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1、甲烷氧化菌培养条件的优化 班级：生物工程08-2班 姓名：潘启元 指导老师:朱红威摘 要1.从中国矿业大学分离筛选出甲烷氧化菌，研究在不同条件下甲烷氧化菌生长状况，结果表明；除甲烷外该菌种还可以利用葡萄糖蔗糖作为碳源，在以蔗糖为单一碳源时时甲烷氧化菌生长速度和菌体浓度都大有提高。在以蔗糖为碳源时其细胞浓度能在72H达到1.609在96H时候可以达到1.729。2.在加入橡胶颗粒的培养基中甲烷氧化菌的生长速度明显提高，在加入橡胶颗粒的比例在0.5g/ml时候其细胞浓度可高达2.590。3.当PH条件不同时，菌体的生长呈现5-6时生长较慢，6-7时较适合菌体生长其菌体的浓度为同等条件下最高值0.9
2、79，7-9时生长有所减慢。4.加入螯合剂EDTA对甲烷氧化菌的生长有明显的抑制作用，加入量越多对菌体的生长抑制越大。绪 论甲烷的温室气体效应甲烷氧化菌的生活习性甲烷氧化菌的工业价值甲烷氧化菌在煤炭开采方面的应用快速培养甲烷氧化菌的方法介绍甲烷在以1%的速度增加而80-90%的甲烷来自生物活动其分布情况、生存条件、对环境的适应甲醇合成、甲烷氧化菌素主要方法喷涂在煤层表面、灌注煤层。可以使甲烷含量降低30%-60%通过加入橡胶颗粒可以提高甲烷氧化菌的生长速度最高可达100倍甲烷氧化菌甲烷氧化菌简介甲烷氧化菌于1906年首次被分离出来，1970年Whittenbury等分离和鉴定了100多种能利用
3、甲烷的细菌。甲烷氧化菌按细胞生理学为基础分类，可以甲烷同化细菌同化细和甲烷共氧化细菌本文介绍的为甲烷菌为甲烷同化细菌，其可利用甲烷作为唯一碳源，具有完整的甲烷氧化途径。甲烷氧化菌的研究现状期望利用甲烷生产出单细胞蛋白具有明显经济效益的生产过程丙烯环氧化物的生产，其具有时候诱人的前景甲烷氧化菌能降解自然界普片存在的有毒污染物的研究甲烷氧化菌素研究报告甲烷氧化菌降解TCE和其他卤代化合物甲烷氧化菌在煤炭开采的利用方面的研究甲烷氧化菌的酶体系关键酶甲烷单加氧酶根据甲烷氧化菌利用甲醛合成细胞物质代谢途径的不同I型甲烷氧化菌(戊糖磷酸途径)型甲烷氧化菌(丝氨酸途径)存在细胞位置细胞质中，称为可溶性甲烷单
4、加氧酶(sMM0)细胞膜上，称为颗粒性甲烷单加氧酶(pMMO)。甲醇脱氢酶甲烷氧化途径的第二个酶是甲醇脱氢酶(methanol dehydrogenase，MDH)。甲烷氧化菌和另外一种自养菌一氨氧化菌在氧化底物方面具有相似之处。两种细菌都能分别氧化甲烷和氨，并且能分别从氧化甲烷和氨中获得能量。pMMO在进化上和氨氧化单氧酶(ammonia monooxygenase，AMO)密切相关，他们有高度相似性的氨基酸序列、相似的蛋白复合体结构、广泛相似的底物和相似的被抑制的特性。材料与方法法实验仪器与培养基菌种的获取方法不同条件实验操作和方法1不同碳源培养试验研究不同碳源培养试验研究2不同不同pH培
