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1、吸光光度法吸光光度法 食品伙伴网食品伙伴网2023/4/7Analytical chemistry1第1页，共41页，编辑于2022年，星期五2023/4/7Analytical chemistry2教学指导：教学指导：v吸光光度法简介吸光光度法简介v吸光光度法基本原理吸光光度法基本原理v可见分光光度法及其仪器可见分光光度法及其仪器v吸光光度法应用吸光光度法应用第2页，共41页，编辑于2022年，星期五2023/4/7Analytical chemistry3吸光光度法（吸光光度法（Absorption Photometry）：基于物质）：基于物质对光的选择性而建立的分析方法。对光的选择性而建
2、立的分析方法。包括比色法、紫外可见分光光度法、红外分光包括比色法、紫外可见分光光度法、红外分光光度法。光度法。广泛用于无机物和有机物的定性和定量分析。广泛用于无机物和有机物的定性和定量分析。目视比色法目视比色法光电比色光电比色第一节第一节 吸光光度法简介吸光光度法简介第3页，共41页，编辑于2022年，星期五2023/4/7Analytical chemistry4分光光度法特点：分光光度法特点：灵敏度高：试样中灵敏度高：试样中1%-0.001%微量成分微量成分准确度较高：相对误差准确度较高：相对误差2%-5%（1%-2%）。）。；几乎所有的无机离子有许多有机化合物；几乎所有的无机离子有许多有
3、机化合物；操作简便、快速、仪器价格适中、用途广。操作简便、快速、仪器价格适中、用途广。第4页，共41页，编辑于2022年，星期五2023/4/7Analytical chemistry5第一节第一节 吸光光度法简介吸光光度法简介一、光的基本性质一、光的基本性质1、光的波粒二象性、光的波粒二象性波动性：光以波的形式传播，可用波长、频率来波动性：光以波的形式传播，可用波长、频率来表示。表示。波长波长 ：两个相邻波峰或波谷间的距离（两个相邻波峰或波谷间的距离（nm）频率频率 ：单位时间里通过一固定点处波的数目单位时间里通过一固定点处波的数目（s-1）=c/光速光速c=31010 cm/s第5页，共4
4、1页，编辑于2022年，星期五2023/4/7Analytical chemistry6第一节第一节 吸光光度法简介吸光光度法简介粒子性：光由光子组成，具有能量。粒子性：光由光子组成，具有能量。E=h=hc/h为普朗克常数为普朗克常数 6.6310-34J.s第6页，共41页，编辑于2022年，星期五2023/4/7Analytical chemistry72 2、光谱分区、光谱分区能能 量量 小小200nm400nm780nm 大大波波 长长光谱区域光谱区域紫外光区紫外光区可见光区可见光区红外红外分析方法分析方法紫外分光光度法紫外分光光度法可见分光光度法可见分光光度法50um红外分光光度法红
5、外分光光度法紫、蓝、青、绿、黄、橙、红紫、蓝、青、绿、黄、橙、红第7页，共41页，编辑于2022年，星期五2023/4/7Analytical chemistry8二、物质对光的吸收二、物质对光的吸收1 1、物质对光选择性吸收的实质、物质对光选择性吸收的实质一束光通过某物质时该物质的分子、原子或离子与光子一束光通过某物质时该物质的分子、原子或离子与光子发生发生碰撞碰撞，光子的，光子的能量转移能量转移至分子、原子或离子上，使至分子、原子或离子上，使这些粒子发生这些粒子发生能级能级变化，由基态变化，由基态跃迁跃迁至较高能态，这个过至较高能态，这个过程即为程即为吸收。吸收。光是否被物质吸收，取决于光
