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1、会计学1三代基因组编辑技术三代基因组编辑技术基因组编辑技术的介绍基因组编辑技术的介绍pp基因组编辑技术是一种可以在基因基因组编辑技术是一种可以在基因组水平上对组水平上对DNADNA序列进行改造的遗序列进行改造的遗传操作技术。传操作技术。pp这种技术的原理是构建一个人工内这种技术的原理是构建一个人工内切酶，在预定的基因组位置切断切酶，在预定的基因组位置切断DNADNA，切断的，切断的DNADNA在被细胞内的在被细胞内的DNADNA修复系统修复过程中会产生突修复系统修复过程中会产生突变，从而达到定点改造基因组的目变，从而达到定点改造基因组的目的。的。pp通过修复途径，基因组编辑技术可通过修复途径，
2、基因组编辑技术可以实现三种基因组改造，即以实现三种基因组改造，即基因敲基因敲除，特异突变的引入和定点转基因除，特异突变的引入和定点转基因pp基因组编辑是研究基因功能的重要基因组编辑是研究基因功能的重要基因组编辑是研究基因功能的重要基因组编辑是研究基因功能的重要手段之一，也可被用于人类遗传性手段之一，也可被用于人类遗传性手段之一，也可被用于人类遗传性手段之一，也可被用于人类遗传性疾病的治疗，因此这类技术成为现疾病的治疗，因此这类技术成为现疾病的治疗，因此这类技术成为现疾病的治疗，因此这类技术成为现代分子生物学的研究热点代分子生物学的研究热点代分子生物学的研究热点代分子生物学的研究热点第1页/共3
3、1页基因组编辑三大利器基因组编辑三大利器第2页/共31页介绍介绍n nZFN:Zinc-finger nucleases 锌指核糖核酸酶锌指核糖核酸酶n nTALENs:transcription activator-like effector nucleases 转录激活因子样效应物核酸酶转录激活因子样效应物核酸酶n nCRISPR/Cas9:clustered regularly interspaced short palindromic repeats 成簇成簇的规律间隔的短回文重复序列的规律间隔的短回文重复序列/CRISPR-associated 9 第3页/共31页Zinc Fing
4、er Nuclease(ZFN)第4页/共31页-是一种常出现在是一种常出现在DNADNA结合蛋白质中的一种结构基结合蛋白质中的一种结构基 元。锌螯合在氨基酸链中形成锌的指状结构。元。锌螯合在氨基酸链中形成锌的指状结构。-对基因调控起重要的作用。根据其保守结构域的不对基因调控起重要的作用。根据其保守结构域的不 同，可将锌指蛋白主要分为同，可将锌指蛋白主要分为C2H2C2H2型、型、C4C4型和型和C6C6型型。锌指通过与靶分子锌指通过与靶分子DNADNA、RNARNA、DNADNARNARNA的序的序 列特异性结合，以及与自身或其他锌指蛋白的结合列特异性结合，以及与自身或其他锌指蛋白的结合 在
5、转录和翻译水平上调控基因的表达、细胞分化以在转录和翻译水平上调控基因的表达、细胞分化以 及胚胎发育。及胚胎发育。-结构结构 24-30 24-30 个氨基酸残基个氨基酸残基 形成形成-二级结构二级结构 两保守的半胱氨酸和组氨酸配位一个锌原子。两保守的半胱氨酸和组氨酸配位一个锌原子。What is a Zinc Finger?第5页/共31页Zinc finger nuclease(ZFN)由一个由一个 DNA DNA 结合域（结合域（DNA-binding domainDNA-binding domain）和一个非特异性核）和一个非特异性核酸内切酶酸内切酶Fok1Fok1构成。构成。DNA D
6、NA 结合域是由一系列结合域是由一系列 Cys2-His2 Cys2-His2锌指蛋白锌指蛋白（zinc-fingerszinc-fingers）串联组成（一般）串联组成（一般 34 34 个），每个锌指蛋白识别并结个），每个锌指蛋白识别并结合一个特异的三联体碱基。合一个特异的三联体碱基。Genetics,Vol.188,773782第6页/共31页ZFN mediated genome editingn nFOK1二聚体互作n n与非同源性末端接合(Non-homologous end joining,NHEJ)和同源重组（Homologous Recombination)等方法结合使用n