5、养条件下试验培养条件下试验3加入橡胶颗粒的实验加入橡胶颗粒的实验4加入加入EDTA的实验的实验结果与讨论不同碳源对甲烷氧化菌生长的影响1碳源浓度的确定分析表可知当碳源在0.2g/L的时候甲烷氧化菌生长速度较快，细胞浓度较高，在600nm的吸光值为0.301Abs。随着葡萄糖浓度的不断升细胞浓度呈逐渐降低的趋势，其原因是高其细胞外的物质浓度高于细胞内的浓度导致细胞内水分的减少新陈代谢速度减慢从而生长状况降低。2不同碳源对甲烷氧化菌生长状况的影响不同碳源对甲烷氧化菌生长的影响分析图24H48H72H96H00.20.40.60.811.21.41.6-0.2注：注：C1：蔗糖：蔗糖C2:葡萄糖葡萄
6、糖C3：柠柠檬酸檬酸C4：可溶性淀粉：可溶性淀粉C5：甲醇：甲醇C6：甲：甲烷烷C7：甲酸：甲酸钠钠C1C2C3C4C5C6C71.以蔗糖作为碳源的时候，甲烷氧化菌能快速的进入细胞的对数生长期，在培养48H的时候细胞浓度基本达到稳定。在72H时候C1、C2、C4、C5、C6甲烷氧化菌的细胞浓度基本都达到最高值。2.当据图分析C2、C5具有类似的生长过程，和崔俊儒等的研究有相类似之处，其研究指出甲烷氧化菌利用甲烷生成甲醇在催化剂PDM的作用下生成甲醛最后转化为二氧化碳。此过程于甲烷氧化菌利用葡萄糖的途径有相吻合之处，所以在甲醇和葡萄糖的生长曲线下二者基本平行。3.在以C3、C7为碳源的条件下甲烷
7、氧化菌基本不生长，柠檬酸和甲酸钠的存在对甲烷氧化菌或对其生长过程中的酶有着毒害作用，从而不能生长。在以C4为碳源的过程中其生长过程有一个缓冲的过程，在48H后甲烷氧化菌迅速生长其生长效果介于C1和C2之间，具有相当可观的工业生产价值。分析结果不同PH条件下甲烷氧化菌生长状况1.00000.90000.80000.70000.60000.50000.40000.30000.20000.10000.0000PH=5PH=6PH=7PH=8PH=924H甲烷平均消耗量24H细胞浓度平均值48H甲烷平均消耗量48H细胞浓度平均值72H甲烷平均消耗量72H细胞浓度平均值不同PH条件下分析1.甲烷氧化菌的
8、生长在PH5-7的时候生长状况良好，细胞的浓度于甲烷的消耗量之比远远高于PH8-9。在培养中PH为6的时候甲烷氧化菌的生长总是优于其他条件下这说明甲烷氧化菌的最适合PH为6左右。2.用 细胞浓度平均值/甲烷平均消耗量=细胞产率 在PH为8和9的时候，细胞产率小于1说明甲烷氧化菌消耗甲烷并不是在生成细胞，在环境不适合生存的条件下微生物都会合成具有繁殖传代功能的孢子类物质。3.在PH为5-7的时候细胞产率大于或等于一说明甲烷氧化菌在不断的繁殖，在0-48h内处于对数生长期，其后细胞浓度达到最大，在培养获得其代谢物质时控制其生长的PH为6左右可以获得更多的菌体。橡胶颗粒对甲烷氧化菌生长的影响1硅胶颗
9、粒对甲烷氧化菌的影响硅胶颗粒对甲烷氧化菌的影响2多孔状橡胶颗粒对甲烷氧化菌生长的影响多孔状橡胶颗粒对甲烷氧化菌生长的影响硅胶颗粒对甲烷氧化菌的影响硅胶颗粒对甲烷氧化菌的影响2.521.510.500g5g10g20g24H甲烷平均消耗量24H细胞浓度平均值48H甲烷平均消耗量48H细胞浓度平均值72H甲烷平均消耗量72H细胞浓度平均值加入橡胶颗粒实验结果分析1.实验中在不加入橡胶颗粒和加入5g时菌体的生长和一般的生物生长过程相似有适应期对数期到稳定期，在菌体进入对数期前菌体自身有着物质的准备，所以在24H时候甲烷消耗量高于细胞浓度而且十分明显。在加入橡胶颗粒为10g的时候甲烷氧化菌进入对数期的
