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1、抗原抗体反应的应用第1页，此课件共57页哦一、免疫沉淀与免疫凝集1.溶液中的环状沉淀试验溶液中的环状沉淀试验n在在体体外外可可溶溶性性抗抗原原与与相相应应抗抗体体形形成成肉肉眼眼看见的沉淀物。看见的沉淀物。n在在液液相相中中形形成成的的沉沉淀淀不不容容易易观观察察判判断断，利利用用抗抗原原和和抗抗体体溶溶液液之之间间的的界界面面形形成成的的沉淀线便于观察。沉淀线便于观察。第2页，此课件共57页哦对照 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160抗血清稀释度抗原沉淀线抗血清环状沉淀实验示意图环状沉淀实验示意图第3页，此课件共57页哦2.凝胶扩散沉淀 n抗抗原原抗抗体体在在半半透透明明的的半
2、半固固相相介介质质中中进进行行沉沉淀淀实实验验。抗抗原原分分子子与与抗抗体体分分子子在在凝凝胶胶介介质质中中自自由由扩扩散散，相相遇遇形成沉淀。形成沉淀。n以琼脂扩散实验较为常用。以琼脂扩散实验较为常用。1)单单向向免免疫疫扩扩散散：抗抗体体混混于于琼琼脂脂中中，小小孔孔中中加加入入抗抗原原，抗抗原原向向周周围围均均匀匀扩扩散散，与与抗抗体体形形成成沉沉淀淀环环。可可用用于于定量测定免疫球蛋白和补体的含量等。定量测定免疫球蛋白和补体的含量等。2)双双向向免免疫疫扩扩散散：抗抗原原和和抗抗体体向向周周围围扩扩散散后后可可在在两两孔孔之之间间形形成成白白色色沉沉淀淀线线，可可用用于于抗抗原原或或抗
3、抗体体的的定定性性检检测。测。n缺点：时间长，灵敏度低缺点：时间长，灵敏度低。第4页，此课件共57页哦单向免疫扩散：常用于测定单向免疫扩散：常用于测定IgGIgG、IgMIgM、IgAIgA、C3C3、C4C4等。等。抗体混于琼脂凝抗体混于琼脂凝胶中制板胶中制板沉淀环沉淀环沉淀环沉淀环环的直径与抗原含环的直径与抗原含量成正相关量成正相关第5页，此课件共57页哦n双向免疫扩散双向免疫扩散沉淀线形状的变化显示抗原间是否存在共沉淀线形状的变化显示抗原间是否存在共同的抗原决定簇同的抗原决定簇。AbAg1，3AbAb第6页，此课件共57页哦3.电泳条件下的沉淀反应1)血血清清免免疫疫电电泳泳：患患者者血
4、血清清和和正正常常人人血血清清分分别别放放在在凝凝胶胶上上近近负负极极端端的的小小孔孔中中进进行行电电泳泳分分离离后后，在在两两种种抗抗原原之之间间沿沿电电泳泳方方向向挖挖一一平平行行的的小小槽槽，加加入入抗抗血血清清进进行双扩散。行双扩散。2)火火箭箭电电泳泳：单单向向免免疫疫扩扩散散与与电电泳泳结结合合的的一一种种方方法法。在在电电场场作作用用下下抗抗原原向向正正极极扩扩散散，与与抗抗体体形形成成沉沉淀淀峰峰（火火箭箭型型沉沉淀淀线线）。需需时时短短，能能检检测测微量抗原。微量抗原。3)对对流流电电泳泳(电电渗渗析析)：在在电电场场作作用用下下抗抗原原与与抗抗体体相相对对扩扩散散，形形成成
5、沉沉淀淀线线。对对流流电电泳泳较较双双扩扩快快速速和灵敏。和灵敏。第7页，此课件共57页哦第8页，此课件共57页哦第9页，此课件共57页哦第10页，此课件共57页哦4.免疫共沉淀免疫共沉淀 在溶液中两种或两种以上蛋白质相互作在溶液中两种或两种以上蛋白质相互作用，可以通过免疫共沉淀惊醒鉴定和分离。用，可以通过免疫共沉淀惊醒鉴定和分离。蛋白质相互作用通过非共价结合，用针对其蛋白质相互作用通过非共价结合，用针对其中一种蛋白质的特异性抗体进行的免疫沉淀，与中一种蛋白质的特异性抗体进行的免疫沉淀，与该蛋白相互作用的其他蛋白也同时被沉淀下来。该蛋白相互作用的其他蛋白也同时被沉淀下来。如果第一抗体结合后再加