7、n同源二聚体或单一ZFN单元的结合造成非特异性酶切，即脱靶效应（off-target）第7页/共31页ZFN mediated genome editing第8页/共31页 ZFN的限制性的限制性已建有已建有ZFN库，识别多种库，识别多种DNA序列，但不能达到识别任意靶序列，但不能达到识别任意靶DNA，其应用受到限制。，其应用受到限制。细胞毒性细胞毒性大量脱靶位点的出大量脱靶位点的出现导致基因组的破坏现导致基因组的破坏构建繁琐构建繁琐识别特性决定构建识别特性决定构建难度大，时间长难度大，时间长第9页/共31页Transcription activator like effector nucle
8、ase(TALEN)第10页/共31页Plant Bacterial TAL Effector n发现：1989年，植物病原体黄担保菌属（Xanthomonas spp.）avrbs3基因n发展：2007年，发现其序列特异性核酸结合特性，avvrBs3-TA.2009年，TAL effector 氨基酸序列与核酸靶序列的密码被破译、n应用：2011年，Nature Biotechonlogy同时发辫四篇TALEN基因敲除文章和一篇综述第11页/共31页Functional domains of Xanthomonas TAL effectorspN-端包括一个移位子信号端包括一个移位子信号pC
9、-端包括一个核定位信号和转录激活域端包括一个核定位信号和转录激活域p中间的重复序列决定其特异性中间的重复序列决定其特异性 The number of repeats in TAL effectors varies between 1.5 and 33.5 The general repeat length is 34 aaTAL 效应蛋白的不同结构功能域第12页/共31页Code of DNA Binding Specificity of TAL-Type III Code of DNA Binding Specificity of TAL-Type III EffectorsEffector
10、sl一系列（12或以上）串联重复序列构成识别元件l每个重复有34个氨基酸残基l除12和13位其余都高度保守l重复序列可变的双氨基酸残基(repeat-variable diresidues,RVD)NI-A,HD-C,NN-G/A,and NG-T第13页/共31页l lOriginOrigin：bacterium Flavobacterium bacterium Flavobacterium okeanokoitesokeanokoites海床黄杆菌海床黄杆菌海床黄杆菌海床黄杆菌l l由一个由一个N-N-端端DNADNA识别域和识别域和C C端剪切域组端剪切域组成成l lFokI FokI
11、二聚化二聚化才有剪切活性才有剪切活性Structure of the FokI dimerFok I第14页/共31页Tale nucleases(TALENs):hybrid proteins composed of Tale nucleases(TALENs):hybrid proteins composed of TAL TAL effectors and FokI DNA-cleavage domaineffectors and FokI DNA-cleavage domain16第15页/共31页The principle of TALEN-mediated gene targeti
12、ng(基本原则基本原则).利用TALEN在特定位点创造DSB.利用细胞HR（同源重组）修复机制实现基因修饰.利用细胞NHEJ（非同源性末端接合）修复机制实现基因修饰第16页/共31页TALENs的优缺点的优缺点n nTALEN TALEN 技术是一种崭新的分子生物学工具。利用技术是一种崭新的分子生物学工具。利用TALTAL的序列模块，可组装成的序列模块，可组装成特异结合任意特异结合任意DNADNA序列的模块化蛋白，从而达到靶向操作内源性基因的目的，序列的模块化蛋白，从而达到靶向操作内源性基因的目的，它克服了它克服了ZFNZFN方法不能识别任意目标基因序列，以及识别序列经常受上下游方法不能识别任
