物试验四步，通称“四四步检验步检验”。鼠疫菌体形态检查鼠疫菌体形态检查鼠疫菌体形态检查鼠疫菌体形态检查 1 1 1 1 涂片涂片涂片涂片 在收集到检验材料之后要尽快地涂片，剪取腺体、在收集到检验材料之后要尽快地涂片，剪取腺体、肝、脾、肺、心，用脏器切面在洁净载玻片上压印，或取肝、脾、肺、心，用脏器切面在洁净载玻片上压印，或取骨髓、脑脊液及各种渗
24、出液、痰等用接种环直接涂片，或骨髓、脑脊液及各种渗出液、痰等用接种环直接涂片，或挑取可疑菌落用生理盐水研磨涂片。挑取可疑菌落用生理盐水研磨涂片。2 2 2 2 固定固定固定固定 在紧急情况下，允许加热固定，但如果用甲醇在紧急情况下，允许加热固定，但如果用甲醇（或（或95%95%酒精或酒精或95%95%酒精和乙醚各半）固定，可以促进鼠疫酒精和乙醚各半）固定，可以促进鼠疫菌两端浓染效果更好，并能杀死鼠疫菌。将可疑鼠疫材料菌两端浓染效果更好，并能杀死鼠疫菌。将可疑鼠疫材料涂抹在载玻片上，晾干或制成压印涂片，浸在固定液中，涂抹在载玻片上，晾干或制成压印涂片，浸在固定液中，固定固定5 51010分钟，取
25、出晾干染色。分钟，取出晾干染色。3 3 3 3 染色染色染色染色 分别用革兰氏染液、美兰染液进行染色。分别用革兰氏染液、美兰染液进行染色。1 1）革兰氏染色革兰氏染色革兰氏染色革兰氏染色 将结晶紫染液加于已固定的标本上，染将结晶紫染液加于已固定的标本上，染1 1分钟；分钟；水洗后用卢戈氏碘液染水洗后用卢戈氏碘液染1 1分钟；分钟；水洗后用水洗后用95%95%酒精脱色约酒精脱色约0.50.51 1分钟，将玻片轻轻摇动直分钟，将玻片轻轻摇动直到无紫色继续脱落为止；到无紫色继续脱落为止；水洗后用稀释石碳酸复红复染水洗后用稀释石碳酸复红复染1 1分钟，水洗待干。分钟，水洗待干。2 2）美兰染色美兰染色
26、美兰染色美兰染色 将染液加在已固定的涂片上，染将染液加在已固定的涂片上，染3 35 5分钟，然后再水分钟，然后再水洗，待干，镜检。洗，待干，镜检。4 4 镜检镜检镜检镜检 在显微镜下，查找典型鼠疫菌，即两端钝园、两在显微镜下，查找典型鼠疫菌，即两端钝园、两极浓染、卵园形，革兰氏阴性小杆菌（菌体长极浓染、卵园形，革兰氏阴性小杆菌（菌体长1 12um,2um,宽宽0.50.50.7um0.7um）。显微镜标本对鼠疫菌的鉴别诊断有一定帮）。显微镜标本对鼠疫菌的鉴别诊断有一定帮助，仅根据鼠疫菌的形态，不能做最后确诊。助，仅根据鼠疫菌的形态，不能做最后确诊。细菌培养细菌培养细菌培养细菌培养 鼠疫菌培养可
27、根据待检标本的种类和新鲜程度选用不鼠疫菌培养可根据待检标本的种类和新鲜程度选用不同的培养基进行分离培养，腐败材料最好经皮感染实验动同的培养基进行分离培养，腐败材料最好经皮感染实验动物，待接种动物死亡或物，待接种动物死亡或7 7日处死后取材培养。日处死后取材培养。1 1 1 1 培养基培养基培养基培养基:培养基是细菌培养获得准确结果的基础培养基是细菌培养获得准确结果的基础,必须在必须在营养成分、酸碱度、透明度及高压灭菌等方面严格把关。营养成分、酸碱度、透明度及高压灭菌等方面严格把关。并进行质量控制。并进行质量控制。细菌学监测中常用培养基有：细菌学监测中常用培养基有：1 1 1 1）营养琼脂培养基
