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1、组织学技术与方法组织学技术与方法指导教师：沈新生指导教师：沈新生常常 青青第1页/共51页常用技术常用技术1.1.石蜡切片石蜡切片(paraffin sectioning)(paraffin sectioning)术术 取材固定取材固定脱水包埋脱水包埋切片染色切片染色封片封片2.2.冰冻切片冰冻切片(freezing sectioning)(freezing sectioning)取材取材速冻速冻冰冻切片冰冻切片染色染色封固封固 3.3.其他其他:涂片涂片涂片涂片-血液、磨片血液、磨片血液、磨片血液、磨片-牙、铺片牙、铺片牙、铺片牙、铺片-CT-CT-CT-CT等。等。等。等。组织学与胚胎学的
2、研究技术组织学与胚胎学的研究技术第2页/共51页2023/3/263组织学切片标本制作技术简介组织学切片标本制作技术简介 制作光镜组织学标本最常用的方法是石蜡包埋切片法制作光镜组织学标本最常用的方法是石蜡包埋切片法,即用石蜡把组织即用石蜡把组织块包起来，使组织变硬，便于切薄。其主要步骤如下：块包起来，使组织变硬，便于切薄。其主要步骤如下：第3页/共51页2023/3/2641.1.取材、固定取材、固定 取取材材一一般般在在动动物物死死后后2 2小小时时以以内内取取。将将取取下下的的新新鲜鲜的的组组织织块块迅迅速速投投入入固固定定液液中中进进行行固固定定。固固定定液液的的种种类类很很多多，常常用
3、用的的有有：福福尔尔马马林林、酒酒精精、丙丙酮酮及及一一些些混混合合固固定定液液。固固定定的的目目的的在在于于使使组组织织中中的的蛋蛋白白质质迅迅速速凝凝固，以停止其死亡前的变化，从而保持标本的结构接近于其生前的正常状态。固，以停止其死亡前的变化，从而保持标本的结构接近于其生前的正常状态。第4页/共51页2023/3/2652.2.脱水、透明、浸蜡脱水、透明、浸蜡 固固定定后后的的组组织织用用水水冲冲洗洗后后，组组织织中中充充满满水水分分，妨妨碍碍石石蜡蜡的的侵侵入入，必必须须用用不不同同浓浓度度的的酒酒精精将将组组织织中中的的水水分分脱脱净净，这这一一过过程程称称为为脱脱水水。脱脱水水后后组
4、组织织中中含含有有酒酒精精，仍仍不不能能与与石石蜡蜡相相融融，要要用用二二甲甲苯苯或或氯氯仿仿替替代代酒酒精精，组组织织经经过过二二甲甲苯苯后后呈呈现现透透明明状状态态，这这一一过过程程称称为为透透明明。把把透透明明后后的的组组织织块块投投入入融融化化的的石石蜡蜡中浸润，使组织内的空隙充满石蜡，产生一定的硬度，这叫中浸润，使组织内的空隙充满石蜡，产生一定的硬度，这叫浸蜡浸蜡。第5页/共51页2023/3/2663.3.包埋、切片包埋、切片 浸浸蜡蜡后后，把把组组织织块块放放入入装装有有溶溶化化的的固固体体石石蜡蜡的的包包埋埋器器中中，待待石石蜡蜡凝凝固固后后，组组织织块块便便被被包包埋埋在在里
5、里面面，成成为为蜡蜡块块，这这一一过过程程称称为为包包埋埋。把把包包埋埋好好的的蜡蜡块块修修好好，粘粘在在木木块块上上，便便可可放放到到切切片片机机上上，切切成成5 56m6m厚厚的的薄薄片片，然然后后贴贴在在干干净净的的载载玻玻片片上上，置置于于6060左左右的温箱内烤干。右的温箱内烤干。包埋器载玻 片蜡块粘好的木块第6页/共51页2023/3/2674.4.染色、封固染色、封固 贴好的切片，经过脱蜡、酒精侵水等过程后，即可进行染色。常用的染色方法是贴好的切片，经过脱蜡、酒精侵水等过程后，即可进行染色。常用的染色方法是苏木素苏木素伊红染色法（伊红染色法（Hematoxylin Eosin s
