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1、一、概述一、概述 （一）维生素的分类及共性（一）维生素的分类及共性（二）常见维生素的生理功能（二）常见维生素的生理功能（三）（三）维生素的测定意义维生素的测定意义 第1页/共57页 （一）维生素的分类（一）维生素的分类 目前已发现的维生素约有二、三十种，按目前已发现的维生素约有二、三十种，按溶解性溶解性可分为两大类：可分为两大类：脂溶性维生素：脂溶性维生素：A、D、E、K等等；水溶性维生素：水溶性维生素：B B、C C等（如等（如B1、B2、B6、B12和和C等）等）第2页/共57页维生素都具有以下共同特点：维生素都具有以下共同特点：这些化合物或其前体化合物都在天然食物中存在；它们不能供给机体
2、热能；也不是构成组织的基本原料；主要功用是通过作为辅酶的成份调节代谢过程，需要量 极小；它们一般在体内不能合成，或合成量不能满足生理需要，必须经常从食物中摄取；长期缺乏任何一种维生素都会导致相应的疾病。第3页/共57页维生素维生素A：是人体必需营养素，能促进人体发育，防止眼是人体必需营养素，能促进人体发育，防止眼膜膜 炎、夜盲症等疾病。炎、夜盲症等疾病。维生素维生素B B1 1：也叫硫胺素，对人体的功能主要是防脚气病、也叫硫胺素，对人体的功能主要是防脚气病、神经神经 炎，帮助消化，促进发育。炎，帮助消化，促进发育。维生素维生素B B2 2：对人体功能防口角炎、皮肤炎，防止怕光现象。对人体功能防
3、口角炎、皮肤炎，防止怕光现象。维生素维生素C C：防坏血病，促进外伤愈合，使机体增强抵抗力。防坏血病，促进外伤愈合，使机体增强抵抗力。维生素维生素D D：调节体内矿物盐的平衡，特别是对人体内钙、磷调节体内矿物盐的平衡，特别是对人体内钙、磷的的 代谢，并能防止软骨病。代谢，并能防止软骨病。（二）常见维生素的生理功能（二）常见维生素的生理功能第4页/共57页（三）维生素的测定意义（三）维生素的测定意义评价食品的营养价值；评价食品的营养价值；开发利用富含维生素的食品资源；开发利用富含维生素的食品资源；指导人们合理调整膳食结构，防止维生素缺乏症；指导人们合理调整膳食结构，防止维生素缺乏症；研究维生素在
4、食品加工、贮存等过程中的稳定性，指导制研究维生素在食品加工、贮存等过程中的稳定性，指导制定合理的生产工艺条件及贮存条件，最大限度地保留各种定合理的生产工艺条件及贮存条件，最大限度地保留各种维生素；维生素；监督维生素强化食品的强化剂量，防止维生素摄入过多引监督维生素强化食品的强化剂量，防止维生素摄入过多引起中毒。起中毒。第5页/共57页二、脂溶性维生素的测定二、脂溶性维生素的测定脂溶性维生素的理化性质脂溶性维生素的理化性质脂溶性维生素的测定方法脂溶性维生素的测定方法第6页/共57页 常与脂类物质共存于食物中，摄食时一道被人体吸收。常与脂类物质共存于食物中，摄食时一道被人体吸收。1.1.溶解性：溶
5、解性：不溶于水，易溶于脂肪、乙醇、丙酮、氯仿、乙醚、苯等有机溶剂；不溶于水，易溶于脂肪、乙醇、丙酮、氯仿、乙醚、苯等有机溶剂；2.2.耐酸碱性：耐酸碱性：维生素维生素A A、D D对酸不稳定，对碱稳定；对酸不稳定，对碱稳定；维生素维生素E E对酸稳定，对碱不稳定，但在抗氧化剂存在下或惰性气体保护下，也能经受碱对酸稳定，对碱不稳定，但在抗氧化剂存在下或惰性气体保护下，也能经受碱的煮沸。的煮沸。（一）脂溶性维生素的主要理化性质（一）脂溶性维生素的主要理化性质第7页/共57页 3 3耐热性、耐氧化性：耐热性、耐氧化性：耐热性 氧化性VA 好，能经受煮沸 易被氧化（光、热促其氧化）V D 好，能经受煮