28、）营养琼脂培养基）营养琼脂培养基）营养琼脂培养基：一般市场有售，按说明溶解于蒸馏水中，按一定量分一般市场有售，按说明溶解于蒸馏水中，按一定量分装克氏瓶内，装克氏瓶内，1515磅磅30 30 minmin高压灭菌后倒制平板备用。高压灭菌后倒制平板备用。2 2 2 2）LBLBLBLB培养基培养基培养基培养基：胰蛋白胨胰蛋白胨10 10 g g、酵母粉酵母粉5 5 g g、氯化钠氯化钠 5 5 g g、琼脂粉琼脂粉6 6 g g（不同生产厂家的琼脂粉加量不同，需做预试验确定加不同生产厂家的琼脂粉加量不同，需做预试验确定加入量）、蒸馏水入量）、蒸馏水1 0001 000mlml。制备时将所有成分加热
29、溶解，用制备时将所有成分加热溶解，用1 1 N N氢氧化钠将氢氧化钠将pHpH调调至至7.27.2；分装克氏瓶内，每瓶约分装克氏瓶内，每瓶约300 300 mlml；1515磅磅30 30 minmin高压高压灭菌；灭菌；待克氏瓶中培养基冷却至待克氏瓶中培养基冷却至5050左右，无菌条件下倒左右，无菌条件下倒制平板，每个平板倒入约制平板，每个平板倒入约15 15 mlml，分离细菌时使用。分离细菌时使用。3 3 3 3）琼脂斜面）琼脂斜面）琼脂斜面）琼脂斜面：将上述溶化好的琼脂培基分装量为试管的：将上述溶化好的琼脂培基分装量为试管的1/51/5，1515磅磅30 30 minmin高压灭菌后，
30、取出趁热摆放制成斜面，高压灭菌后，取出趁热摆放制成斜面，斜面长度约为试管长度的斜面长度约为试管长度的1/31/3。4 4 4 4）琼脂高层：）琼脂高层：）琼脂高层：）琼脂高层：将上述溶化好的琼脂培基分装量为试管的将上述溶化好的琼脂培基分装量为试管的1/31/3，15 15磅磅30 30 minmin高压灭菌后，取出竖直摆放冷却备用。高压灭菌后，取出竖直摆放冷却备用。2 2 2 2 取材和接种取材和接种取材和接种取材和接种 培养前取材的器械消毒应按以下顺序进行培养前取材的器械消毒应按以下顺序进行:剪刀、镊子等先用浸有来苏尔液的棉球擦试剪刀、镊子等先用浸有来苏尔液的棉球擦试清水棉清水棉球擦球擦干棉
31、球擦干干棉球擦干过火焰过火焰浸入浸入95%95%酒精中酒精中取出过火取出过火焰，冷却后取材。每取完一个脏器，剪刀、镊子等都需重焰，冷却后取材。每取完一个脏器，剪刀、镊子等都需重新严格消毒。新严格消毒。1 1 1 1）疑似患者的材料疑似患者的材料疑似患者的材料疑似患者的材料:淋淋巴巴腺腺穿穿刺刺液液：在在含含菌菌量量高高时时，用用白白金金耳耳划划线线培培养养，如如已已用用生生理理盐盐水水稀稀释释的的穿穿刺刺液液，则则必必须须充充分分振振荡荡，然然后后用用白白金金耳耳做做划划线线培培养养。或或用用毛毛细细管管滴滴于于培培养养基基表表面面1 12 2滴滴，再用白金耳划线。再用白金耳划线。痰痰：痰痰的
32、的培培养养以以稀稀释释培培养养法法较较宜宜。用用棉棉签签采采取取的的咽咽喉喉分泌物可直接涂于培养基。分泌物可直接涂于培养基。血血液液：直直接接培培养养。将将1 1 mlml血血液液加加入入5 5 mlml肉肉汤汤内内，培培养养2424小时后，再用白金耳取出，培养在平板上。小时后，再用白金耳取出，培养在平板上。脓汁：培养法同痰液。脓汁：培养法同痰液。2 2 2 2）尸体材料）尸体材料）尸体材料）尸体材料:脏脏器器：根根据据不不同同的的脏脏器器材材料料，采采取取不不同同的的培培养养方方法法，并做好详细标记。并做好详细标记。用用灭灭菌菌剪剪刀刀剪剪下下一一小小块块脏脏器器材材料料，以以镊镊子子夹夹住