6、tainHematoxylin Eosin stain），），简称简称&染色法。苏木素是一种碱性染料，可使组染色法。苏木素是一种碱性染料，可使组织细胞中的织细胞中的酸性物质（又称嗜碱性物质）酸性物质（又称嗜碱性物质）染成紫蓝色，如细胞核中的染色质等；伊红是一染成紫蓝色，如细胞核中的染色质等；伊红是一种酸性染料，可使组织细胞中的种酸性染料，可使组织细胞中的碱性物质（又称嗜酸性物质）碱性物质（又称嗜酸性物质）染成红色，如多数细胞的细染成红色，如多数细胞的细胞质、核仁等在胞质、核仁等在H&EH&E染色的切片中均呈红色，很易跟细胞核区别。另外，还有硝酸银染色、染色的切片中均呈红色，很易跟细胞核区别。另
7、外，还有硝酸银染色、三色或多色染色等，在此不作介绍。染色后，经酒精脱水、二甲苯透明，即可封固。三色或多色染色等，在此不作介绍。染色后，经酒精脱水、二甲苯透明，即可封固。封封固时固时,在切片标本上滴一滴树胶，盖上盖玻片，干后即成为既可以在镜下观察又能够长期在切片标本上滴一滴树胶，盖上盖玻片，干后即成为既可以在镜下观察又能够长期保存的标本保存的标本。三、切片观察:HE染色、封固后的切片标签载玻片盖玻片组织标本第7页/共51页2023/3/268显微镜模式图第8页/共51页2023/3/269德国莱卡手动切片机第9页/共51页2023/3/2610苏木素伊红染色法（苏木素伊红染色法（Hematoxy
8、lin Eosin stainHematoxylin Eosin stain）第10页/共51页2023/3/2611第11页/共51页2023/3/2612一、组织标本的取材一、组织标本的取材 1.1.来源：来源：组织标本主要取之于组织标本主要取之于活组织检查活组织检查标本、手术切除标本、动物模型标本标本、手术切除标本、动物模型标本以及以及尸尸体解剖标本体解剖标本等。前三者均为新鲜组织，后者等。前三者均为新鲜组织，后者是机体死亡是机体死亡2h2h以上的组织，可能有不同程度以上的组织，可能有不同程度的自溶，其抗原可能有变性消失，严重弥散的自溶，其抗原可能有变性消失，严重弥散现象，因此，尸检组织
9、应尽快固定处理，以现象，因此，尸检组织应尽快固定处理，以免影响免疫组化标记效果。但有些较稳定性免影响免疫组化标记效果。但有些较稳定性抗原，如抗原，如HBsAgHBsAg、HBcAgHBcAg等在尸检标本中，抗等在尸检标本中，抗原显示仍较好。原显示仍较好。第12页/共51页2023/3/2613取材的先后：应根据动物死后组织结构改变取材的先后：应根据动物死后组织结构改变的速度的快慢而定。首先打开腹腔，取出消的速度的快慢而定。首先打开腹腔，取出消化管，因为消化管在血液循环停止后，黏膜化管，因为消化管在血液循环停止后，黏膜很快发生自溶现象；其次为肝脏、脾脏等多很快发生自溶现象；其次为肝脏、脾脏等多血
10、器官及神经组织；再其次才是其他脏器。血器官及神经组织；再其次才是其他脏器。取材的大小：切取的组织块应小而薄，大小取材的大小：切取的组织块应小而薄，大小一般以一般以2cm1.5cm0.3cm2cm1.5cm0.3cm为好，但有些特为好，但有些特殊要求的可视情况而定。殊要求的可视情况而定。取材时要注明取材时间、组织名称、固定液取材时要注明取材时间、组织名称、固定液名称、组织块数量，以备查。名称、组织块数量，以备查。第13页/共51页2023/3/26142.2.各种因素对组织标本的取材的影响各种因素对组织标本的取材的影响 如各种内窥镜钳取的组织，常因过度挤如各种内窥镜钳取的组织，常因过度挤压而变形
11、，严重者组织结构被破坏。大组织压而变形，严重者组织结构被破坏。大组织标本病变分布广泛，抗原在组织中分布不均标本病变分布广泛，抗原在组织中分布不均一，常出现人为的组织取材不准确。为了避一，常出现人为的组织取材不准确。为了避免上述缺点，组织取材时应注意：免上述缺点，组织取材时应注意：活检钳活检钳的刃口必须锋利，以免组织受挤压；的刃口必须锋利，以免组织受挤压；取材取材部位必须是主要病变区；部位必须是主要病变区；必须取病灶与正必须取病灶与正常组织交界区；常组织交界区；必要时取远距病灶区的正必要时取远距病灶区的正常组织作对照。常组织作对照。第14页/共51页2023/3/26153.3.取材后的处理取材
