《荧光光谱原理与运用.pptx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《荧光光谱原理与运用.pptx（42页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、概述基本原理荧光分析方法荧光法的应用第1页/共42页荧光当某种常温物质经某种波长的入射光（通常是紫外线或X射线）照射，吸收光能后进入激发态，并立即退激发并发出比入射光的波长长的出射光（通常波长在可见光波段）；且一旦停止入射光，发光现象也随之立即消失。如右图为含有奎宁的通宁水在紫外线的照射下发出荧光。第2页/共42页荧光的分类自发荧光诱发荧光物质经过紫外线照射后发出荧光的现象可分为两种情况:如叶绿素、血红素等经紫外线照射后，能发出红色的荧光物体经荧光染料染色后再通过紫外线照射发出荧光第3页/共42页荧光分析法荧光分析是指利用某些物质在被短波长光（一般为紫外光）激发后产生荧光的特性及其强度进行物质
2、的定性和定量的分析的方法。第4页/共42页荧光光谱法的特点荧光光谱法的特点灵敏度高灵敏度高最低检出限：质量分数最低检出限：质量分数10-610-9数量级，适用于痕量物质检测数量级，适用于痕量物质检测灵敏度比紫外灵敏度比紫外-可见分光光度法约高可见分光光度法约高24个数量级个数量级选择性好选择性好 只只要要利利用用单单色色器器控控制制激激发发光光和和荧荧光光的的波波长长，通通过过前前后后两两次次波波长长的的选选择，可得到比吸收光度计更强的选择性。择，可得到比吸收光度计更强的选择性。应用还不够广泛，尚待拓宽应用还不够广泛，尚待拓宽 多多数数物物质质本本身身不不会会产产生生荧荧光光，一一些些物物质质
3、在在加加入入某某种种试试剂剂后后能能够够产产生荧光；对环境因素（温度，酸度、溶解氧）极为敏感生荧光；对环境因素（温度，酸度、溶解氧）极为敏感第5页/共42页荧光分析法的基本原理第6页/共42页（1）分子的激发 基态激发态(S1、S2、激发态振动能级）单重态：分子中所有电子自旋都配对的电子状态三重态：有两个电子的自旋不配对而平行的状态1.分子的激发与失活第7页/共42页1.分子的激发与失活（2）分子的失活处于激发态的分子很不稳定，可能经过辐射跃迁和非辐射跃迁的衰变过程而返回基态。辐射跃迁非辐射跃迁荧光磷光振动松弛内转化系间窜越第8页/共42页l 2l 1l 3l 2T1S0S1S2荧光磷光系间窜
4、越内转化内转化系间窜越振动松弛2.分子内的激发和衰变过程第9页/共42页振动弛豫：振动弛豫：由于分子间的碰撞，激发态分子由由于分子间的碰撞，激发态分子由同一电子能同一电子能级中级中的较高振动能级转至较低振动能级的过程，其的较高振动能级转至较低振动能级的过程，其效率较高。效率较高。激发态分子常常首先发生振动驰豫。激发态分子常常首先发生振动驰豫。内转换：内转换：相同多重态的两个电子能级间，相同多重态的两个电子能级间，电子由高能级电子由高能级回到低能级的分子内过程。回到低能级的分子内过程。无辐射跃迁 第10页/共42页系间窜越：系间窜越：激发态分子的电子自旋发生倒转而使分子的激发态分子的电子自旋发生
5、倒转而使分子的多多重态发生变化重态发生变化的过程。含有重原子的分子中（如的过程。含有重原子的分子中（如I、Br等），系间窜跃最常见。等），系间窜跃最常见。外转换：外转换：激发态分子激发态分子与溶剂或其他溶质相互作用与溶剂或其他溶质相互作用和能量和能量转换而使荧光（或磷光）减弱甚至消失的过程。转换而使荧光（或磷光）减弱甚至消失的过程。荧光强度的减弱或消失，称为荧光强度的减弱或消失，称为荧光熄灭或猝灭。荧光熄灭或猝灭。第11页/共42页辐射跃迁辐射跃迁荧光：荧光：受光激发的分子经振动驰豫、内转换、振动驰受光激发的分子经振动驰豫、内转换、振动驰豫到达豫到达第一电子激发单重态的最低振动能级第一电子激发
6、单重态的最低振动能级，以辐射，以辐射的形式失活回到基态，发出荧光。的形式失活回到基态，发出荧光。由于无辐射使分子吸收的能量有部分损失，因由于无辐射使分子吸收的能量有部分损失，因此荧光的能量比吸收的能量小，即此荧光的能量比吸收的能量小，即荧光波长一般比激荧光波长一般比激发光波长长。发光波长长。第12页/共42页磷光：磷光：若第一激发单重态的分子通过系间窜跃到达第若第一激发单重态的分子通过系间窜跃到达第一激发三重态，再通过振动驰豫转至该激发的最低振一激发三重态，再通过振动驰豫转至该激发的最低振动能级，然后以辐射的形式回到基态，发出的光线称动能级，然后以辐射的形式回到基态，发出的光线称为磷光。为磷光