33、住，直直接接点于培养基靠边处点于培养基靠边处,然后用白金耳划线。然后用白金耳划线。骨髓：一般以接种针采取骨髓，直接划线培养。骨髓：一般以接种针采取骨髓，直接划线培养。3 3 3 3）病死鼠脏器材料）病死鼠脏器材料）病死鼠脏器材料）病死鼠脏器材料:培养的原则是单只培养、单只接种。培养的原则是单只培养、单只接种。将新鲜脏器切面直接点种于琼脂平板靠边处，然后用将新鲜脏器切面直接点种于琼脂平板靠边处，然后用白金耳划线培养。点种后的脏器制成悬液接种试验动物。白金耳划线培养。点种后的脏器制成悬液接种试验动物。对于较腐败的死鼠脏器，可直接用白金耳从脏器切面上取对于较腐败的死鼠脏器，可直接用白金耳从脏器切面上
34、取材划线培养，或通过小白鼠后再进行细菌培养。材划线培养，或通过小白鼠后再进行细菌培养。4 4 4 4）捕获活鼠脏器材料）捕获活鼠脏器材料）捕获活鼠脏器材料）捕获活鼠脏器材料：培养原则是单只培养，集组接种，每组培养原则是单只培养，集组接种，每组 10 10只。只。一一般般情情况况下下只只取取肝肝、脾脾检检验验，每每两两只只鼠鼠脏脏器器，分分别别培培养养于于1 1个个平平皿皿上上。按按同同一一时时间间、同同一一地地点点捕捕获获的的同同种种动动物物培培养养后后可可分分组组进进行行动动物物试试验验，但但每每组组一一般般不不得得超超过过1010只只，小型啮齿动物不得超过小型啮齿动物不得超过1515只。只
35、。5 5 5 5）蚤、蜱等昆虫材料）蚤、蜱等昆虫材料）蚤、蜱等昆虫材料）蚤、蜱等昆虫材料：病死鼠体蚤均需单只检菌，将蚤体放入灭菌的凹玻璃病死鼠体蚤均需单只检菌，将蚤体放入灭菌的凹玻璃板上，用生理盐水冼板上，用生理盐水冼3 3次，将后胸背板和第一腹节剥开，次，将后胸背板和第一腹节剥开，用解剖针固定肛门前方，再用另一解剖针从头部刺入，拉用解剖针固定肛门前方，再用另一解剖针从头部刺入，拉出蚤胃，用灭菌白金耳在板上将胃磨破，接种于培养基上。出蚤胃，用灭菌白金耳在板上将胃磨破，接种于培养基上。3 3 3 3 培养培养培养培养 鼠鼠疫疫菌菌的的最最适适培培养养温温度度为为2828，培培养养的的动动物物材材
36、料料连连续续观观察察3 3天天，病病死死材材料料及及蚤蚤类类材材料料连连续续观观察察5 5天天，3 3天天或或5 5天天不生长即可处理。不生长即可处理。值值得得注注意意的的是是，野野外外实实验验室室应应随随时时观观察察孵孵箱箱温温度度的的变化，始终保持在变化，始终保持在28302830之间。之间。4 4 4 4 结果观察结果观察结果观察结果观察 培培养养24244848小小时时后后肉肉眼眼可可见见菌菌落落形形成成，直直径径约约0.10.10.2 0.2 mm,mm,中中央央突突起起半半透透明明淡淡灰灰色色小小菌菌落落.镜镜下下菌菌落落中中央央呈呈黄黄褐色褐色,有粗糙颗粒有粗糙颗粒,边缘薄呈半透