6、沸 不易被氧化 V E 好，能经受煮沸 在空气中能慢慢被氧化 （光、热、碱促其氧化）第8页/共57页 根据上述性质，测定脂溶性维生素时，通常：皂化样品 类脂物和维生素分开 有机溶剂提取脂溶性维生素(不皂化物)浓缩 溶于适当的溶剂 测定。（食物中脂溶性维生素常与脂肪共存，一道被人体吸收，所以要除去脂肪，防止干扰。）在皂化和浓缩时，为防止维生素的氧化分解，常加入抗氧化剂(如焦性没食子酸、维生素C等)。对于A、D、E共存的样品，或杂质含量高的样品，在皂化提取后，还需进行层析分离。第9页/共57页常用的测定方法有:薄层色谱法、分光光度法、气相薄层色谱法、分光光度法、气相色谱法、高效液相色谱法等。色谱法
7、、高效液相色谱法等。高效液相色谱法：高效液相色谱法：快速、高效、高灵敏度等优点，是我国卫生标准分析方法 （二）脂溶性维生素的测定方法（二）脂溶性维生素的测定方法 第10页/共57页 食品中食品中VA和和VE的测定的测定 （GB5009.82-2003)维生素维生素A A：存在于动物性脂肪中，主要来源于肝脏、鱼干油、蛋类、乳类等动物性食品中；植物性食品中不合VA，但在深色果蔬中含有胡萝卜素，它在人体内可转变为VA，故称为VA原;包括A1和A2。维生素维生素E E：第11页/共57页 （第一法）（第一法）HPLC测定测定VA和和VE 一、原理一、原理 食品样品经皂化处理后，用有机溶剂将食品中的脂溶
8、性维生素（如维生素A A、维生素E E）从不可皂化的部分提取出来，经过浓缩除去有机溶剂，再用适当的溶剂溶解后，用HPLCHPLC法C C1818反相柱将V VA A和V VE E分离，经紫外检测器，用内标法测定其含量。第12页/共57页二、样品处理二、样品处理（1 1）皂化：）皂化：称取适量样品（含VA30g,VE40g）于三角瓶中，加30mL无水乙醇，振摇使样品分散；加入5mL，100g/L抗坏血酸和2mL苯并e芘溶液（内标）混匀，加入10mL氢氧化钾(1:1)，混匀，于沸水浴上 回流30min，使皂化完全（若有混浊现象，表示皂化完全），皂化后立即放入冰水中冷却；第13页/共57页（2 2）
9、提取：）提取：将皂化液移入分液漏斗，先用50mL50mL水分2 2次洗涤皂化瓶（若有渣，可经过脱脂棉过滤），再用100mL100mL无水乙醚分2 2次洗涤皂化瓶及残渣，所有乙醚洗液并入分液漏斗中，振摇两分钟（注意放气），静止分层后，弃去水层；然后每次用100mL100mL水将乙醚液洗至中性，需洗4-54-5次。第14页/共57页（3 3）浓缩：）浓缩：将乙醚提取液经无水硫酸钠滤入150mL旋转蒸发瓶内，用约15mL 乙醚洗涤分液漏斗和无水硫酸钠2次，洗液并入蒸发瓶中，于55水浴中减压蒸馏并回收乙醚，待瓶中乙醚剩余约2mL时，取下蒸发瓶，用氮气吹干乙醚，随即加入2mL乙醇，充分混合、溶解提取物。
10、将乙醇移入塑料离心管中，于离心机上离心5min，上清液供色谱分析用。第15页/共57页三、所需主要仪器三、所需主要仪器 高效液相色谱（带紫外分光检测器）旋转蒸发器 高速离心机（带离心管）恒温水浴锅 紫外分光光度计说明：国标中用其来标定VA和VE的浓度 第16页/共57页四、液相色谱分析四、液相色谱分析色谱参考条件：色谱参考条件：预柱：预柱：ODS 10m（4mmx4.5cm)分析柱：分析柱：ODS 5m（4.6mmx25cm)流动相：甲醇：水流动相：甲醇：水98：2，混匀，临用前脱气；，混匀，临用前脱气；紫外检测器波长：紫外检测器波长：300nm，量程，量程0.02；进样量：进样量：20L;流