12、后的处理 为充分保存组织的抗原性，标本离体后应立为充分保存组织的抗原性，标本离体后应立即作处理，或立即速冻成冻块进行冰冻切片，或立即作处理，或立即速冻成冻块进行冰冻切片，或立即用固定液固定进行脱水、浸蜡、包埋、石蜡切片。即用固定液固定进行脱水、浸蜡、包埋、石蜡切片。如不能迅速制片，可贮存于如不能迅速制片，可贮存于 -196-196液氮罐内或液氮罐内或-8080冰箱内备用。冰箱内备用。第15页/共51页2023/3/2616二、细胞和组织的固定二、细胞和组织的固定 为了更好的保持细胞和组织原有的形态结构，防止组织自溶，有必要对细胞和组织进行固定。固定的为了更好的保持细胞和组织原有的形态结构，防止
13、组织自溶，有必要对细胞和组织进行固定。固定的作用不仅是使细胞内蛋白质凝固，终止或抑制外源性和内源性酶活性，更重要的是最大限度的保存细胞和作用不仅是使细胞内蛋白质凝固，终止或抑制外源性和内源性酶活性，更重要的是最大限度的保存细胞和组织的抗原性，使水溶性抗原转变为非水溶性抗原，防止抗原弥散。组织的抗原性，使水溶性抗原转变为非水溶性抗原，防止抗原弥散。第16页/共51页2023/3/2617（一）、固定剂（一）、固定剂 1 1醛类固定剂醛类固定剂（单纯固定剂）（单纯固定剂）双功能交联剂，其作用是使双功能交联剂，其作用是使组织之间相互交联，保存抗原于原位，其特点是对组织穿组织之间相互交联，保存抗原于原
14、位，其特点是对组织穿透性强，收缩性小。有人认为它对透性强，收缩性小。有人认为它对IgMIgM、IgAIgA、J J链、链、K K链和链和链的标记效果良好，背景清晰，是常用的固定剂。链的标记效果良好，背景清晰，是常用的固定剂。（1 1）10%10%钙钙-福尔马林液福尔马林液 （40%40%甲醛甲醛10ml10ml，饱和碳酸钙水溶液，饱和碳酸钙水溶液90ml90ml）。）。（2 2）10%10%中性缓冲福尔马林液中性缓冲福尔马林液 （40%40%甲醛甲醛10ml10ml，0.01mol/L pH7.4 PBS 90ml0.01mol/L pH7.4 PBS 90ml）。）。（3 3）4%4%多聚甲
15、醛磷酸缓冲液多聚甲醛磷酸缓冲液 (pH7.4)(pH7.4)（多聚甲醛（多聚甲醛40g,0.1mol/L PBS40g,0.1mol/L PBS液液pH7.4 500mlpH7.4 500ml，两者，两者混混 合加热至合加热至6060，搅拌并滴加，搅拌并滴加1n NaOH1n NaOH至清晰为止，冷至清晰为止，冷 却后加却后加PBSPBS液至总量液至总量1000ml1000ml）。）。第17页/共51页2023/3/26182 2丙酮及醇类固定剂丙酮及醇类固定剂 系最初免疫细胞化学染色的固定剂，其作用是沉淀蛋白质和糖，对组织穿透性很强，保存抗原的免疫活性系最初免疫细胞化学染色的固定剂，其作用是
16、沉淀蛋白质和糖，对组织穿透性很强，保存抗原的免疫活性较好。但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差，解决的办法是和其它试剂混合使用，较好。但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差，解决的办法是和其它试剂混合使用，如加冰醋酸、乙醚、氯仿、甲醛等。如加冰醋酸、乙醚、氯仿、甲醛等。第18页/共51页2023/3/2619（1 1）ClarkeClarke氏改良剂（氏改良剂（100%100%酒精酒精95ml95ml，冰醋酸，冰醋酸5ml5ml），用于冰冻切片的后），用于冰冻切片的后固定。固定。（2 2）乙醚（或氯仿）与乙醇等量混合液。）乙醚（或氯仿）与乙醇等量混合液。Danos