13、意目标基因序列，以及识别序列经常受上下游序列影响等问题，而具有序列影响等问题，而具有ZFNZFN相等或更好的灵活性，使基因操作变得更加简相等或更好的灵活性，使基因操作变得更加简单方便。单方便。n n然而，构建过程中，然而，构建过程中，TALE TALE 分子的模块组装和筛选过程比较繁杂，需要大量分子的模块组装和筛选过程比较繁杂，需要大量的测序工作。对于普通实验室的可操作性较低。的测序工作。对于普通实验室的可操作性较低。第17页/共31页 CRISPR/Cas9 system第18页/共31页 CRISPR-CasCRISPR-Cas系统简介系统简介系统简介系统简介 CRISPR-CasCRIS
14、PR-Cas系统的研究历史系统的研究历史系统的研究历史系统的研究历史pp1987 1987 年，日本课题组在年，日本课题组在年，日本课题组在年，日本课题组在K12 K12 大肠杆菌的碱性磷酸酶基因附近发现串联大肠杆菌的碱性磷酸酶基因附近发现串联大肠杆菌的碱性磷酸酶基因附近发现串联大肠杆菌的碱性磷酸酶基因附近发现串联间隔重复序列，随后发现其广泛存在于细菌和古细菌的基因组中，间隔重复序列，随后发现其广泛存在于细菌和古细菌的基因组中，间隔重复序列，随后发现其广泛存在于细菌和古细菌的基因组中，间隔重复序列，随后发现其广泛存在于细菌和古细菌的基因组中，2002 2002 年，正式将其命名为年，正式将其命
15、名为年，正式将其命名为年，正式将其命名为成簇的规律间隔的短回文成簇的规律间隔的短回文成簇的规律间隔的短回文成簇的规律间隔的短回文重复序列重复序列重复序列重复序列pp2005 2005 年发现年发现年发现年发现CRISPR CRISPR 的间隔序列的间隔序列的间隔序列的间隔序列(spacer)(spacer)与宿主菌的染色体外的遗传物与宿主菌的染色体外的遗传物与宿主菌的染色体外的遗传物与宿主菌的染色体外的遗传物质高度同源，推测细菌可能通过质高度同源，推测细菌可能通过质高度同源，推测细菌可能通过质高度同源，推测细菌可能通过CRISPR CRISPR 系统可能以类似于真核生物的系统可能以类似于真核生
16、物的系统可能以类似于真核生物的系统可能以类似于真核生物的RNAi RNAi 方式抵抗外源遗传物质的入侵。方式抵抗外源遗传物质的入侵。方式抵抗外源遗传物质的入侵。方式抵抗外源遗传物质的入侵。pp2007 2007 年，年，年，年，Barrangou Barrangou 等首次发现细菌可能利用等首次发现细菌可能利用等首次发现细菌可能利用等首次发现细菌可能利用CRSPR CRSPR 系统抵抗噬菌体系统抵抗噬菌体系统抵抗噬菌体系统抵抗噬菌体入侵；入侵；入侵；入侵；2008 2008 年，年，年，年，Marraffini Marraffini 等发现细菌等发现细菌等发现细菌等发现细菌CRISPR CRI
17、SPR 系统能阻止外源质粒的系统能阻止外源质粒的系统能阻止外源质粒的系统能阻止外源质粒的转移，首次利用实验验证了转移，首次利用实验验证了转移，首次利用实验验证了转移，首次利用实验验证了CRISPR CRISPR 系统的功能系统的功能系统的功能系统的功能pp2013 2013 年初，年初，年初，年初，MIT MIT 的研究组首次利用的研究组首次利用的研究组首次利用的研究组首次利用CRISPR/Cas9 CRISPR/Cas9 系统对人系统对人系统对人系统对人293T 293T 细胞细胞细胞细胞EMX1EMX1 和和和和PVALB PVALB 基因以及小鼠基因以及小鼠基因以及小鼠基因以及小鼠Ner
18、o2A Nero2A 细胞细胞细胞细胞Th Th 基因实现了定点突变。基因实现了定点突变。基因实现了定点突变。基因实现了定点突变。同年同年同年同年Mali Mali 利用利用利用利用CRISPR/Cas9 CRISPR/Cas9 在人在人在人在人293T 293T 细胞和细胞和细胞和细胞和K652 K652 细胞基因的靶位点细胞基因的靶位点细胞基因的靶位点细胞基因的靶位点形成双链或单链的切口，从而激活细胞的形成双链或单链的切口，从而激活细胞的形成双链或单链的切口，从而激活细胞的形成双链或单链的切口，从而激活细胞的DNA DNA 修复机制高效介导外源修复机制高效介导外源修复机制高效介导外源修复机
19、制高效介导外源基因定点插入。基因定点插入。基因定点插入。基因定点插入。第19页/共31页 CRISPR-Cas系统的结构系统的结构ppCRISPR-CAS CRISPR-CAS 系统的组成主要包括系统的组成主要包括:由不连续的由不连续的重复序列重复序列R R(repeat)(repeat)与长度与长度相似的相似的间区序列间区序列S S(spacers)(spacers)间隔排列而成的间隔排列而成的CRISPR CRISPR 簇，簇，前导序列前导序列L L(leader)leader)以及一系列以及一系列CRISPR CRISPR 相关蛋白基因相关蛋白基因cascas。CasCas蛋白是一种双链