11、速：流速：1.651.70mL/min第17页/共57页测定（1）配制标准溶液VA标准溶液：将VA标准品用无水乙醇溶解配制成浓度为1mg/ml;VE标准溶液:用无水乙醇分别溶解-生育酚、-生育酚、-生育酚3种标准品，配制成浓度为1mg/ml的标准液；内标溶液：将苯并e芘用无水乙醇配制成浓度为10g/ml;（2）绘制标准曲线将一定量的VA标准溶液、3种VE标准溶液和内标溶液混和均匀，对其混和液进行色谱分析，以维生素峰面积和内标物峰面积之比为纵坐标，以维生素浓度为横坐标，绘制标准曲线（直线回归方程）。第18页/共57页（3 3）样品测定）样品测定取试样浓缩液20l注入色谱仪中，进行检测；定性：用标
12、准物色谱峰的保留时间定性；定量：根据色谱图求出某种维生素峰面积与内标物峰 面积的比值，以此比值由回归方程求出维生素含量；五、结果计算五、结果计算X：某种维生素的含量，mg/100g：由标准曲线上查到的某种维生素含量，g/mLV：样品浓缩后定容体积,mL m：样品质量，g第19页/共57页水溶性维生素的理化性质水溶性维生素的理化性质维生素维生素B B1 1的测定的测定维生素维生素B B2 2的测定的测定维生素维生素C C的测定的测定 三、水溶性维生素的测定第20页/共57页 易溶于水，不溶于大部分有机溶剂；易溶于水，不溶于大部分有机溶剂；在酸性介质中稳定，在碱性条件下不稳定；在酸性介质中稳定，在
13、碱性条件下不稳定；易受空气、光、热、酶、金属离子的影响。易受空气、光、热、酶、金属离子的影响。（一）水溶性维生素的主要理化性质（一）水溶性维生素的主要理化性质第21页/共57页（二）维生素（二）维生素B B1 1的测定的测定 VB VB1 1又叫硫胺素、抗神经炎素又叫硫胺素、抗神经炎素 1 1、食品中、食品中VBVB1 1的存在形式的存在形式 常以游离态存在；常以游离态存在；复合脂形式存在（磷蛋白）；复合脂形式存在（磷蛋白）；辅羧酶形式存在辅羧酶形式存在 VBVB1 1在酵母、米糠、麦胚、花生、黄豆以及绿色在酵母、米糠、麦胚、花生、黄豆以及绿色的蔬菜和牛乳、蛋黄中比较丰富，的蔬菜和牛乳、蛋黄中
14、比较丰富，动物组织不如植物动物组织不如植物含量丰富。含量丰富。第22页/共57页 VB1 1在中性、碱性下不稳定，易分解；VB1 1在酸性条件下稳定，即使加热酸性也稳定；VB1 1为白色结晶，微溶于C2 2H5 5OH，不溶于乙醚或CHCl3 3，易溶于水。2.VB2.VB1 1的性质第23页/共57页 3.3.维生素维生素B B1 1的测定方法的测定方法 紫外分光光度法:适用于VBVB1 1含量高的样品,灵敏度和准 确度较差;高效液相色谱法 适用于食品中微量VBVB1 1的测定 荧光法 世界各国都用荧光法测定;荧光法是我国国家标准分析方法（GB/T 5009.84-GB/T 5009.84-
15、20032003）第24页/共57页 原理：硫胺素硫胺素在碱性铁氰化钾溶液中，在碱性铁氰化钾溶液中，被氧化成被氧化成一种兰色荧光物质，即为一种兰色荧光物质，即为硫色素硫色素，在在紫外光紫外光下，下，硫色素发出荧光硫色素发出荧光，在一定条件下，其，在一定条件下，其荧光强度与硫色素浓度成正比荧光强度与硫色素浓度成正比，即与硫胺素含量成正比。，即与硫胺素含量成正比。第25页/共57页v（2）定量方法标准曲线法：标准曲线法：配配制制一一系系列列标标准准浓浓度度试试样样测测定定荧荧光光强强度度，绘绘制制标标准准曲曲线线，再再在在相相同同条条件件下下测测量量未未知知试试样样的的荧荧光光强强度，在标准曲线上