17、Danos（19761976）等认为其组织穿透性极强，即使涂片上富于过多的粘液，）等认为其组织穿透性极强，即使涂片上富于过多的粘液，固定效果仍然良好，是理想的细胞固定液。固定效果仍然良好，是理想的细胞固定液。第19页/共51页2023/3/2620 （3 3）AAFAAF液：液：95%-100%95%-100%酒精酒精85ml85ml，冰醋酸，冰醋酸5ml5ml，40%40%甲醛甲醛10ml10ml。（4 4）CarnoyCarnoy氏液：氏液：100%100%酒精酒精60ml60ml，氯仿，氯仿30ml30ml，冰醋酸，冰醋酸10ml10ml，混合后，混合后44保存备用。保存备用。以上两种固
18、定液适宜以上两种固定液适宜糖原糖原，某些抗原，癌基因蛋白产物检测的，某些抗原，癌基因蛋白产物检测的 固定，固定，P53P53抗癌基因蛋白产物，抗癌基因蛋白产物，PC-NAPC-NA等抗原的保存。等抗原的保存。第20页/共51页2023/3/2621丙酮的组织穿透性和脱水性更强，常用于冰冻切片及细胞涂片的后固定，保丙酮的组织穿透性和脱水性更强，常用于冰冻切片及细胞涂片的后固定，保存抗原性较好，平时存抗原性较好，平时44低温保存备用，临用时，只需将涂片或冰冻切片插低温保存备用，临用时，只需将涂片或冰冻切片插入冷丙酮内入冷丙酮内5-10min5-10min，取出后自然干燥，贮存于低温冰箱备用。，取出
19、后自然干燥，贮存于低温冰箱备用。第21页/共51页2023/3/2622BouinBouins s液液(饱和苦味酸饱和苦味酸75ml+40%75ml+40%甲醛甲醛25ml+3625ml+36冰醋冰醋酸酸5ml)5ml)该固定液为组织学、病理学常用固定剂之该固定液为组织学、病理学常用固定剂之一，对组织穿透力较强而收缩性较小，比单一，对组织穿透力较强而收缩性较小，比单独醛类固定更适合免疫组化染色。独醛类固定更适合免疫组化染色。2.2.复合固定剂复合固定剂 第22页/共51页2023/3/2623 以上介绍了免疫组织化学中常用的固定液，用于免疫组化的固定剂种类很多，不同的以上介绍了免疫组织化学中常
20、用的固定液，用于免疫组化的固定剂种类很多，不同的抗原和标本需经过反复试验，选用最佳固定液。不少学者认为，迄今尚无一种标准固定液抗原和标本需经过反复试验，选用最佳固定液。不少学者认为，迄今尚无一种标准固定液可以用于各种不同的抗原固定。而且同一固定液固定的组织，免疫组化染色标记结果可截可以用于各种不同的抗原固定。而且同一固定液固定的组织，免疫组化染色标记结果可截然不同，致使人们无所适从。然不同，致使人们无所适从。选择最佳固定液标准是：选择最佳固定液标准是：最好地保持细胞和组织的形态结最好地保持细胞和组织的形态结构。构。最大限度地保存抗原的免疫活性。一些含重金属的固定液在免疫组化技术中是禁用最大限度
21、地保存抗原的免疫活性。一些含重金属的固定液在免疫组化技术中是禁用的。实际经验告诉我们，的。实际经验告诉我们，中性缓冲福尔马林（多聚甲醛）中性缓冲福尔马林（多聚甲醛）是适应性较广泛的固定液，但固是适应性较广泛的固定液，但固定时间不宜过长。必要时，可作多种固定液对比，从而选出理想的标准固定液。定时间不宜过长。必要时，可作多种固定液对比，从而选出理想的标准固定液。第23页/共51页2023/3/2624应力求保持组织新鲜，勿使其干燥，尽快固定处理。应力求保持组织新鲜，勿使其干燥，尽快固定处理。组织块不易过大过厚，必组织块不易过大过厚，必须小于须小于2cm1.5cm0.3cm2cm1.5cm0.3cm