37、明有锯齿状花边。边缘薄呈半透明有锯齿状花边。将将具具有有上上述述特特点点的的菌菌落落挑挑选选出出来来进进一一步步做做鼠鼠疫疫噬噬菌菌体体试试验验。菌菌落落观观察察必必须须仔仔细细认认真真，肉肉眼眼初初筛筛后后，应应勾勾画画出出可可疑菌在镜下进一步观察确认，不得轻意丢弃。疑菌在镜下进一步观察确认，不得轻意丢弃。鼠疫噬菌体裂解试验鼠疫噬菌体裂解试验鼠疫噬菌体裂解试验鼠疫噬菌体裂解试验 鼠疫噬菌体裂解试验是鼠疫细菌学诊断中较特异的鼠疫噬菌体裂解试验是鼠疫细菌学诊断中较特异的诊断方法。诊断方法。培养时发现的可疑菌落，用白金耳勾出移种在另一个培养时发现的可疑菌落，用白金耳勾出移种在另一个琼脂平皿上，接种
38、划线要密。然后用注射器滴加琼脂平皿上，接种划线要密。然后用注射器滴加1 1滴鼠疫滴鼠疫噬菌体于划线部位起点中心部分，合起平板并倾斜使噬菌噬菌体于划线部位起点中心部分，合起平板并倾斜使噬菌体流线与培养划线垂直交叉流下，放入体流线与培养划线垂直交叉流下，放入2828温箱中，次日温箱中，次日观察结果。如出现噬菌带则判为鼠疫噬菌体裂解试验阳性。观察结果。如出现噬菌带则判为鼠疫噬菌体裂解试验阳性。即可判定为鼠疫菌。即可判定为鼠疫菌。一般做培养检查的同时做噬菌体裂解试验。即同时接一般做培养检查的同时做噬菌体裂解试验。即同时接种两个琼脂平皿，一个做培养检查，另一个做鼠疫噬菌体种两个琼脂平皿，一个做培养检查，
39、另一个做鼠疫噬菌体裂解试验。裂解试验。操作中应注意以下几点：操作中应注意以下几点：操作中应注意以下几点：操作中应注意以下几点：1 1）疫噬菌体必须保持足够的效价（一般是）疫噬菌体必须保持足够的效价（一般是1010-8-8）效价降）效价降低到一定程度，则噬菌带不明显，噬菌体失效则不出现噬低到一定程度，则噬菌带不明显，噬菌体失效则不出现噬菌斑，造成错误的判断。菌斑，造成错误的判断。2 2）使用噬菌体前需观察有无污染，如有污染不得使用。使用噬菌体前需观察有无污染，如有污染不得使用。3 3）操操作作要要规规范范，滴滴加加噬噬菌菌体体时时，必必须须让让噬噬菌菌体体液液自自然然流流下。下。4 4）真假阳性
40、的区别：）真假阳性的区别：阳阳性性：噬噬菌菌带带中中间间无无鼠鼠疫疫菌菌生生长长，噬噬菌菌带带边边缘缘在在显显微微镜镜下下有有被被侵侵噬噬的的斑斑纹纹噬噬菌菌带带逐逐渐渐扩扩展展，扩扩展展后后两两边边有有形形象象模糊的边缘。模糊的边缘。假阳性：噬菌体流道中间有与培养菌相同的菌落，流假阳性：噬菌体流道中间有与培养菌相同的菌落，流道边缘菌落或菌苔完整，由于细菌生长，流道逐渐缩小或道边缘菌落或菌苔完整，由于细菌生长，流道逐渐缩小或不明显不明显 。动物试验动物试验动物试验动物试验 动动物物试试验验在在鼠鼠疫疫细细菌菌学学检检查查中中有有2 2种种目目的的。一一种种目目的的是是材材料料含含菌菌量量少少或
41、或材材料料腐腐败败，培培养养不不易易获获得得阳阳性性结结果果时时，以以敏敏感感动动物物体体培培养养，同同时时也也为为了了观观察察细细菌菌对对动动物物的的致致病病性性和和病病理理变变化化；另另一一种种目目的的是是菌菌株株已已经经分分离离出出来来，为为了了测测定定该该菌菌株株毒毒力力的的强强弱弱，或或者者为为了了增增强强菌菌株株的的毒毒力力，而而作作动动物物试验。试验。试试验验动动物物常常用用小小白白鼠鼠（18-20g18-20g）和和豚豚鼠鼠（250-300g250-300g），而而以以豚豚鼠鼠最最好好，因因小小白白鼠鼠对对鼠鼠疫疫菌菌的的毒毒素素较较敏敏感感且且在在夏夏季季死亡后极易腐败，分离