6、是否被物质吸收，取决于光子的能量光子的能量物质的结构物质的结构只有当能级差只有当能级差E E 与光子能量与光子能量h h 相当时物质吸收光。相当时物质吸收光。第8页，共41页，编辑于2022年，星期五2023/4/7Analytical chemistry92 2、物质的颜色与光吸收的关系、物质的颜色与光吸收的关系复合光与单色光复合光与单色光单色光：具有单一波长的光。单色光：具有单一波长的光。复合光：由不同波长的单色光按一定比例组成的光复合光：由不同波长的单色光按一定比例组成的光 如白光。如白光。第9页，共41页，编辑于2022年，星期五2023/4/7Analytical chemistry
7、10溶液颜色与光吸收的关系溶液颜色与光吸收的关系溶液对光的吸收：若溶液透明、均匀，人眼看到溶液对光的吸收：若溶液透明、均匀，人眼看到的溶液颜色是由透射光的波长决定的。当入色光的溶液颜色是由透射光的波长决定的。当入色光为白光（复合光），溶液吸收的光与透射的光互为白光（复合光），溶液吸收的光与透射的光互补。补。互补色互补色：组成白光的两种光。：组成白光的两种光。光的互补：蓝光的互补：蓝 黄黄第10页，共41页，编辑于2022年，星期五2023/4/7Analytical chemistry11互互 补补 色色 示示 意意 图图 蓝蓝450-480 紫紫400-450 红红650-750青蓝青蓝48
8、0-490 青青490-500 绿绿500-580 黄黄580-600 橙橙600-650白光第11页，共41页，编辑于2022年，星期五2023/4/7Analytical chemistry12溶液对光的作用示意图溶液对光的作用示意图第12页，共41页，编辑于2022年，星期五2023/4/7Analytical chemistry13溶液颜色与吸收光颜色和波段的关系溶液颜色与吸收光颜色和波段的关系溶液的颜色溶液的颜色 吸吸 收收 光光颜颜 色色波波 段（段（nm）黄绿黄绿黄黄橙橙红红紫红紫红紫紫蓝蓝青蓝青蓝青青紫紫蓝蓝青蓝青蓝青青绿绿黄绿黄绿黄黄橙橙红红40045045048048049
9、0490500500560560580580600600650650760第13页，共41页，编辑于2022年，星期五2023/4/7Analytical chemistry14721型分光光度计型分光光度计第14页，共41页，编辑于2022年，星期五2023/4/7Analytical chemistry153 3、吸收曲线（吸收光谱）、吸收曲线（吸收光谱）吸收曲线：吸光度随波长变化的曲线。吸收曲线：吸光度随波长变化的曲线。吸收曲线的特点：吸收曲线的特点：不同的物质因其分析结构不同而具有不同的吸收不同的物质因其分析结构不同而具有不同的吸收曲线；曲线；同一物质，浓度不同，其吸收曲线的形状和同一
10、物质，浓度不同，其吸收曲线的形状和max的的位置不变，但在同一波长下吸光度随浓度的增大而增位置不变，但在同一波长下吸光度随浓度的增大而增大。大。吸收曲线是吸光度法选择测量波长的依据。吸收曲线是吸光度法选择测量波长的依据。第15页，共41页，编辑于2022年，星期五2023/4/7Analytical chemistry16吸光度 A吸吸 收收 曲曲 线线 图图4005006000.1000.2000.3000.400第16页，共41页，编辑于2022年，星期五2023/4/7Analytical chemistry17第17页，共41页，编辑于2022年，星期五2023/4/7Analytic
11、al chemistry18 1.1.朗伯朗伯 比耳定律比耳定律 布格布格(Bouguer)(Bouguer)和朗伯和朗伯(Lambert)(Lambert)先后于先后于17291729年和年和17601760年阐明了光的吸收程度和吸收层厚度的关系。年阐明了光的吸收程度和吸收层厚度的关系。A Ab b 18521852年比耳年比耳(Beer)(Beer)又提出了光的吸收程度和吸收物又提出了光的吸收程度和吸收物浓度之间也具有类似的关系。浓度之间也具有类似的关系。A A c c 二者的结合称为朗伯二者的结合称为朗伯 比耳定律。比耳定律。第二节第二节 吸光光度法基本原理吸光光度法基本原理第18页，共