22、，尤其是组织块厚度必须控制在，尤其是组织块厚度必须控制在0.3cm0.3cm以内。以内。固定液固定液必须有足够的量，在体积上一般大于组织必须有足够的量，在体积上一般大于组织2020倍以上，否则组织中心固定不良影响效倍以上，否则组织中心固定不良影响效果。果。组织固定后应充分水洗，去除固定液造成的人为假象。组织固定后应充分水洗，去除固定液造成的人为假象。固定组织时应注意：固定组织时应注意：第24页/共51页2023/3/2625（三）固定方法（三）固定方法1 1浸入法（浸入法（Immersion methodImmersion method）将组织在常温下浸）将组织在常温下浸泡在固定液内，必要时可
23、在低温（泡在固定液内，必要时可在低温（44 ）环境下进行）环境下进行(乙乙醚不可入醚不可入冰箱冰箱！大火烧毁整个北大药学院；也不得！大火烧毁整个北大药学院；也不得以低碳经济为由回收酒精！大火烧毁整个重医大基以低碳经济为由回收酒精！大火烧毁整个重医大基础学院础学院)，固定时间可根据抗原的稳定性以及固定液性质，固定时间可根据抗原的稳定性以及固定液性质而定，一般在而定，一般在2-12h2-12h之间。之间。第25页/共51页2023/3/26262 2灌注法（灌注法（Irrigation methodIrrigation method）此法适用于动物实验研究此法适用于动物实验研究。自左心室插入主动脉
24、，先以。自左心室插入主动脉，先以krebskrebs或生理盐水冲冼血液或生理盐水冲冼血液后，以泵、吊筒或后，以泵、吊筒或50-100ml50-100ml注射器注入固定液。置灌注动物于注射器注入固定液。置灌注动物于44冰箱内，次日取出脑冰箱内，次日取出脑组织或其它组织。外周组织一般在灌注后组织或其它组织。外周组织一般在灌注后30min30min内取材，取组织置同一固定剂中浸入内取材，取组织置同一固定剂中浸入1-1-3h3h，然后修整组织块。有主张用冷固定剂（，然后修整组织块。有主张用冷固定剂（44 ）进行灌注。我们的体会是一般光镜）进行灌注。我们的体会是一般光镜下观察的标本，室温固定即可获满意效
25、果。应该强调，保持组织新鲜是很重要的，据报下观察的标本，室温固定即可获满意效果。应该强调，保持组织新鲜是很重要的，据报告，肽类抗原活性在断绝血液供应后告，肽类抗原活性在断绝血液供应后24h24h几乎完全丧失。几乎完全丧失。第26页/共51页2023/3/2627灌注法固定可使固定液迅速达到全身各组织。达到充分固定之目的。灌注冲灌注法固定可使固定液迅速达到全身各组织。达到充分固定之目的。灌注冲洗还能排除红细胞内假过氧化物酶的干扰。浸入法主要用于活检和手术标本，洗还能排除红细胞内假过氧化物酶的干扰。浸入法主要用于活检和手术标本，以及其它不能进行灌注的组织固定。以及其它不能进行灌注的组织固定。第27
26、页/共51页2023/3/2628三、组织切片技术应用于光镜的免疫组织化学染色的切片厚度一般要求5m左右，神经组织的研究要求切片厚度在20-100m，有利于追踪神经纤维的走行。第28页/共51页2023/3/2629德国莱卡手动切片机第29页/共51页2023/3/26301冰冻切片 冰冻切片 是免疫组织化学染色中最常用的一种切片方法。其最突出的优点是能够较完好地保存多种抗原的免疫活性，尤其是细胞表面抗原更应采用冰冻切片。新鲜的组织及已固定的组织均可作冰冻切片。第30页/共51页2023/3/2631德国莱卡冰冻切片机第31页/共51页2023/3/2632 冰冻时，组织中水份易形成冰晶，往往