42、鼠疫菌较困难。死亡后极易腐败，分离鼠疫菌较困难。1 1 1 1 被检悬液的制备被检悬液的制备被检悬液的制备被检悬液的制备：（1 1）脏脏器器：将将所所取取脏脏器器块块放放入入已已消消毒毒好好的的乳乳钵钵中中剪剪碎碎研研磨磨后后，按按1:101:10的的比比例例加加入入生生理理盐盐水水，为为了了便便于于注注射射器器吸吸取脏器悬液，可在脏器悬液中加一小块灭菌脱脂棉。取脏器悬液，可在脏器悬液中加一小块灭菌脱脂棉。（2 2）昆昆虫虫：将将已已分分类类好好的的蚤蚤、蜱蜱从从保保存存液液取取出出，用用灭灭菌菌盐盐水水反反复复冲冲洗洗数数次次，然然后后研研磨磨制制成成悬悬液液，接接种种动动物物；当当检检获获
43、大大量量蚤蚤类类时时，可可按按地地区区、宿宿主主、蚤蚤种种进进行行分分组组，每每组组3030只。只。2 2 2 2 接种方法接种方法接种方法接种方法：根根据据不不同同目目的的、被被检检材材料料新新鲜鲜及及腐腐败败程程度度来来决决定定接接种种方法。方法。（1 1）腹腹腔腔接接种种：一一般般新新鲜鲜材材料料和和纯纯培培养养的的菌菌液液，为为了了迅迅速速获获取取阳阳性性结结果果而而又又不不期期待待它它出出现现较较完完全全的的病病理理变变化化时时多多用腹腔接种。用腹腔接种。将将腹腹部部皮皮肤肤注注射射部部位位剪剪毛毛，经经消消毒毒后后提提起起腹腹部部，将将被被检检悬悬液液注注入入腹腹腔腔，注注意意不不
44、得得损损伤伤内内脏脏器器官官。接接种种量量为为小小白白鼠鼠每只每只0.20.20.40.4mlml，豚鼠每只接种，豚鼠每只接种0.50.50.60.6mlml。（2 2）经经皮皮接接种种：这这种种方方法法多多用用于于腐腐败败或或污污染染程程度度严严重重的的材材料料。将将小小白白鼠鼠或或豚豚鼠鼠腹腹部部毛毛剪剪去去一一小小块块，用用刀刀刮刮至至有有出出血血点点后后，将将待待检检材材料料以以棉棉拭拭子子涂涂布布于于已已刮刮过过的的皮皮上上并并反反复复揉揉擦，使液体充分浸入。擦，使液体充分浸入。（3 3）皮皮下下接接种种：材材料料不不太太腐腐败败时时此此方方法法较较好好，一一般般病病程程短短，病理变
45、化较明显。是动物接种最常用的方法。病理变化较明显。是动物接种最常用的方法。试试验验动动物物鼠鼠蹊蹊部部经经消消毒毒后后将将被被检检悬悬液液注注入入皮皮下下，接接种剂量同腹腔接种法。种剂量同腹腔接种法。一一般般每每份份材材料料接接种种两两只只小小白白鼠鼠，按按材材料料的的新新鲜鲜与与腐腐败败的的不不同同程程度度常常采采取取两两种种不不同同途途径径进进行行接接种种。如如材材料料新新鲜鲜可可采采用用皮皮下下、腹腹腔腔各各一一只只，如如果果材材料料腐腐败败，则则可可采采取取皮下、经皮各接种一只。皮下、经皮各接种一只。3 3 3 3 饲养与结果观察饲养与结果观察饲养与结果观察饲养与结果观察:（1 1）实