6、入第二抗体或如果第一抗体结合后再加入第二抗体或A A蛋白蛋白可使抗原抗体形成更大的复合物易于沉淀，也可可使抗原抗体形成更大的复合物易于沉淀，也可通过加入聚乙二醇破坏水化膜加速沉淀形成。通过加入聚乙二醇破坏水化膜加速沉淀形成。第11页，此课件共57页哦免疫共沉淀原理图解免疫共沉淀原理图解第12页，此课件共57页哦5.免疫凝集n 大颗粒性抗原如细胞或细菌等与相应的抗体结合大颗粒性抗原如细胞或细菌等与相应的抗体结合后能使康媛颗粒发生凝集，形成肉眼易见的凝集小后能使康媛颗粒发生凝集，形成肉眼易见的凝集小块，即为免疫凝集。块，即为免疫凝集。n 凝集反应的发生分为两个阶段：凝集反应的发生分为两个阶段：1
7、1、抗原抗体的、抗原抗体的特异性结合阶段；特异性结合阶段；2 2、出现肉眼可见的凝集现象。、出现肉眼可见的凝集现象。第13页，此课件共57页哦n 最常见的免疫凝集反应是红细胞凝集，即血凝反最常见的免疫凝集反应是红细胞凝集，即血凝反应。应。n 血凝反应的抗体识别的抗原可以是红细胞表面血凝反应的抗体识别的抗原可以是红细胞表面的天然抗原，如血凝鉴定试验；也可以通过交联将的天然抗原，如血凝鉴定试验；也可以通过交联将红细胞连接上其他抗原，如早期的红细胞连接上其他抗原，如早期的HBsAgHBsAg血凝试验。血凝试验。第14页，此课件共57页哦n细菌的血凝试验常用来细菌的血凝试验常用来 对细菌进行鉴定与分型
8、，如对细菌进行鉴定与分型，如沙门菌鞭毛抗原的分析等。沙门菌鞭毛抗原的分析等。n免疫凝集试验虽然简便，但是受反应灵敏度的限制，免疫凝集试验虽然简便，但是受反应灵敏度的限制，在实际应用越来越少。在实际应用越来越少。第15页，此课件共57页哦二、免疫标记n免免疫疫标标记记技技术术：将将已已知知抗抗体体或或抗抗原原标标记记上上易易显显示示的的物物质质（示示踪踪物物），通通过过检检测测标标记记物物反反映映有有无无抗抗原原抗抗体反应，从而间接测出微量的抗原或抗体。体反应，从而间接测出微量的抗原或抗体。n目前有四种方法：目前有四种方法：1.放放射射免免疫疫分分析析法法：以以同同位位素素为为示示踪踪物物，为为
9、最最灵灵敏敏、可靠的免疫标记技术。可靠的免疫标记技术。2.酶联免疫吸附试验（酶联免疫吸附试验（ELISA）3.荧光与发光免疫分析荧光与发光免疫分析4.亲和标记的免疫分析亲和标记的免疫分析第16页，此课件共57页哦标记免疫技术=抗原抗体反应抗原抗体反应示踪物标记示踪物标记灵敏性灵敏性特异性特异性标记免疫技术的主要特点：高特异性、高灵敏性免疫技术+标记技术第17页，此课件共57页哦1.放射免疫分析法n标记同位素：标记同位素：125I，131I、3H和和35Sn检测方法：检测方法：液相体系用液体闪烁仪计数；液相体系用液体闪烁仪计数；固相体系用固相体系用X射线胶片显影。射线胶片显影。第18页，此课件共
10、57页哦直接法与竞争法检测检测检测检测第19页，此课件共57页哦竞争法基本原理 采用定量的标记抗原（Ag）和非标记抗原（Ag）竞争性结合有限量特异性抗体（Ab）的反应。第20页，此课件共57页哦第21页，此课件共57页哦放射性同位素标记分析法示意图放射性同位素标记分析法示意图第22页，此课件共57页哦第23页，此课件共57页哦2.酶联免疫吸附试验（ELISA）(enzyme linked immunosorbent assay)(1)定义：抗原与抗体吸附在固相表面，如聚苯乙烯微量板，抗原与抗体反应后，将固相与液相分离除去游离的抗原或抗体，而结合的抗原或抗体上被标记的酶仍保持活性，催化底物形成有
11、色产物。(2)测试方法：可目测或用分光光度计比色进行定性或定量检测。第24页，此课件共57页哦(3)测试过程v使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性疫活性（固相抗原抗体的形成）（固相抗原抗体的形成）v在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应或抗体起反应（抗原抗体反应）（抗原抗体反应）第25页，此课件共57页哦v用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合用洗涤的方法使固相载体上形成的