27、影响抗原定位。一般认为冰晶少而大时，影响较小，冰晶小而多时，对组织结构损害较大，在含水量较多的组织中上述现象更易发生。冰晶的大小与其生长速率成正比，而与成核率（形成速率）成反比，即冰晶形成的数量愈多则愈小，对组织结构影响愈严重。因此，应尽量降低冰晶的数量。Fish认为冰冻开始时，冰晶成核率较慢，以后逐渐增加，其临界温度为-3333,从降至-43 之间，成核率急剧增加达增加，然后再减慢。基于上述理论可采取以下措施减少冰晶的形成。第32页/共51页2023/3/2633（1）速冻，使组织温度骤降，缩短从-33 -43 的时间，减少冰晶的形成。其方法有二：干冰-丙酮（酒精）法：将150-200ml丙
28、酮（酒精）装入小保温杯内，逐渐加入干冰，直至饱和呈粘稠状，再加干冰不再昌泡时，温度可达-70，用一小烧杯（50-100ml）内装异戊烷约50ml，再将烧杯缓慢置入干冰丙酮（纯酒精）饱和液内，至异戊烷温度达-70时即可使用。将组织（大小为1cm0.8cm0.5cm）投入异戊烷内速冻30-60s后取出，或置恒冷箱内以备切片，或置-80低温冰箱内贮存。第33页/共51页2023/3/2634液氮法：将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内（直径约2cm），如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮中，大约
29、10-20s组织即迅速冰结成块。取出组织冰块立即置入-80冰箱贮存备用，或置入恒冷箱切片机冰冻切片。第34页/共51页2023/3/2635（2 2）将组织置于20%-30%20%-30%蔗糖溶液1 13 3天，利用高渗吸收组织中水分，减少组织含水量。影响冰冻切片的因素较多，因此，技术难度较大，选择好的冰冻切片机是保证切片质量的关键。第35页/共51页2023/3/2636恒冷箱冰冻切片机恒冷箱冰冻切片机CryastatCryastat）：为较理想的冰冻切片机，型号很多，但其基本结构是将切片机置于为较理想的冰冻切片机，型号很多，但其基本结构是将切片机置于-30-30低温密闭室内，故切片时不受外
30、界低温密闭室内，故切片时不受外界温度和环境影响，可连续切薄片至温度和环境影响，可连续切薄片至2-4m2-4m，完全能满足免疫组织化学标记要求。切片时，低温室内温度以，完全能满足免疫组织化学标记要求。切片时，低温室内温度以-15151818为宜，温度过低组织易破碎，为宜，温度过低组织易破碎，抗卷板的位置及角度要适当抗卷板的位置及角度要适当，载玻片附贴组织切片，切勿上下移，载玻片附贴组织切片，切勿上下移动。动。第36页/共51页2023/3/2637石蜡切片石蜡切片 其优点是组织结构保存良好，在病理和回顾性研究中有较大的实用价值，能切连其优点是组织结构保存良好，在病理和回顾性研究中有较大的实用价值
31、，能切连续薄片，续薄片，组织结构清晰，抗原定位准确组织结构清晰，抗原定位准确。用于免疫组化技术的石蜡切片制备与常。用于免疫组化技术的石蜡切片制备与常规制片略有不同：规制片略有不同：脱水、透明等过程应在脱水、透明等过程应在44以下进行，以尽量减少组织抗原的以下进行，以尽量减少组织抗原的损失。损失。组织块大小应限于组织块大小应限于2cm1.5cm0.2cm2cm1.5cm0.2cm，使组织充分脱水、透明、浸蜡。，使组织充分脱水、透明、浸蜡。浸蜡、包埋过程中，石蜡应保持在浸蜡、包埋过程中，石蜡应保持在6060以下，以溶点低的软蜡最好（即低温石以下，以溶点低的软蜡最好（即低温石蜡包埋）。蜡包埋）。第3
32、7页/共51页2023/3/2638170%乙醇434h280%乙醇434h390%乙醇423h495%乙醇423h595%乙醇412h6100%乙醇41.5h7100%乙醇41.5h8二甲苯40.51h9二甲苯40.51h10石蜡601h11石蜡602h组织块脱水、透明、浸蜡时间参考表1-31-3：表 1-3 组织块处理时间表第38页/共51页2023/3/2639以上全过程为以上全过程为18-24h18-24h，也可，也可在室温内使用自动脱水机代在室温内使用自动脱水机代替。如组织块小，直径小于替。如组织块小，直径小于0.5cm0.5cm，可用快速石蜡包埋，可用快速石蜡包埋切片，全过程只需切