7、。由由于于激激发发三三重重态态能能量量较较激激发发单单重重态态低低，所所以以磷磷光的波长比荧光的波长稍长。光的波长比荧光的波长稍长。磷光仅在很低的温度或黏性介质中才能观测到。磷光仅在很低的温度或黏性介质中才能观测到。因此磷光很少应用于分析。因此磷光很少应用于分析。第13页/共42页3 3.荧光产生的过程：荧光产生的过程：（1 1）处于）处于基态最低振动能级基态最低振动能级的荧光物质分子受到紫外线的照的荧光物质分子受到紫外线的照 射，吸收了和它所具有的特征频率相一致的光线，跃迁到射，吸收了和它所具有的特征频率相一致的光线，跃迁到第第一电子激发态一电子激发态的各个振动能级；的各个振动能级；（2 2
8、）被激发到第一电子激发态的各个振动能级的分子通过）被激发到第一电子激发态的各个振动能级的分子通过 无辐射跃迁无辐射跃迁降落到降落到第一电子激发态的最低振动能级第一电子激发态的最低振动能级；（3 3）降落到第一电子激发态的最低振动能级的分子继续降）降落到第一电子激发态的最低振动能级的分子继续降 落到落到基态的各个不同振动能级基态的各个不同振动能级，同时发射出相应的光量子，同时发射出相应的光量子，这就是这就是荧光荧光；（4 4）到达基态的各个不同振动能级的分子再通过无辐射跃迁最）到达基态的各个不同振动能级的分子再通过无辐射跃迁最后回到后回到基态的最低振动能级基态的最低振动能级第14页/共42页4.
9、荧光与结构的关系 电子跃迁类型电子跃迁类型 *的的荧荧光光效效率率高高，系系间间窜窜跃跃至至三三重重态态的的的的速率常数较小，有利于荧光的产生。速率常数较小，有利于荧光的产生。共轭效应共轭效应 含有含有*跃迁能级的跃迁能级的芳香族化合物芳香族化合物的荧光最的荧光最常见且最强。具有常见且最强。具有较大共轭体系较大共轭体系或或脂环羰基结构脂环羰基结构的的脂肪族化合物也可能产生荧光。脂肪族化合物也可能产生荧光。第15页/共42页荧光产生的过程：荧光产生的过程：（1 1）处于）处于基态最低振动能级基态最低振动能级的荧光物质分子受到紫外线的照的荧光物质分子受到紫外线的照 射，吸收了和它所具有的特征频率相
10、一致的光线，跃迁到射，吸收了和它所具有的特征频率相一致的光线，跃迁到第一电第一电子激发态子激发态的各个振动能级；的各个振动能级；（2 2）被激发到第一电子激发态的各个振动能级的分子通过）被激发到第一电子激发态的各个振动能级的分子通过 无辐射跃迁无辐射跃迁降落到降落到第一电子激发态的最低振动能级第一电子激发态的最低振动能级；（3 3）降落到第一电子激发态的最低振动能级的分子继续降）降落到第一电子激发态的最低振动能级的分子继续降 落到落到基态的各个不同振动能级基态的各个不同振动能级，同时发射出相应的光量子，这就，同时发射出相应的光量子，这就是是荧光荧光：（4 4）到达基态的各个不同振动能级的分子再
11、通过无辐射跃迁最后回）到达基态的各个不同振动能级的分子再通过无辐射跃迁最后回到到基态的最低振动能级基态的最低振动能级第16页/共42页2.分子产生荧光必须具备的条件（1）分子必须具有与所照射的辐射频率(紫外-可见光）相适应的结构（共轭键），才能吸收激发光（2）吸收了与其本身特征频率相同的能量之后，必须具有一定的荧光量子产率。第17页/共42页（1）荧光与结构的关系 电子跃迁类型电子跃迁类型 *的的荧荧光光效效率率高高，系系间间窜窜跃跃至至三三重重态态的的的的速率常数较小，有利于荧光的产生。速率常数较小，有利于荧光的产生。共轭效应共轭效应 含有含有*跃迁能级的跃迁能级的芳香族化合物芳香族化合物的
12、荧光最的荧光最常见且最强。具有常见且最强。具有较大共轭体系较大共轭体系或或脂环羰基结构脂环羰基结构的的脂肪族化合物也可能产生荧光。脂肪族化合物也可能产生荧光。第18页/共42页取取代代基基效效应应：苯苯环环上上有有吸吸电电子子基基常常常常会会妨妨碍碍荧荧光光的产生；而给电子基会使荧光增强。的产生；而给电子基会使荧光增强。化合物化合物 相对荧光强度相对荧光强度 荧光波长荧光波长/nm/nm C6H6（苯）（苯）10 10 270310 C6H5COOH C6H5NO230310390 C6H5CH3 C6H5OH C6H5OCH3 C6H5NH2 C6H5CN171820202027032028