46、验动物接种后，放入饲养盒内，详细记录编号、接）实验动物接种后，放入饲养盒内，详细记录编号、接种日期等，每日观察种日期等，每日观察1 12 2次，直至动物死亡或次，直至动物死亡或5 57 7天观察天观察期满，处死剖检。同时应注意感染动物死亡后，饲养盒的期满，处死剖检。同时应注意感染动物死亡后，饲养盒的清洗与消毒。清洗与消毒。（2 2）鼠疫材料的实验动物，一般）鼠疫材料的实验动物，一般1 13 3天发病（症状为不摄天发病（症状为不摄食，竖毛尤以背部为明显衰弱），食，竖毛尤以背部为明显衰弱），3 37 7日死亡。动物死亡日死亡。动物死亡后应迅速解剖，观察病理变化并做培养及噬菌体裂解试验。后应迅速解剖
47、，观察病理变化并做培养及噬菌体裂解试验。必要时可进行动物传代。必要时可进行动物传代。感染感染3 34 4天死亡的动物，解剖时常见急性鼠疫特有的天死亡的动物，解剖时常见急性鼠疫特有的病理变化，皮下血管充血，肝、脾有微小病死灶，充血并病理变化，皮下血管充血，肝、脾有微小病死灶，充血并肿大，肺充血，心血不凝，皮下注射部位可见出血性浸润，肿大，肺充血，心血不凝，皮下注射部位可见出血性浸润，注射部位淋巴结肿大。注射部位淋巴结肿大。（二）鼠疫菌的判定依据及鉴定：（二）鼠疫菌的判定依据及鉴定：（二）鼠疫菌的判定依据及鉴定：（二）鼠疫菌的判定依据及鉴定：（1 1）形态特征与染色特征与鼠疫菌相符。）形态特征与染
48、色特征与鼠疫菌相符。（2 2）培养特征与鼠疫菌一致。）培养特征与鼠疫菌一致。（3 3）被被鼠鼠疫疫噬噬菌菌体体裂裂解解，但但应应注注意意排排除除假假噬噬菌菌现现象象，该该项项指标为判定鼠疫菌的主要依据。指标为判定鼠疫菌的主要依据。（4 4）实实验验感感染染的的小小白白鼠鼠或或豚豚鼠鼠，具具有有鼠鼠疫疫特特有有的的病病理理改改变变，并从实验动物体内分离出鼠疫菌。并从实验动物体内分离出鼠疫菌。（三）结果报告（三）结果报告（三）结果报告（三）结果报告：判定为鼠疫菌时，除通知送检单位以便及时采取防判定为鼠疫菌时，除通知送检单位以便及时采取防治措施外，应立即以书面形式连同两只试管培养物，按照治措施外，应
49、立即以书面形式连同两只试管培养物，按照卫生部卫生部可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定样本运输管理规定进行进行包装包装和运输，派专人专车上送省和运输，派专人专车上送省级专业机构作复查判定。级专业机构作复查判定。上报内容包括：被检材料的种类、数量、来源、时间、上报内容包括：被检材料的种类、数量、来源、时间、送检者、收到时间、检验者（单位、姓名并盖章）主要判送检者、收到时间、检验者（单位、姓名并盖章）主要判定依据。培养物在送检同时要留一份备查，待作出最终判定依据。培养物在送检同时要留一份备查，待作出最终判定后再行销毁或上送。定后再行销
50、毁或上送。鼠疫实验室及其管理和运行鼠疫实验室及其管理和运行 按照中国的病原微生物实验室生物安全管理条例按照中国的病原微生物实验室生物安全管理条例（国务院令（国务院令424424号）和实验室生物通用要求号）和实验室生物通用要求（GB19589-2004GB19589-2004）的规定，鼠疫病原微生物操作实验室应的规定，鼠疫病原微生物操作实验室应具备国家二级生物安全水平（具备国家二级生物安全水平（BSL-2BSL-2）。）。（一）基本要求（一）基本要求（一）基本要求（一）基本要求 1 1 鼠疫细菌学检验必须在专用的鼠疫细菌学检验必须在专用的BSL-2BSL-2实验室内进行。实验室内进行。2 2 检