33、片，全过程只需4h4h左右。左右。第39页/共51页2023/3/2640石蜡切片为常规制片技术，切片机多为轮转式，切片厚度石蜡切片为常规制片技术，切片机多为轮转式，切片厚度2 27m7m，应用范围广，应用范围广，不影响抗体的穿透性，染色均匀一致。由于甲醛固定、有机熔剂和包埋剂对组抗原不影响抗体的穿透性，染色均匀一致。由于甲醛固定、有机熔剂和包埋剂对组抗原有一定的损害及遮蔽，使抗原特征发生改变。有人报告经蛋白酶消化，可以改善光有一定的损害及遮蔽，使抗原特征发生改变。有人报告经蛋白酶消化，可以改善光镜免疫组化染色强度，常用的有胰蛋白酶、链霉蛋白酶及胃蛋白酶等消化法。石蜡镜免疫组化染色强度，常用的
34、有胰蛋白酶、链霉蛋白酶及胃蛋白酶等消化法。石蜡切片应入切片应入3737恒温箱过夜，这样烤片可减少染色中脱片现象。切片如需长期贮存，恒温箱过夜，这样烤片可减少染色中脱片现象。切片如需长期贮存，可存放于可存放于44冰箱内备用。冰箱内备用。第40页/共51页2023/3/2641石蜡切片优点较多，但在制片过程中要经过石蜡切片优点较多，但在制片过程中要经过酒精、二甲苯等有机溶剂处理，组织内抗原酒精、二甲苯等有机溶剂处理，组织内抗原活性失去较多，有人采用活性失去较多，有人采用冷冻干燥包埋法冷冻干燥包埋法（Freeze drying embedding methedFreeze drying embedd
35、ing methed），），可以保存组织内可溶性物质，防止蛋白变性可以保存组织内可溶性物质，防止蛋白变性和酶的失活，从而减少了抗原的丢失。该法和酶的失活，从而减少了抗原的丢失。该法是将新鲜组织低温速冻，利用冷冻干燥机是将新鲜组织低温速冻，利用冷冻干燥机（Freezing dryerFreezing dryer）在真空、低温条件下排）在真空、低温条件下排除组织内水分除组织内水分 ，然后用甲醛蒸气固定干燥的，然后用甲醛蒸气固定干燥的组织，最后将组织浸蜡、包埋、切片。此法组织，最后将组织浸蜡、包埋、切片。此法可用于免疫荧光标记、免疫酶标记及放射自可用于免疫荧光标记、免疫酶标记及放射自显影。显影。第4
36、1页/共51页2023/3/26423 3振动切片振动切片 用振动切片机（VibratotmeVibratotme），可以把新鲜组织（不固定不冰冻）切成厚片2020100m100m，以漂浮法在反应板进行免疫组织化学染色，然后在解剖显微镜下检出免疫反应阳性部位，修整组织进行后固定，最后按电镜样品制备、脱水、包埋、超薄切片、染色观察等。组织不冰冻，无冰晶形成和组织抗原破坏，在免疫组化染色前避免了组织脱水、透明、包埋等步骤对抗原的损害，能较好地保留组织内脂溶性物质和细胞膜抗原，主要用于显示神经系统抗原分布研究。这种包埋前染色，尤其实用于免疫电镜观察。第42页/共51页2023/3/26434 4塑料
37、切片塑料切片 塑料包埋切片常用塑料包埋切片常用包埋剂有甲基丙烯酸盐类包埋剂有甲基丙烯酸盐类（Glycol methacrylate,GMAGlycol methacrylate,GMA）及环氧树脂类）及环氧树脂类（Epon 812,618Epon 812,618），其优点是可以同时作光镜和电），其优点是可以同时作光镜和电镜检测，能相互对照所查抗原，定位准确。镜检测，能相互对照所查抗原，定位准确。塑料包塑料包埋切片可切出比石蜡切片更薄的切片，光镜切片可埋切片可切出比石蜡切片更薄的切片，光镜切片可薄至薄至0.50.52um2um，故称，故称半薄切片（半薄切片（Semithin Semithin s