16、求出浓度。度，在标准曲线上求出浓度。第26页/共57页(3).操作步骤操作步骤 试样处理 样品匀浆（或粉碎）于低温冰箱中冷冻保存。提取 1)水解 2)酶解称样三角瓶三角瓶高压水解高压水解盐酸溶液盐酸溶液调调pHpH值值乙酸钠溶液乙酸钠溶液酶解酶解淀粉酶淀粉酶定容定容第27页/共57页 吸附剂采用的是人造浮石。将提取液加入人造浮石交换柱中，VB1VB1被吸附上去，吸附上去后，再用热水淋洗，洗去杂质，最后用 热 的 酸 性 氯 化 钾（25%KCl-25%KCl-HACHAC）把VB1VB1洗脱下来，这样就得到纯VB1VB1。样品样品热水热水酸性氯化钾酸性氯化钾收集酸性氯化钾定容收集酸性氯化钾定容
17、 净化第28页/共57页 氧化氧化 静置静置 过滤过滤 脱水脱水反应瓶编号反应瓶编号标准标准A A瓶瓶标准标准B B瓶瓶样品样品A A瓶瓶样品样品B B瓶瓶加标准液或加标准液或样品液样品液标准液标准液5ml5ml 标准液标准液5ml5ml 样品液样品液5ml5ml 样品液样品液5ml5ml加氢氧化钠加氢氧化钠3ml3ml3ml3ml加碱性铁氰加碱性铁氰化钾化钾3ml3ml3ml3ml加正丁醇加正丁醇10ml10ml10ml10ml10ml10ml10ml10ml第29页/共57页 荧光强度测定荧光强度测定(通过荧光分光光度计可以测得通过荧光分光光度计可以测得)激发波长365nm365nm；发射
18、波长435nm435nm；激发波狭缝5nm5nm；发射波狭缝5nm5nm。（4 4）方法说明 本方法适用于各类食物中硫胺素的测定，但本方法适用于各类食物中硫胺素的测定，但不适用于不适用于有有吸附吸附硫胺素能力的物质和含有影响硫色素荧光物质的样品硫胺素能力的物质和含有影响硫色素荧光物质的样品；酸解、水解的目的：酸解、水解的目的：使结合型的使结合型的VBVB1 1成为游离型的成为游离型的；紫外线会破坏硫色素，所以硫色素形成后，紫外线会破坏硫色素，所以硫色素形成后，反应瓶反应瓶要用要用黑布黑布遮盖或在暗室中进行荧光测定遮盖或在暗室中进行荧光测定，并且要，并且要迅速测定迅速测定；第30页/共57页 维
19、生素维生素B2又称核黄素又称核黄素测定方法主要有：测定方法主要有：微生物法、荧光法、微生物法、荧光法、HPLC法法 GB/T 5009.85-2003 荧光法（第一法）荧光法（第一法）微生物法（第二法）微生物法（第二法）（三）维生素（三）维生素B2的测的测定定第31页/共57页 荧光法测维生素荧光法测维生素B21.原理原理 核黄素在核黄素在440500nm波长光照射下发生黄绿色荧波长光照射下发生黄绿色荧光。在稀溶液中其荧光强度与核黄素的浓度成正比。在光。在稀溶液中其荧光强度与核黄素的浓度成正比。在波长波长525nm下测定其荧光强度。试液再下测定其荧光强度。试液再加入低亚硫酸钠加入低亚硫酸钠(N