10、开始阶段，在下一次测量时其菌体有大量增加甲烷消耗在减少。对菌体的生长甲烷消耗量的比较可知第二次甲烷消耗量比前后都要少，其原因可能是对数期前期的物质准备其中包含的能源物质的储备为后期对数期生长准备以基本能维持对数期的生长，从而在进入对数期能源物质的消耗就有所减少。2.在加入的橡胶颗粒为10g和20g的时候甲烷氧化菌生长对数期结束后大量菌体的存在对甲烷的消耗量都高于其适应期的值而此现象在不加入和加入5g的时候由于稳定期菌体的量不是增长的特别明显所以甲烷的消耗量就适应期比较而言持平或略高。3.在图中分析可知随着加入橡胶颗粒浓度的增加甲烷氧化菌进入稳定期时细胞浓度就越高更加有利于甲烷氧化菌的快速培养。
11、橡胶颗粒的加入就是在橡胶颗粒的表面形成细菌可附着的膜，而许多甲烷氧化细菌可形成荚膜和粘液等有利于其在载体表面吸附物质35，36。文献曾报道甲烷氧化细菌可吸附在载体表面形成吸附膜37,38。在实验中观测可见在橡胶颗粒的表面形成的膜呈现灰白色，有吸附膜的形成是甲烷氧化菌快速生长和有效利用甲烷必要前提。多孔状橡胶颗粒对甲烷氧化菌生长多孔状橡胶颗粒对甲烷氧化菌生长的影响的影响0g3g5g00.10.20.30.40.50.624H甲烷平均消耗量24H细胞浓度平均值48H甲烷平均消耗量48H细胞浓度平均值72H甲烷平均消耗量72H细胞浓度平均值多孔性橡胶条件下的实验结果结论：在甲在甲烷氧化菌培养的一氧化
12、菌培养的一阶段，加入多孔橡胶段，加入多孔橡胶颗粒和不加入橡胶粒和不加入橡胶颗粒粒对甲甲烷氧化菌甲氧化菌甲烷消耗量没有多消耗量没有多大的影响。在菌体的适大的影响。在菌体的适应阶段到段到对数数阶段物段物质的准的准备于甲于甲烷溶解度的多少并没有太大关系。由于多孔性的溶解度的多少并没有太大关系。由于多孔性的橡胶具有吸附作用在二三橡胶具有吸附作用在二三阶段段测量量细胞胞浓度度时加入的加入的橡胶橡胶颗粒越多其粒越多其细胞胞浓度越低但甲度越低但甲烷的消耗却比的消耗却比较高，高，实验测量烘干的橡胶量烘干的橡胶颗粒的粒的质量又增加量又增加证明甲明甲烷氧化氧化菌附着于橡胶菌附着于橡胶颗粒孔内生粒孔内生长。从甲。从
13、甲烷的消耗量分析看的消耗量分析看来加入的橡胶来加入的橡胶颗粒越多甲粒越多甲烷氧化菌的生氧化菌的生长状况越好。状况越好。由此可分析多孔性橡胶由此可分析多孔性橡胶颗粒有利于甲粒有利于甲烷氧化菌的生氧化菌的生长，但不利于用于但不利于用于获得得细胞胞类的生物培养。的生物培养。EDTA对甲烷氧化菌生长的影响0.50.450.40.350.30.250.20.150.10.05000.0050.010.0524H甲烷平均消耗量48H甲烷平均消耗量72H甲烷平均消耗量甲烷总消耗1.不加入不加入EDTA的的样品中的品中的细菌不需要菌不需要进入适入适应阶段它的培养条件和菌种的培养条件是完全段它的培养条件和菌种的