20、蛋白是一种双链DNADNA核酸酶，能在核酸酶，能在guide RNAguide RNA引导下对靶位点进行切割。它引导下对靶位点进行切割。它与与folkfolk酶功能类似，但是它并不需要形成酶功能类似，但是它并不需要形成二聚体才能发挥作用。二聚体才能发挥作用。第20页/共31页 CRISPR-CAS CRISPR-CAS 系统的作用机理系统的作用机理第21页/共31页 CRISPR-CAS CRISPR-CAS CRISPR-CAS CRISPR-CAS 系统的作用机理系统的作用机理系统的作用机理系统的作用机理p CRIPSR 基因座的表达(包括转录和转录后的成熟加工)当该噬菌体再次入侵细菌时，
21、CRISPR 簇首先转录为长的crRNA前体，然后逐步被加工成小的成熟的crRNA。pCRISPR/Cas 系统活性的发挥或者是对外源遗传物质的干扰 crRNA 结合相关的Cas 蛋白后，形成crRNA-Cas 蛋白复合体，通过碱基互补配对精确地与目标DNA相结合，随后Cas 蛋白对目标DNA 进行断裂和降解。第22页/共31页Guide RNA:crRNA（CRISPR-derived RNA）通过碱基配对与 tracrRNA（trans-activating crRNA）结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物。通过人工设计这两种 RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA（sho
22、rt guide RNA）Cas9:复合物引导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点剪切双链 DNA。HNH结构域剪切配对的部分，Ruvc结构域剪切未配对的链。HNHRuvCN代表任意DNA碱基Mechanism of CRISPR/Cas9 to target DNA蛋白质：核酸聚合物蛋白质：核酸聚合物第23页/共31页CRISPR/Cas在基因改造中的应用在基因改造中的应用n nCRISPR/CasCRISPR/Cas系统的作用特性与限制性核酸内切酶相似，它对序列的特异性切割主要依赖于系统的作用特性与限制性核酸内切酶相似，它对序列的特异性切割主要依赖于crRNAcrRNA
23、与与CasCas蛋白形成的核糖核蛋白复合物识别靶序列上的蛋白形成的核糖核蛋白复合物识别靶序列上的PAMPAM（Protospacer Protospacer-adjacent Motif-adjacent Motif ）以及）以及protospacerprotospacern n发现发现tracrRNAtracrRNA对靶点的识别和切割是必需的，对靶点的识别和切割是必需的，tracrRNAtracrRNA的的5 5端与成熟的端与成熟的crRNA 3crRNA 3端有部分序列端有部分序列(约约13 bp)13 bp)能够配对进而形成茎环结构，对维持能够配对进而形成茎环结构，对维持crRNAcrR
24、NA与靶点的配对可能十分重要与靶点的配对可能十分重要 根据根据tracrRNAtracrRNA与与crRNAcrRNA的结构特性，他们的结构特性，他们tracrRNAtracrRNA和和crRNAcrRNA表达为一条嵌合的向导表达为一条嵌合的向导RNA(guide RNA(guide RNARNA，gRNA)gRNA)，并在体外证明，并在体外证明gRNAgRNA可以发挥可以发挥tracrRNAtracrRNA和和crRNAcrRNA的功能的功能n nCRISPR/CasCRISPR/Cas系统有三类，其中系统有三类，其中TypeType型系统的核糖核蛋白复合物相对简单，除型系统的核糖核蛋白复合
25、物相对简单，除crRNAcrRNA和和tracrRNAtracrRNA外，只有外，只有Cas9Cas9一个蛋白一个蛋白 目前，产脓链球菌目前，产脓链球菌(SF370)(SF370)的的TypeType型系统（型系统（CRISPR/Cas9CRISPR/Cas9）是被改造的最为成功的人工核酸内切酶，已经在人类细胞是被改造的最为成功的人工核酸内切酶，已经在人类细胞 小鼠小鼠 斑马鱼中成功实现了基因组斑马鱼中成功实现了基因组定点修饰。定点修饰。第24页/共31页CRISPR/Cas9系统的成功应用案例系统的成功应用案例n n20132013年年1 1月月2929日在日在nature biotechn