20、a2S2O4)，将，将核黄素还原为无荧光的物质核黄素还原为无荧光的物质，然后再测，然后再测定试液中残余荧光杂质的荧光强度，两者之差即为食品定试液中残余荧光杂质的荧光强度，两者之差即为食品中核黄素所产生的荧光强度。中核黄素所产生的荧光强度。为使为使VB2游离出来，采用需经酸解和酶解游离出来，采用需经酸解和酶解 为消除干扰，试样通过氧化处理和柱层析处理。为消除干扰，试样通过氧化处理和柱层析处理。第32页/共57页2.测定步骤测定步骤（1）样品提取）样品提取称样三角瓶三角瓶高压水解高压水解盐酸溶液盐酸溶液调调pHpH值值氢氧化钠溶液氢氧化钠溶液酶解酶解淀粉酶淀粉酶定容定容蛋白酶蛋白酶第33页/共57
21、页（2）氧化去杂）氧化去杂样品提取液样品提取液具塞试管具塞试管水水双氧水双氧水冰乙酸冰乙酸高锰酸钾高锰酸钾氧化去杂氧化去杂褪色褪色标准液按相同方法进行标准液按相同方法进行第34页/共57页（3）柱层析）柱层析样品液样品液水水丙酮丙酮-乙酸乙酸-水混合液水混合液水水收集洗脱液收集洗脱液定容定容 *标准液按相标准液按相同操作进行同操作进行第35页/共57页（4）荧光测定）荧光测定激发光波长激发光波长440nm，发射光波长，发射光波长525nm，测量样品管及标准管的，测量样品管及标准管的荧光值荧光值。待样品及标准的荧光值测量后，在各管的剩余液中加待样品及标准的荧光值测量后，在各管的剩余液中加0.1m
22、L 20%低亚硫酸钠低亚硫酸钠溶液，溶液，立即混匀，在立即混匀，在20s内内测出各管的荧光值，作为各自的测出各管的荧光值，作为各自的空白值空白值。第36页/共57页3.3.计算计算X X：样品中核黄素含量，：样品中核黄素含量，mg/100gmg/100gA A：试样荧光值：试样荧光值B B：试样空白荧光值：试样空白荧光值C C：标准荧光值：标准荧光值D D：标准空白荧光值：标准空白荧光值m m：样品质量，：样品质量，g gm m1 1：标准管中核黄素含量：标准管中核黄素含量ggf f：稀释倍数：稀释倍数100/1000100/1000：样品核黄素含量的换算系数：样品核黄素含量的换算系数第37页
23、/共57页维生素维生素C C是一种已糖醛基酸，有抗坏血病的作用，所以被人们称做是一种已糖醛基酸，有抗坏血病的作用，所以被人们称做抗坏血酸抗坏血酸;广泛存在于广泛存在于植物组织中植物组织中，新鲜的水果、蔬菜新鲜的水果、蔬菜，特别，特别是枣、辣椒、苦瓜、柿子叶、猕猴桃、柑橘等食品是枣、辣椒、苦瓜、柿子叶、猕猴桃、柑橘等食品中含量较多。它是氧化还原酶之一，本身易被氧化，中含量较多。它是氧化还原酶之一，本身易被氧化，但在有些条件下但在有些条件下又是一种抗氧化剂又是一种抗氧化剂。（三）维生素（三）维生素C的测定的测定第38页/共57页维生素维生素C C具有较强的还原性，对光敏感，具有较强的还原性，对光敏
24、感，氧化后氧化后的产的产物称为物称为脱氢抗坏血酸脱氢抗坏血酸，仍然具有生理活性；进一步，仍然具有生理活性；进一步水水解解则生成则生成2 2，3-3-二酮古乐糖酸二酮古乐糖酸，失去生理作用。，失去生理作用。在食品中维生素在食品中维生素C C就是以就是以还原型、脱氢型和二酮古乐还原型、脱氢型和二酮古乐糖酸型糖酸型这这3 3种形式存在的；食品分析中的所谓种形式存在的；食品分析中的所谓总抗坏总抗坏血酸是指抗坏血酸和脱氢抗坏血酸二者的总量，血酸是指抗坏血酸和脱氢抗坏血酸二者的总量，不包不包括括2 2，3-3-二酮古乐糖酸和进一步氧化的产物。二酮古乐糖酸和进一步氧化的产物。第39页/共57页 维生素维生素