12、抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。量与标本中受检物质的量成一定的比例。（酶标（酶标抗原抗体复合物的分离）抗原抗体复合物的分离）v加入底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物加入底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。颜色反应的深浅进行定性或定量分析。（显色反（显色反应）应）第26页，此课件共57页哦酶酶来源来源底物底物检测波长检测波长/nm/nm碱性磷酸酶碱性磷酸酶牛小肠黏膜牛小肠黏膜
13、对硝基酚磷酸盐对硝基酚磷酸盐405405过氧化物酶过氧化物酶辣根辣根邻苯二胺邻苯二胺/过氧化氢过氧化氢492492-半乳糖酶半乳糖酶大肠杆菌大肠杆菌对硝基酚对硝基酚-半乳糖半乳糖405405常用标记的酶及其底物常用标记的酶及其底物第27页，此课件共57页哦(4)ELISA技术类型 ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体，在这种测定方法中有3种必要的试剂：v固相的抗原或抗体，固相的抗原或抗体，v酶标记的抗原或抗体，酶标记的抗原或抗体，v酶作用的底物。酶作用的底物。第28页，此课件共57页哦双抗体夹心法(直接夹心法）第29页，此课件共57页哦特点：n非竞争结合反应n常用于抗原的检测n适用于分子
14、中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原，而不能用于小分子半抗原的检测n所用两种抗体分别针对同一个抗原分子的不同抗原决定簇 第30页，此课件共57页哦间接法第31页，此课件共57页哦第32页，此课件共57页哦捕获法（反向间接法）n主要用于血清中某种抗体亚型成分（如IgM）的测定。第33页，此课件共57页哦 直接法 用酶标记的抗原或抗体直接检测包被在酶标板上的抗体或抗原，其量与产物颜色成正比。第34页，此课件共57页哦3、均相酶免疫吸附测定 基本原理：利用酶标抗体结合抗原形成复合物后，标记酶的活性发生改变的原理，在不将复合物与游离酶标抗体分离的情况下，直接测定系统中总的标记酶活性的改变，进而推算出待检
15、样品中的抗原量。主要用于主要用于小分子抗原小分子抗原或或半抗原半抗原的检测的检测.第35页，此课件共57页哦酶放大免疫测定技术:（enzyme-multiplied immunoassay technique，EMIT）n基本原理:半抗原与酶结合成酶标半抗原，保留半抗原和酶的活性。当酶标半抗原与抗体结合后，所标的酶与抗体密切接触，使酶的活性中心受影响而活性被抑制。第36页，此课件共57页哦斑点酶免疫试验(dot-ELISA)第37页，此课件共57页哦3.荧光与发光免疫分析n概念：以荧光素作为示踪物，通过荧光显微镜观察进行定位检测。n荧光化合物：异硫氰荧光素、罗丹明荧光素。第38页，此课件共57
16、页哦n基本原理 利用荧光素标记抗体，使之在涂片上或组织切片上与标本中的待检抗原特异结合，采用高发光效率的点光源，透过滤色板发出一定波长的光，使结合在标本上的荧光素被激发而产生荧光，借助荧光显微镜观察底物片上荧光染色形态，来判断有无待检抗原或抗体。第39页，此课件共57页哦第40页，此课件共57页哦荧光免疫测定技术时间分辨荧光免疫分析法n原理：稀土铕离子Eu3+螯合物标记抗体后，抗体与固相抗原结合，抗体上的Eu3+在紫外光（340nm）激发下，与增强液中的-二酮体重新形成一种微胶体螯合物，发出长寿命的高强度荧光（613nm），比未激发时增强了100万倍，可用时间分辩荧光计记录。第41页，此课件共