12、41页，编辑于2022年，星期五2023/4/7Analytical chemistry19朗伯朗伯比耳定律比耳定律 吸光度吸光度A：表征物质对光吸收程度的量。表征物质对光吸收程度的量。A=lgIi/I0=-lgT=bcA-吸光度吸光度-摩尔吸光系数摩尔吸光系数C-被测物浓度被测物浓度Ii-入射光强入射光强 T-透过率透过率 b-液层厚度（光程长度）液层厚度（光程长度）I0-透射光强透射光强第19页，共41页，编辑于2022年，星期五2023/4/7Analytical chemistry20例例：用用1,10-二二氮氮菲菲光光度度法法测测定定铁铁，已已知知Fe2+浓浓度度为为0.5mg/L，
13、比比色色皿皿厚厚度度2厘厘米米，在在=508nm测测得得配配合合物物吸吸光度光度A=0.19，求，求 。（1.1104L.mol-1.cm-1）第20页，共41页，编辑于2022年，星期五2023/4/7Analytical chemistry21朗伯朗伯比耳定律适用条件：比耳定律适用条件：入射光为平行单色光，且垂直照射；入射光为平行单色光，且垂直照射；吸光物质为均匀非散射体系；吸光物质为均匀非散射体系；吸光质点之间无相互作用；吸光质点之间无相互作用；辐射与物质之间的作用仅限于光吸收过程，无荧光和辐射与物质之间的作用仅限于光吸收过程，无荧光和光化学现象；光化学现象；吸光度具有加和性吸光度具有加
14、和性（A总总=A1+A2+）。）。第21页，共41页，编辑于2022年，星期五2023/4/7Analytical chemistry222 2、标准（工作）曲线、标准（工作）曲线 标标准准（工工作作）曲曲线线绘绘制制方方法法：在在、b固固定定的的情情况况下下，测测定定一一系系列列不不同同浓浓度度的的标标准准溶溶液液的的吸吸光光度度，作作Ac图图，在在相相同同条条件件下下测测定定样样品品溶溶液液的的吸吸光光度度，从从曲曲线线上上可可查查出被测样品的浓度。出被测样品的浓度。第22页，共41页，编辑于2022年，星期五2023/4/7Analytical chemistry23工作曲线图工作曲线图
15、浓度（浓度（c c）吸吸光光度度第23页，共41页，编辑于2022年，星期五2023/4/7Analytical chemistry24浓度浓度 c c 正偏离正偏离负偏离负偏离吸吸光光度度工作偏离图工作偏离图第24页，共41页，编辑于2022年，星期五2023/4/7Analytical chemistry25偏离原因：偏离原因：非单色光引起的偏离：非单色光引起的偏离：LB定律要求入射光为单色定律要求入射光为单色光，但目前仪器提供的入射光是由波长范围较窄的光，但目前仪器提供的入射光是由波长范围较窄的光带组成的复合光。光带组成的复合光。非平行入射光引起的偏离非平行入射光引起的偏离介质不均匀引起
16、的偏离介质不均匀引起的偏离化学因素引起的偏离：化学因素引起的偏离：高浓度时引起溶液中吸光粒子之间高浓度时引起溶液中吸光粒子之间相互作用上升，使吸光能力发生变化；化学反应引起的偏相互作用上升，使吸光能力发生变化；化学反应引起的偏离。离。第25页，共41页，编辑于2022年，星期五2023/4/7Analytical chemistry26第三节第三节 可见分光光度计可见分光光度计 一、可见光分光光度法一、仪器结构框图一、仪器结构框图第26页，共41页，编辑于2022年，星期五2023/4/7Analytical chemistry271 1、光源、光源基本要求：基本要求：在仪器工作的波长范围内，