25、C C 的测定方法的测定方法测定维生素测定维生素C C 的方法有：的方法有：荧光法，高效液相色谱法，2，4 二硝基苯肼比色法，2 2，6 6 二氯靛酚滴定法二氯靛酚滴定法，等 GB/T 5009.862003 GB/T 5009.862003 蔬菜、水果及其制品中蔬菜、水果及其制品中总抗坏血总抗坏血酸酸含量测定方法含量测定方法 第一法：荧光法第一法：荧光法 第二法第二法：2 2，4 4二硝基苯肼比色法二硝基苯肼比色法第40页/共57页（1 1）原理：原理：试样中试样中还原型抗坏血酸还原型抗坏血酸经活性炭氧化为经活性炭氧化为脱氢抗坏血酸脱氢抗坏血酸后，与后，与邻苯二胺邻苯二胺反应生反应生成有荧光
26、的成有荧光的喹唔啉喹唔啉，其荧光强度与抗坏血酸的浓度在一定条件下成正比，以此测，其荧光强度与抗坏血酸的浓度在一定条件下成正比，以此测定食品中抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的总量。定食品中抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的总量。注意：脱氢抗坏血酸可与硼酸结合生成复合物，而不注意：脱氢抗坏血酸可与硼酸结合生成复合物，而不与邻苯二胺与邻苯二胺反应生成荧光物质，由此可以消除杂质的干反应生成荧光物质，由此可以消除杂质的干扰。（空白试验）扰。（空白试验）（第一法）荧光法（测总抗坏血酸）第41页/共57页（2 2）试剂：）试剂：）试剂：）试剂：偏磷酸偏磷酸冰醋酸溶液：称取冰醋酸溶液：称取15g偏磷酸，加入偏磷酸，加入40mL
27、冰醋冰醋酸，加水稀释至酸，加水稀释至500mL过滤后，贮存于冰箱中；过滤后，贮存于冰箱中；硫酸：硫酸：0.15mol/L偏磷酸偏磷酸乙酸乙酸硫酸溶液：称取硫酸溶液：称取15g偏磷酸，加入偏磷酸，加入40mL冰醋酸，用冰醋酸，用0.015molL-1硫酸稀释至硫酸稀释至500mL；乙酸钠溶液：称取乙酸钠溶液：称取500g乙酸钠溶解并稀释至乙酸钠溶解并稀释至1L；硼酸硼酸乙酸钠溶液：称取硼酸乙酸钠溶液：称取硼酸9g，加入，加入35mL乙酸钠溶液，乙酸钠溶液，用水稀释至用水稀释至1000mL；邻苯二胺溶液：称取邻苯二胺溶液：称取20mg邻苯二胺盐酸盐溶于邻苯二胺盐酸盐溶于100mL水水中；中；第42
28、页/共57页抗坏血酸标准溶液：准确称取抗坏血酸标准溶液：准确称取0.500g抗坏血酸溶于偏磷酸抗坏血酸溶于偏磷酸冰醋酸溶液中，定容至冰醋酸溶液中，定容至500mL容量瓶中，吸取上述溶液容量瓶中，吸取上述溶液5mL，再用偏磷酸再用偏磷酸冰醋酸溶液定容至冰醋酸溶液定容至50mL；抗坏血酸标准使用溶液：抗坏血酸标准使用溶液：100g/mL百里酚蓝指示剂百里酚蓝指示剂(麝香草酚蓝麝香草酚蓝)：变色范围：变色范围pH1.2(红红)2.8(黄黄)；活性炭：取活性炭：取50g活性炭加入活性炭加入250mL10%盐酸，加热至沸，减盐酸，加热至沸，减压过滤，用蒸馏水冲洗活性炭，检查滤液中无铁离子为止，于压过滤，
29、用蒸馏水冲洗活性炭，检查滤液中无铁离子为止，于110120烘干。烘干。（3 3）仪器：）仪器：）仪器：）仪器：荧光分光光度计荧光分光光度计或具有或具有350nm及及430nm 波长的波长的荧光计；捣碎机。荧光计；捣碎机。第43页/共57页（4 4）操作步骤：）操作步骤：试样的制备：试样的制备：称取称取100100克鲜样克鲜样,加加100mL100mL偏磷酸偏磷酸-乙酸溶乙酸溶液，倒入捣碎机内打成匀浆，先取少量样品加入液，倒入捣碎机内打成匀浆，先取少量样品加入1 1滴百里滴百里酚蓝，若显红色酚蓝，若显红色(pH=1.2)(pH=1.2)，即用偏磷酸，即用偏磷酸冰醋酸溶液定冰醋酸溶液定容至容至10