17、57页哦EuEuEuEuEu发射高强度荧光时间分辩荧光计记录加入增强液紫外光激发（340nm）时间分辨荧光免疫分析原理时间分辨荧光免疫分析原理直接法间接法夹心法间接夹心法第42页，此课件共57页哦4.亲和标记的免疫分析n亲和标记物：金黄色葡萄球菌的A蛋白、生物素（维生素）、地高辛（小分子药物）n原理：金黄色葡萄球菌的A蛋白与IgG的Fc有高度亲和力。用酶、同位素和荧光素等标记A蛋白，与抗体结合，可用于抗原抗体反应的分析。第43页，此课件共57页哦A蛋白蛋白亲和标记的免疫分析亲和标记的免疫分析第44页，此课件共57页哦三、免疫定位分析1.免疫荧光定位分析2.酶标记免疫定位3.免疫电子显微镜技术第
18、45页，此课件共57页哦1.免疫荧光定位分析n用不同发光颜色的荧光化合物标记抗体用于免疫细胞化学、免疫组织化学检测。（荧光化合物+抗体）-生物大分子（抗原）在细胞或组织中的表达和定位n荧光素：异硫氰荧光素、异硫氰四甲基罗丹明n荧光显微镜观测n荧光激活细胞分拣器（流式细胞仪）n应用：CD4+、CD8+T细胞亚群计数n原理：流式细胞仪产生分析的电信号生要是光散射信号和荧光信号，流式细胞仪依据细胞流经光照射区时电压讯号的强弱来分析和分选细胞。第46页，此课件共57页哦第47页，此课件共57页哦第48页，此课件共57页哦2.酶标记免疫定位n抗原（组织或细胞内）抗原（组织或细胞内）+第一抗体第一抗体+第
19、二第二抗体酶抗体酶+底物底物不溶于水的有色产物不溶于水的有色产物（1）酶标免疫组织化学）酶标免疫组织化学 固相抗原为组织切片或细胞样品。固相抗原为组织切片或细胞样品。第49页，此课件共57页哦（2）免疫印迹法（immunoblottingtest，IBT）蛋白质经凝胶电泳后，形成不同的条带，蛋白质经凝胶电泳后，形成不同的条带，转移至硝酸纤维膜上，用酶标记的抗体进转移至硝酸纤维膜上，用酶标记的抗体进行显色反应，可确定目的蛋白的有无，或行显色反应，可确定目的蛋白的有无，或分子量大小。分子量大小。分三个阶段进行:nSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）n转移硝酸纤维素膜 n酶免疫定位 第50
20、页，此课件共57页哦免疫印迹法原理示意图 第51页，此课件共57页哦3.免疫电子显微镜（免疫电子显微镜（IEM）技术）技术n电子显微镜技术与免疫反应相结合的一项技术。n优点：提高了电镜观察的特异性。如形态相同，但结构和组成不同的生物粒子，细胞器或病毒粒子。n种类：n 一类是先用抗体捕捉抗原，然后用磷钨酸负染色观察。n另一类是用金标记抗体进行抗原定位。胶体金与抗体Fc段结合。第52页，此课件共57页哦四、抗原抗体反应的其他应用1.免疫亲和层析n原理：任何一对抗原-抗体的组分之一与固相基质交联后均可用于另一组分的纯化。广泛用于蛋白质抗原的分离纯化。n固相基质：琼脂糖、葡聚糖第53页，此课件共57页
21、哦抗体+琼脂糖上样洗涤洗脱免免疫疫亲亲合合层层析析示示意意图图OD280检测凝胶电泳第54页，此课件共57页哦2.生物感应器与抗体芯片n机理：抗原与抗体在相互结合后，它们的结构发生了变化，一些次级键参与结构的变化。这种结构的改变通过电场效应的改变可以被检测到。n可以判断抗原抗体的结合是否发生及发生的强度。第55页，此课件共57页哦n组成：A.生物受体（抗体）B.转导体C.电子放大处理器转 导 体Y YY Y Y Y Y Y信号放大第56页，此课件共57页哦抗体芯片抗体芯片n抗体芯片是固相化间接免疫反应和免疫生物感应器抗体芯片是固相化间接免疫反应和免疫生物感应器的综合。的综合。n大量不同种类的抗体通过密集布阵在玻片或其他经过大量不同种类的抗体通过密集布阵在玻片或其他经过修饰的载体上，经过不同处理的细胞蛋白质用荧光染修饰的载体上，经过不同处理的细胞蛋白质用荧光染料染色后再与玻片上的抗体温育，经过洗涤处理后出料染色后再与玻片上的抗体温育，经过洗涤处理后出去非特性吸附的蛋白质，结合的蛋白质通过光电扫描去非特性吸附的蛋白质，结合的蛋白质通过光电扫描测定其强度。测定其强度。第57页，此课件共57页哦