17、提供连续、有足够发射在仪器工作的波长范围内，提供连续、有足够发射强度和良好稳定性的复合光，而且发射光的强度随强度和良好稳定性的复合光，而且发射光的强度随波长的变化应尽可能小。波长的变化应尽可能小。常用光源：钨丝灯和卤钨灯，可使用的波长范围常用光源：钨丝灯和卤钨灯，可使用的波长范围在在360 2500nm。第27页，共41页，编辑于2022年，星期五2023/4/7Analytical chemistry282 2、单色器、单色器单色器作用：单色器作用：从光源发出的复合光中分出所需要的从光源发出的复合光中分出所需要的单色光。单色光。单色器组成：单色器组成：由入射狭缝、准光器（透镜或凹面由入射狭缝
18、、准光器（透镜或凹面反射镜使入射光成平行光）、色散元件、聚焦反射镜使入射光成平行光）、色散元件、聚焦元件和出射狭缝等组成。元件和出射狭缝等组成。单色器的核心部分是色散元件（如玻璃棱镜和光栅）单色器的核心部分是色散元件（如玻璃棱镜和光栅），起分光的作用。，起分光的作用。第28页，共41页，编辑于2022年，星期五2023/4/7Analytical chemistry29 吸收池用于盛放分析试样；吸收池用于盛放分析试样；可见光区只能用玻璃吸收池；可见光区只能用玻璃吸收池；吸收池的光学面必须完全垂直于光束方向；吸收池的光学面必须完全垂直于光束方向；吸吸收收池池要要配配对对。因因为为吸吸收收池池材材
19、料料本本身身吸吸光光特特征征以以及及吸收池的光程长度的精度等对分析结果都有影响。吸收池的光程长度的精度等对分析结果都有影响。3 3、吸收池、吸收池第29页，共41页，编辑于2022年，星期五2023/4/7Analytical chemistry30 检检测测器器的的功功能能：检检测测信信号号、测测量量单单色色光光透透过过溶溶液液后光强度变化。后光强度变化。常用的检测器有光电池、光电管和光电倍增管等。常用的检测器有光电池、光电管和光电倍增管等。4 4、检测器、检测器第30页，共41页，编辑于2022年，星期五2023/4/7Analytical chemistry31型号型号 价格（万元）价格
20、（万元）波长，波长，nm分光器件分光器件数据处理数据处理指示指示产地产地7210.18360800棱镜棱镜表头表头上海三分上海三分7220.28330800光栅光栅微机微机数显数显上海三分上海三分760CRT7.21190900光栅光栅PC打印扫描打印扫描显象管显象管上海三分上海三分751G0.912001000棱镜棱镜微机打印微机打印表头表头上海分析上海分析GDZ12.3200800全息凹面光栅全息凹面光栅微机微机数显数显北京地质北京地质WFZ-122-10.7340600光栅光栅微机微机数显数显北京地质北京地质WFJ-80-10.3360800棱镜棱镜PC打印扫描打印扫描数显数显北京二分北
21、京二分国产常用紫外可见分光光度计国产常用紫外可见分光光度计第31页，共41页，编辑于2022年，星期五2023/4/7Analytical chemistry32721 型分光光度计型分光光度计第32页，共41页，编辑于2022年，星期五2023/4/7Analytical chemistry33722型分光光度计型分光光度计第33页，共41页，编辑于2022年，星期五2023/4/7Analytical chemistry34第34页，共41页，编辑于2022年，星期五2023/4/7Analytical chemistry35分光光度计的使用分光光度计的使用 预热预热20min。调节调节T
22、=0。调节调节T=100%（A=0）。）。测定样品的吸光度测定样品的吸光度A。第35页，共41页，编辑于2022年，星期五2023/4/7Analytical chemistry36分光光度计的保养与维护分光光度计的保养与维护安置在干燥、无污染的地方；安置在干燥、无污染的地方；仪器内的防潮硅胶应定期更换或再生；仪器内的防潮硅胶应定期更换或再生；仪器停止工作时，必须切断电源，应按开关机仪器停止工作时，必须切断电源，应按开关机顺序关闭主机和稳流稳压电源开关；顺序关闭主机和稳流稳压电源开关；比色皿使用完毕后，立即用蒸馏水或有机溶剂冲洗干比色皿使用完毕后，立即用蒸馏水或有机溶剂冲洗干净，并用柔软情节的