30、0mL100mL；若显黄色；若显黄色(pH=2.8)(pH=2.8)，即用偏磷酸，即用偏磷酸冰醋酸冰醋酸硫酸溶液定容至硫酸溶液定容至100mL100mL，定容后过滤备用。，定容后过滤备用。测定：测定：氧化处理：氧化处理：将上述滤液及抗坏血酸标准使用液各将上述滤液及抗坏血酸标准使用液各100ml转转入三角瓶中加入入三角瓶中加入12g活性炭振摇活性炭振摇12分钟，过滤。即试分钟，过滤。即试样氧化液和标准氧化液，待测定。样氧化液和标准氧化液，待测定。第44页/共57页各取各取10mL标准氧化液标准氧化液于于2个个100mL容量瓶中，分别标明容量瓶中，分别标明“标标准准”及及“标准空白标准空白”各取各
31、取10mL试样氧化液试样氧化液于于2个个100mL容量瓶中，分别标明容量瓶中，分别标明“试试样样”及及“试样空白试样空白”于于“标准空白标准空白”及及“试样空白试样空白”中各加中各加5mL硼酸硼酸-乙酸钠溶乙酸钠溶液，液，混合摇动混合摇动15min，用水稀释至，用水稀释至100mL，在，在4冰箱中放冰箱中放置置23小时，即得小时，即得“标准空白标准空白”溶液及溶液及“试样空白试样空白”溶液，溶液，备用。备用。于于“试样试样”及及“标准标准”中各加中各加5mL/L乙酸钠溶液，用水稀乙酸钠溶液，用水稀释至释至100mL,即得即得“试样试样”溶液及溶液及“标准标准”溶液，备用。溶液，备用。第45页/
32、共57页标准曲线的制备：标准曲线的制备：取上述取上述“标准标准”溶液（抗坏血酸含量溶液（抗坏血酸含量10g/mL）0.5、1.0、1.5和和2.0mL标准系列，取双份分别置于标准系列，取双份分别置于10mL带盖试管中，带盖试管中，再用水补充至再用水补充至2.0mL。（平行。（平行2次，做标准曲线）次，做标准曲线）取中取中“标准空白标准空白”溶液，溶液，“样品空白样品空白”溶液及溶液及“样品样品”溶溶液各液各2mL，分别置于，分别置于10mL带盖试管中。在暗室中迅速向各试带盖试管中。在暗室中迅速向各试管中加入管中加入5mL邻苯二胺溶液，振摇混合，在室温下反应邻苯二胺溶液，振摇混合，在室温下反应3
33、5min，于激发光波长，于激发光波长338nm、发射光波长、发射光波长420nm处测定荧光强度。处测定荧光强度。标准系列荧光强度分别减去标准空白荧光强度为纵坐标，对应标准系列荧光强度分别减去标准空白荧光强度为纵坐标，对应的抗坏血酸含量为横坐标，绘制标准曲线或进行相关计算，其的抗坏血酸含量为横坐标，绘制标准曲线或进行相关计算，其直线回归方程供计算时使用。直线回归方程供计算时使用。第46页/共57页（5）结果计算：）结果计算：式中式中 X-试样中抗坏血酸及脱氢抗坏血酸总含量，试样中抗坏血酸及脱氢抗坏血酸总含量，mg/100g；c-由标准曲线查得或由回归方程算得试样溶液浓度，由标准曲线查得或由回归方
34、程算得试样溶液浓度，g/mL m-试样的质量，试样的质量，g；V-荧光反应所用试样体积，荧光反应所用试样体积，mL；F-试样溶液的稀释倍数。试样溶液的稀释倍数。第47页/共57页（第二法）（第二法）2 2，4 4二硝基苯肼比色法二硝基苯肼比色法1.1.原理原理 先将样品中的还原型抗坏血酸用活性炭氧化为脱氢抗坏血酸，加2，4二硝基苯肼生成红色脎，根据脎在硫酸溶液中的含量与总抗坏血酸含量成正比进行比色测定。第48页/共57页2.2.试剂试剂提取Vc用：20g/L草酸，10 g/L草酸氧化处理用：活性炭（经HCl处理无铁离子）控制氧化用：20g/L硫脲、10g/L硫脲显色用：20g/L2，4二硝基苯