26、ologynature biotechnology上发表的上发表的RNA-guided RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISER-Cas systemsediting of bacterial genomes using CRISER-Cas systems一文一文中，作者利用中，作者利用CRISER-Cas systemsCRISER-Cas systems用设计好的用设计好的DNADNA莫版替换相应基因莫版替换相应基因来达到定点修饰来达到定点修饰n n20132013年年1 1月月2929日在日在nature biotechn
27、ologynature biotechnology上发表的上发表的efficient efficient genome editing in zebra fish using a CRISER-Cas systemgenome editing in zebra fish using a CRISER-Cas system一一文中，作者利用人工合成的文中，作者利用人工合成的sgRNAssgRNAs能指导能指导Cas9Cas9内源性核酸酶对斑马内源性核酸酶对斑马鱼胚胎基因进行修饰鱼胚胎基因进行修饰n n20132013年年2 2月月1515日在日在sciencescience上发表的上发表的Mul
28、tiplex Genome Multiplex Genome Engineering UsingCRISPR/Cas SystemsEngineering UsingCRISPR/Cas Systems一文中，作者利用一个包一文中，作者利用一个包含两个靶向不同的含两个靶向不同的spacersspacers的的crRNAcrRNA实现了同时对两个基因进行编辑实现了同时对两个基因进行编辑n n20132013年年4 4月月1212日在日在cell stem cellcell stem cell上发表的上发表的Enhanced Enhanced Efficiency of Human Pluripo
29、tent Stem Cell Genome Editing Efficiency of Human Pluripotent Stem Cell Genome Editing through Replacing TALENs with CRISPRsthrough Replacing TALENs with CRISPRs一文中，作者利用一文中，作者利用TALENsTALENs和和CRISPRsCRISPRs对同一基因进行修饰，效率分别为对同一基因进行修饰，效率分别为0%-34%0%-34%和和51%-51%-79%79%第25页/共31页 ZFNZFN，TALENTALEN，CRISPR/Ca
30、s9 CRISPR/Cas9 的比较的比较的比较的比较均由自然界存在的核酸酶系统改造而来均由自然界存在的核酸酶系统改造而来均具有识别核酸碱基特异性的结构域均具有识别核酸碱基特异性的结构域发挥作用的机制：均通过在细胞基因组创造双链断裂缺口，发挥作用的机制：均通过在细胞基因组创造双链断裂缺口，从而诱发细胞自身修复机制完成基因修饰从而诱发细胞自身修复机制完成基因修饰第26页/共31页Differences of ZFN,TALEN and CRISPR/Cas9Differences of ZFN,TALEN and CRISPR/Cas9ZFNTALENCRISPR/Cas9系统大小1 kb 2
31、3 kb 2 4.2 kb(Cas9 from Streptococcus pyogenes)+0.1 kb(sgRNA)识别模块Zinc-finger proteins Transcription activator-like effectorscrRNA or sgRNA 识别序列长度1836 bp3040 bp 22 bp(total length 23 bp)识别序列限制性G-rich Start with T and end with A(owing to the heterodimer structure)End with an NGG or NAG(lower activity)