23、纱布把水渍擦净；净，并用柔软情节的纱布把水渍擦净；仪器经过搬动，请及时检查并纠正波长精度。仪器经过搬动，请及时检查并纠正波长精度。第36页，共41页，编辑于2022年，星期五2023/4/7Analytical chemistry37第四节第四节 吸光光度法应用吸光光度法应用吸光光度法主要应用于微量和痕量组分的测定，吸光光度法主要应用于微量和痕量组分的测定，有时也用于某些高含量物质的分析。近年来用有时也用于某些高含量物质的分析。近年来用于多组分物质的分析、配合物的组成和稳定常于多组分物质的分析、配合物的组成和稳定常数的测定等。数的测定等。第37页，共41页，编辑于2022年，星期五2023/4
24、/7Analytical chemistry381 1 邻二氮菲法测定微量铁邻二氮菲法测定微量铁 (邻二氮菲法主要用于测定铁邻二氮菲法主要用于测定铁)试样经溶解、分离干扰物质后，在试液中加入试样经溶解、分离干扰物质后，在试液中加入盐酸羟胺将铁全部还原为盐酸羟胺将铁全部还原为Fe2+，加入邻二氮菲显，加入邻二氮菲显色剂，并加入色剂，并加入HAc-NaAc缓冲溶液，缓冲溶液，pH约为约为4.05.0，显色，显色35 min后，以试剂空白为参比溶液，于后，以试剂空白为参比溶液，于510 nm波长处测定波长处测定A值，在工作曲线上查得其含量，值，在工作曲线上查得其含量，即可求得测定结果。即可求得测定结
25、果。第38页，共41页，编辑于2022年，星期五2023/4/7Analytical chemistry392 2 钢铁中锰的分析钢铁中锰的分析锰是钢铁中有益元素，在炼钢中是良好的脱氧锰是钢铁中有益元素，在炼钢中是良好的脱氧剂和脱硫剂。它以金属固熔体剂和脱硫剂。它以金属固熔体MnS状态存在。试状态存在。试样用样用HNO3溶解，用溶解，用H3PO4与与Fe3+配合成无色的配合成无色的Fe(HPO4)2-，在催化剂，在催化剂AgNO3作用下，以作用下，以(NH4)2S2O8为氧化剂，加热煮沸使为氧化剂，加热煮沸使Mn2+，氧化为紫红氧化为紫红色的色的MnO4-，于，于530 nm波长下测定吸光度，
26、在工作波长下测定吸光度，在工作曲线上查得含量，即可计算锰的含量。曲线上查得含量，即可计算锰的含量。第39页，共41页，编辑于2022年，星期五2023/4/7Analytical chemistry403 3 二苯碳酰二肼法测定铬二苯碳酰二肼法测定铬 铬铬()在环境分析中很重要，六价铬对人体是有在环境分析中很重要，六价铬对人体是有害元素。地表水、地下水或工业废水中常要求测害元素。地表水、地下水或工业废水中常要求测定其含量。方法是在弱酸性介质中，定其含量。方法是在弱酸性介质中，Cr()与二与二苯碳酰二肼形成紫红色水溶性化合物，于苯碳酰二肼形成紫红色水溶性化合物，于540 nm波长处测定吸光度，在
27、工作曲线上查得相应的波长处测定吸光度，在工作曲线上查得相应的浓度，计算铬的含量。浓度，计算铬的含量。第40页，共41页，编辑于2022年，星期五2023/4/7Analytical chemistry414.4.邻苯二酚紫邻苯二酚紫-溴化三甲基十六烷基溴化三甲基十六烷基铵铵-Sn()-Sn()三元胶束增溶光度法三元胶束增溶光度法利用邻苯二酚紫利用邻苯二酚紫(PV)和溴化三甲基十六烷基铵和溴化三甲基十六烷基铵(CTMAB)与与Sn()形成三元配合物体系，作为测定形成三元配合物体系，作为测定微量微量Sn的方法，于的方法，于660 nm波长处测定吸光度。主要波长处测定吸光度。主要干扰元素有干扰元素有Mo()、W()、Sb()等。如果等。如果Sb共共存量存量0.2 mg则不干扰。本方法适合测定铝合金中则不干扰。本方法适合测定铝合金中的微量的微量Sn，因为合金中，因为合金中Mo、W量很少，不影响量很少，不影响Sn的测定。的测定。第41页，共41页，编辑于2022年，星期五