35、肼溶液，硫酸1mg/mL抗坏血酸标准溶液3.3.主要仪器主要仪器恒温箱或恒温水浴锅紫外可见分光光度计组织捣碎机第49页/共57页4.4.操作步骤操作步骤样品中Vc的提取和处理提取（样品制备）干样：干样：样品（1-4g）+适量10 g/L草酸，磨成匀浆，用10 g/L草酸定容至100mL容量瓶。过滤，得提取液。鲜样：鲜样：样品+等量的20 g/L草酸，捣碎成匀浆，取1040g匀浆，用10 g/L草酸定容至100mL容量瓶。过滤，得提取液。注意：不易过滤的样品，可离心沉淀后取上清液再过滤。第50页/共57页氧化处理氧化处理取25mL提取液+2g活性炭，振摇1min，过滤。要弃去初滤液；取10mL氧
36、化提取液+10mL20g/L硫脲；此20mL氧化稀释液为待测液，相当于把提取液稀释了2倍。第51页/共57页（2）呈色反应）呈色反应 取3支带塞试管，各加入4mL氧化稀释液，留一支空白，另两支各加1.0mL20g/L2，4二硝基苯肼溶液，37恒温3h。取出，空白管在室温下冷却，另两支放入冰水中冷却。空白管冷却至室温后加1.0mL20g/L 2，4二硝基苯肼溶液，15min后放入冰水中冷却。在冷却中，分别向每支试管滴加5ml（9+1）硫酸，滴加完毕取出，在室温放置30min后，用1cm比色皿，以空白管调零，500nm测吸光度。第52页/共57页（3）制标准曲线）制标准曲线取50mL 1mg/mL
37、抗坏血酸标准溶液，加2g 活性炭，振摇1min，过滤，弃去初滤液，取10mL滤液，加5.0g硫脲，用10 g/L草酸稀释至500mL容量瓶中，得20ug/mL的抗坏血酸使用液；分别取5、10、20、25、40、50、60mL 20ug/mL的抗坏血酸使用液,分别放入7个容量瓶中，用10 g/L硫脲稀释定容，得标准比色系列为：1、2、4、5、8、10、12ug/mL；按（2）步骤呈色，并测定吸光度；以吸光度为纵坐标，以抗坏血酸标准比色系列为横坐标，绘标准曲线。第53页/共57页（4）计算）计算 从标准曲线查出氧化稀释液的维生素C的浓度，g/mL 按下式计算总抗坏血酸含量：X:样品中抗坏血酸含量，
38、mg/100g P:由标准曲线得“样品氧化液”中总抗坏血酸的浓度，g/mL V:试样用1草酸溶液定容的体积，mL;f:样品氧化处理过程中的稀释倍数 m:称取的样品质量，g第54页/共57页 1 1、原理、原理 在中性或弱酸性条件下，还原型抗坏血酸还原型抗坏血酸可以可以还原染料还原染料2 2，6-6-二氯靛酚二氯靛酚,该染该染料在酸性溶液中呈红色料在酸性溶液中呈红色(在中性或碱性溶液中呈蓝色在中性或碱性溶液中呈蓝色)，被还原后颜色消失被还原后颜色消失;还原型抗还原型抗坏血酸坏血酸本身被本身被氧化成脱氢抗坏血酸氧化成脱氢抗坏血酸。在没有杂质干扰时，样品中抗坏血酸的含量与消耗的染料量成正比。在没有杂质干扰时，样品中抗坏血酸的含量与消耗的染料量成正比。2 2，66二氯靛酚滴定法二氯靛酚滴定法（测定还原型抗坏血（测定还原型抗坏血酸）酸）第55页/共57页2 2、方法说明、方法说明滴定前，滴定前，2 2，6-6-二氯靛酚溶液二氯靛酚溶液需要用已知浓度的需要用已知浓度的标准抗坏血酸溶液标定标准抗坏血酸溶液标定，得到，得到2 2，6-6-二氯靛酚溶液的准确浓二氯靛酚溶液的准确浓度；度；需要做空白试验。需要做空白试验。第56页/共57页感谢您的观看！第57页/共57页