32、sequence(that is,PAM)切割模块FokIFokICas9切割效率Low or variable(10%)High(20%)High(20%)脱靶效应High Low Variable 细胞毒性Variable to high LowLow第27页/共31页CRISPRCRISPR/Cas9Cas9技术的优势技术的优势pp而且从实际应用的角度来说，而且从实际应用的角度来说，CRISPRsCRISPRs比比TALENsTALENs更容易操作，更容易操作，因为每一对因为每一对TALENsTALENs都需要重新合成，而用于都需要重新合成，而用于CRISPRCRISPR的的gRNAgR
33、NA只只需要替换需要替换2020个核苷酸就行。个核苷酸就行。pp只需合成一个只需合成一个sgRNAsgRNA就能实现对基因的特异性修饰，就能实现对基因的特异性修饰，CasCas蛋白蛋白不具特异性。不具特异性。pp编码编码sgRNAsgRNA的序列不超过的序列不超过100bp100bp，因此比构，因此比构TALENsTALENs和和ZFNsZFNs更简更简单方便。单方便。pp较短的较短的sgRNAsgRNA序列也避免了超长、高度重复序列也避免了超长、高度重复TALENsTALENs编码载体带编码载体带来的并发症。来的并发症。第28页/共31页 CRISPR CRISPR/Cas9Cas9系统的应
34、用前景系统的应用前景pp目前应用目前应用CRISPRCRISPR/Cas9Cas9系统的研究主要集中在基因编辑方系统的研究主要集中在基因编辑方面。而面。而Cas9Cas9真正的优势主要在于它具有能够将种主要真正的优势主要在于它具有能够将种主要生物聚合物（、和蛋白质）结合在一起的生物聚合物（、和蛋白质）结合在一起的特殊能力。特殊能力。pp各种功能性蛋白都可以通过与各种功能性蛋白都可以通过与Cas9Cas9蛋白融合，然后利用蛋白融合，然后利用gRNAgRNA的靶向作用结合到的靶向作用结合到dsds的任意位点，发挥人们的任意位点，发挥人们预期的功能。预期的功能。例如：例如：Cas9Cas9如果与甲基
35、化酶或去甲基化酶、乙酰化酶或去如果与甲基化酶或去甲基化酶、乙酰化酶或去乙酰化酶、激酶、磷酸化酶等促进染色质结构变异的蛋乙酰化酶、激酶、磷酸化酶等促进染色质结构变异的蛋白成功融合还将有助于表观遗传学的研究，并能够持久白成功融合还将有助于表观遗传学的研究，并能够持久改变基因的表达状态。如果几个作用于基因组不同位点改变基因的表达状态。如果几个作用于基因组不同位点Cas9Cas9复合物的协同作用，还可通过改变基因组的结构实复合物的协同作用，还可通过改变基因组的结构实现基因调控的目的。现基因调控的目的。第29页/共31页n nCRISPR/Cas9CRISPR/Cas9的切割是通过向导的切割是通过向导R
36、NARNA（sgRNAsgRNA）与基因组位点之间）与基因组位点之间20bp20bp碱基的配对，再引导碱基的配对，再引导Cas9Cas9实现的，但是实现的，但是CRISPR/Cas9CRISPR/Cas9与靶位点识别的特异性主要依赖于与靶位点识别的特异性主要依赖于sgRNAsgRNA与靠近与靠近PAM(NGG)PAM(NGG)处处10-12bp10-12bp碱基的配对，其余远离碱基的配对，其余远离PAMPAM处处8-10bp8-10bp碱基的错配对靶位点的识别影响较小，而我们知碱基的错配对靶位点的识别影响较小，而我们知道，要想在一个基因组中产生特异性位点至少需要道，要想在一个基因组中产生特异性
37、位点至少需要1616个碱基的配对才可实现特异。同时文献个碱基的配对才可实现特异。同时文献中报道中报道Cas9Cas9也可以识别也可以识别NAGNAG附近的序列并进行打靶，这些研究说明了附近的序列并进行打靶，这些研究说明了CRISPR/Cas9CRISPR/Cas9存在严重存在严重的脱靶性，即该技术可以发生非特异性切割，引起基因组非靶向位点的突变，这会造成研究的脱靶性，即该技术可以发生非特异性切割，引起基因组非靶向位点的突变，这会造成研究结果的不确定性以及研究工作的大量增加，这些问题严重地限制了结果的不确定性以及研究工作的大量增加，这些问题严重地限制了CRISPR/Cas9CRISPR/Cas9的应用。的应用。Potential off target of CRISPR/Cas9CRISPR/Cas9的潜在脱靶效应第30页/共31页