13、5365285345310405280360 C6H5Cl C6H5BrC6H5I750275345290380第19页/共42页平面刚性结构效应平面刚性结构效应 可可降降低低分分子子振振动动，减减少少与与溶溶剂剂的的相相互互作作用用，故故具具有有很很强强的的荧荧光光。如如荧荧光光素素和和酚酚酞酞有有相相似似结结构构，荧荧光光素有很强的荧光，酚酞却没有。素有很强的荧光，酚酞却没有。第20页/共42页（2）荧光量子产率物物质质分分子子发发射射荧荧光光的的能能力力用用荧荧光光量量子子产产率率（）表表示：示：与失活过程的速率常数与失活过程的速率常数k k有关：有关：凡凡是是使使荧荧光光速速率率常常数
14、数k kf f增增大大而而使使其其他他失失活活过过程程（系系间间窜窜越越、外外转转换换、内内转转换换）的的速速率率常常数数减减小小的的因因素素（环境因素和结构因素）都可使荧光增强。（环境因素和结构因素）都可使荧光增强。第21页/共42页3.3.荧光强度与浓度的关系荧光强度与浓度的关系荧荧光光是是物物质质吸吸收收光光子子之之后后发发出出的的辐辐射射，荧荧光光强强度度（F）与与荧光物质的吸光程度荧光物质的吸光程度发射荧光的能力发射荧光的能力有关：有关：F=K（I0I）I0 入射光辐射强度；入射光辐射强度；I 透射光辐射强度；透射光辐射强度；K取决于荧光量子产率（取决于荧光量子产率（）。）。第22页
15、/共42页Lambert-Beer 定律：=第23页/共42页 溶液浓度较低时：溶液浓度较低时：当入射光的当入射光的1 1 和和 I0一定时一定时：F=K c 即：即：在在低低浓浓度度时时，溶溶液液的的荧荧光光强强度度与与荧荧光光物物质质的浓度成正比。的浓度成正比。这是荧光法定量的基础。这是荧光法定量的基础。但这种线性关系只有在极稀的溶液中，当 kbc0.05时才成立。对于较浓溶液，由于猝灭现象和自吸收等原因，使荧光强度和浓度不呈线性关系。第24页/共42页4.4.影响荧光强度的因素影响荧光强度的因素（1 1）内部因素）内部因素自猝灭自猝灭发光物质分子间碰撞而发生的能量无辐射转移。发光物质分子
16、间碰撞而发生的能量无辐射转移。自猝灭随溶液浓度的增加而增加。自猝灭随溶液浓度的增加而增加。自吸收自吸收荧光化合物的发射的波长与其吸收的波长重叠，荧光化合物的发射的波长与其吸收的波长重叠，溶液内部激发态分子所发射的荧光在通过外部溶液时被溶液内部激发态分子所发射的荧光在通过外部溶液时被同类分子吸收，而使荧光被减弱。同类分子吸收，而使荧光被减弱。荧光强度荧光强度F与光源的辐射强度与光源的辐射强度I0有关，因此有关，因此增大光源辐射功率增大光源辐射功率I0可提高荧光测定的灵敏度。可提高荧光测定的灵敏度。第25页/共42页（2）环境因素 pH值 含有酸性或碱性取代基的芳香化合物的荧光与pH有关。pH的变
17、化影响了荧光基团的电荷状态，从而使其荧光发生变化。溶解氧 往往使荧光强度降低化合物化合物 相对荧光相对荧光强度强度 C6H5OH 18 C6H5O 0C6H5NH2 20C6H5NH3 +0温度 温度降低会减少碰撞和非辐射失活的概率，因此会增加荧光强度。第26页/共42页荧光分析仪第27页/共42页光源光源氙氙灯灯激发单色器激发单色器样品池样品池光电倍增管光电倍增管数据处理数据处理仪器控制仪器控制光源光源样品池样品池激发激发单色器单色器检测器检测器数据处理数据处理仪器控制仪器控制发射发射单色器单色器发射单色器发射单色器荧荧光光分分光光光光度度计计与与紫紫外外-可可见见分分光光光光度度计计有有何
18、异同点？何异同点？荧光分光光度计扫描激发光谱，选择激发波长扫描发射光谱消除干扰波长范围：波长范围：200800nm200800nm最广泛应用的连续光源最广泛应用的连续光源第28页/共42页光源：光源：氙灯、氙灯、高压汞蒸气灯高压汞蒸气灯单色器：单色器：激发单色器激发单色器选择激发光波长选择激发光波长荧光单色器荧光单色器选择选择(测量测量)发射光（荧光）波长，发射光（荧光）波长，与激发光入射方向垂直。与激发光入射方向垂直。样品池：样品池：采用低荧光材料，通常为石英池采用低荧光材料，通常为石英池检测器：检测器：光电倍增管光电倍增管第29页/共42页 荧光法的应用第30页/共42页1.1.荧光激发光