38、ectionsection）。GMAGMA保存抗原较好，不与组织产生共聚保存抗原较好，不与组织产生共聚合，但形态学结构欠佳。环氧树脂如合，但形态学结构欠佳。环氧树脂如FponFpon和和AralditeAraldite能较好地保存形态学结构，但在聚合过程能较好地保存形态学结构，但在聚合过程中易和组织起作用，改变抗原结构。塑料包埋切片中易和组织起作用，改变抗原结构。塑料包埋切片由于处理程序繁多，抗原活性易丢失。同时半薄切由于处理程序繁多，抗原活性易丢失。同时半薄切片进行免疫染色时，抗血清不易穿透树脂，因此，片进行免疫染色时，抗血清不易穿透树脂，因此，塑料切片主要用于免疫电镜的超微切片前定位。包塑
39、料切片主要用于免疫电镜的超微切片前定位。包埋前染色的标本，切片薄切片后不需染色，直接在埋前染色的标本，切片薄切片后不需染色，直接在相差显微镜下观察免疫反应部位呈黑点状，定位后相差显微镜下观察免疫反应部位呈黑点状，定位后进一步作超薄切片，这样，可以明显提高免疫电镜进一步作超薄切片，这样，可以明显提高免疫电镜阳性检出率。阳性检出率。第43页/共51页2023/3/26445 5超薄切片超薄切片电镜标本制作过程大致同塑料切片，应用超薄切片机（电镜标本制作过程大致同塑料切片，应用超薄切片机（UltrotomeUltrotome）进行切片。）进行切片。第44页/共51页2023/3/26456 6玻片处
40、理和涂胶玻片处理和涂胶 在免疫组化染色过程中由于各种原因常造成标本（细胞制片和组织切片）脱片现象，影响了工作质量和速在免疫组化染色过程中由于各种原因常造成标本（细胞制片和组织切片）脱片现象，影响了工作质量和速度。一般采取两种方法即可防止脱片现象出现。度。一般采取两种方法即可防止脱片现象出现。第45页/共51页2023/3/2646（1 1）载玻片和盖玻片处理：）载玻片和盖玻片处理：新载玻片上有油污，必须经过中等浓度的洗液浸泡新载玻片上有油污，必须经过中等浓度的洗液浸泡121224h24h，（时间长了发脆时间长了发脆）流水充分漂洗后用蒸馏水清洗）流水充分漂洗后用蒸馏水清洗5 5遍以上，浸泡遍以上
41、，浸泡在在95%95%酒精内酒精内2h2h，用绸布擦干或用红外线烤箱烤干均可，贮放于，用绸布擦干或用红外线烤箱烤干均可，贮放于玻片盒内备用。玻片盒内备用。盖玻片很薄，以上处理程序必须缩短，清洁液浸泡只需盖玻片很薄，以上处理程序必须缩短，清洁液浸泡只需2h2h，流，流水冲洗注意勿损伤玻片等。水冲洗注意勿损伤玻片等。第46页/共51页2023/3/2647HEHE染色的粘片剂：染色的粘片剂：蛋白甘油：取新鲜鸡蛋用镊子或针将鸡蛋的一端挑破蛋白甘油：取新鲜鸡蛋用镊子或针将鸡蛋的一端挑破1-21-2毫米的小孔，另一端挑破毫米的小孔，另一端挑破2-32-3毫米的大孔，大孔向毫米的大孔，大孔向下，让蛋清洁净
42、的容器内，加入等量的甘油，混匀后过滤，加入少许麝香草酚防腐，冰箱冷藏。下，让蛋清洁净的容器内，加入等量的甘油，混匀后过滤，加入少许麝香草酚防腐，冰箱冷藏。第47页/共51页2023/3/2648免疫组化染色的粘片剂免疫组化染色的粘片剂 多聚赖氨酸液：多聚赖氨酸多聚赖氨酸液：多聚赖氨酸0.1g0.1g，加蒸馏水，加蒸馏水10ml10ml，混合后即可涂片。此，混合后即可涂片。此液不宜多配制。液不宜多配制。3-Amino propy Eri-ethoxy Silame3-Amino propy Eri-ethoxy Silame（APESAPES）。）。铬明矾明胶，铬明矾明胶，混合后即可涂片，置混合后即可涂片，置3737温箱烤干。温箱烤干。第48页/共51页2023/3/2649第49页/共51页2023/3/2650第50页/共51页2023/3/26宁夏医科大学组胚（研究生课程）51感谢您的观看！第51页/共51页