19、谱和发射光谱荧光激发光谱和发射光谱（1 1）荧荧光光发发射射光光谱谱：固固定定激激发发光光的的波波长长，测测量量不不同同荧荧光光波波长长处处荧荧光光的的强强度度，得得到到荧荧光光光谱，即光谱，即荧光强度荧光强度荧光波长图荧光波长图。（2 2）荧荧光光激激发发光光谱谱（吸吸收收光光谱谱）：在在荧荧光光最最强强的的波波长长处处测测量量随随激激发发光光波波长长的的改改变变而而变变化的荧光强度，得到荧光激发光谱。即化的荧光强度，得到荧光激发光谱。即荧光强度荧光强度-激发光波长图。激发光波长图。第31页/共42页第32页/共42页a.Stokes位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值。荧光的波长总是大于
20、激发光的波长，这是由于振动弛豫和内转换过程损失了一定的能量。b.发射光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光。c.镜像规则 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。激发光谱与发射光谱的关系第33页/共42页2.定量分析方法定量方法：标准曲线法：配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线上求出浓度。比较法：在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，再进行比较。定量依据：低浓度时，溶液荧光强度与荧光物
21、质浓度成正比 F=KCF=KC第34页/共42页3.3.无机物的荧光分析无机物的荧光分析无机物能够直接产生荧光并用于测定的很少。无机物能够直接产生荧光并用于测定的很少。可通过可通过与荧光试剂作用生成荧光配合物、或通过催化或猝灭与荧光试剂作用生成荧光配合物、或通过催化或猝灭荧光反应进行荧光分析。非过渡金属离子的荧光配合荧光反应进行荧光分析。非过渡金属离子的荧光配合物较多。可用于荧光分析的元素已近物较多。可用于荧光分析的元素已近7070种。种。荧光试剂是具有两个或以上与荧光试剂是具有两个或以上与MZ+形成螯合物的电子形成螯合物的电子给予体官能团的芳香结构。给予体官能团的芳香结构。OH NSO3Na
22、N=NOH HOON8-羟基喹啉石榴茜素R第35页/共42页无机化合物的分析：无机化合物的分析：铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法荧光分析法；氟、硫、铁、银、钴、镍采用氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法荧光熄灭法测定；测定；铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法催化荧光法测定；测定；铬、铌、铀、碲采用铬、铌、铀、碲采用低温荧光法低温荧光法测定；测定；铈、铕、锑、钒、铀采用铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法固体荧光法测定。测定。第36页/共42页4.4.有机物的荧光分析有机物的荧光分析荧光法在有机化合物中应用较广。芳
23、香化合物多能荧光法在有机化合物中应用较广。芳香化合物多能发生荧光。脂肪族化合物往往与荧光试剂作用后才发生荧光。脂肪族化合物往往与荧光试剂作用后才可产生荧光。可产生荧光。名名 称称 结结 构构 式式 应应 用用 9-蒽基重氮甲烷蒽基重氮甲烷 某些羧酸某些羧酸 丹磺酰氯丹磺酰氯 伯胺、仲胺、酚伯胺、仲胺、酚或氨基酸或氨基酸 CH2N2N(CH3)2SO2Cl第37页/共42页锌()存在下诺氟沙星与牛血清白蛋白的结合作用以ex=280 nm，分别加入NFLX和Zn(II)后，BSA的最大荧光峰位置不变，但是荧光强度均降低，这说明NFLX和BSA以及Zn(II)和BSA之间存在相互作用，发生了能量转移，可见NFLX和Zn(II)对BSA的均有荧光猝灭作用。第38页/共42页鱼腥草中钛含量分析钛与苯基荧光酮生成 络合物及相应空白的吸收光谱钛与苯基荧光酮生成橙色络合物，最大吸收波长为5 4 0 n m，试剂空白的最大吸收 波长为4 6 0 n m，故选定测量波长为5 4 0 n m.第39页/共42页鱼腥草中钛含量分析第40页/共42页谢谢！第41页/共42页感谢您的观看！第42页/共42页