14、培养条件是完全一一样，所以其甲，所以其甲烷的消耗量呈的消耗量呈递减的减的趋势可以可以表示表示为对数期数期稳定期的消耗。定期的消耗。2.当加入螯合当加入螯合剂的的浓度度为0.5%和和1%时候甲候甲烷氧化菌本氧化菌本身要身要对新的新的环境有一个适境有一个适应的的过程，在程，在这个适个适应的的阶段完成段完成对数期生数期生长所需的物所需的物质和能量的准和能量的准备，所以其，所以其甲甲烷消耗量略小于消耗量略小于对数生数生长期，在下一个培养周期甲期，在下一个培养周期甲烷氧化菌氧化菌进入入对数生数生长期其甲期其甲烷消耗十分迅速。消耗十分迅速。EDTA影响分析3.从甲从甲烷的的总消耗量分析可知随着加入消耗量分
15、析可知随着加入EDTA量的增加甲量的增加甲烷氧氧化菌化菌细胞的生胞的生长逐逐渐减减缓，甲，甲烷总消耗随之减少。消耗随之减少。4.在在0.5%和和1%由于螯合由于螯合剂对甲甲烷氧化菌生氧化菌生长过程中程中铜离子离子的代的代谢过程有促程有促进作用，有研究作用，有研究报道，金属离子螯合道，金属离子螯合剂由由于能和于能和Fe、Co、Ni等元素形成等元素形成稳定的螯合物，定的螯合物，测量可以大量可以大大提高它大提高它们的溶解度，使得金属离子的生物可利用性提高。的溶解度，使得金属离子的生物可利用性提高。研究表明：重金属研究表明：重金属对不同微生物种群的抑制程度不一致，不同微生物种群的抑制程度不一致，它它们
16、之之间的互作效的互作效应主要包括加合作用、主要包括加合作用、协同作用和拮抗同作用和拮抗作用作用3种种类型。由于型。由于EDTA其特殊的性其特殊的性质从而影响了它在螯从而影响了它在螯合合剂效果方面的表效果方面的表现，所以其有关原理有待研究。，所以其有关原理有待研究。结论本文从甲本文从甲烷氧化菌的生氧化菌的生长条件出条件出发，对影响甲影响甲烷氧化菌氧化菌生生长代代谢的部分相关因素的部分相关因素进行分析行分析总结，参考目前甲，参考目前甲烷氧化菌的各种用途以及目前的氧化菌的各种用途以及目前的实验方法，方法，进而提出而提出优化化其培养条件的必要性和其培养条件的必要性和优化的方法。此次化的方法。此次实验分
17、离了甲分离了甲烷氧化菌氧化菌筛选出生出生长速度速度较快有利于培养的菌种，研究快有利于培养的菌种，研究分析了改菌种在碳源分析了改菌种在碳源浓度方面和碳源种度方面和碳源种类方面的性方面的性质，在碳源在碳源为0.2g/L时候而且候而且为蔗糖蔗糖时甲甲烷氧化菌生氧化菌生长最最为良好，生良好，生长周期短。在周期短。在PH方面甲方面甲烷氧化菌表氧化菌表现为略喜酸略喜酸性，最性，最为适适应的的PH为6-7，所以在工，所以在工业生生产过程中控制好程中控制好甲甲烷氧化菌生氧化菌生长的的PH是一个关是一个关键点。点。橡胶橡胶颗粒的加入粒的加入为甲甲烷氧化菌的及其相关氧化菌的及其相关产品的化工生品的化工生产带来希望
18、，来希望，加入橡胶加入橡胶颗粒甲粒甲烷氧化菌的生氧化菌的生长速度可以成倍的增加而橡胶速度可以成倍的增加而橡胶颗粒本身粒本身是高聚物，是高聚物，难被微生物利用又不易一起被微生物利用又不易一起杂菌菌污染，在培养染，在培养过后橡胶后橡胶颗粒与培养液容易分开，粒与培养液容易分开，对环境没有危害，可以境没有危害，可以说是是优化的重点。化的重点。EDTA的加入是考的加入是考虑到螯合到螯合剂的加入的加入对甲甲烷氧化菌生氧化菌生长过程中的金属元素溶程中的金属元素溶解度影响的分析，解度影响的分析，EDTA这种螯合种螯合剂的加入不利于甲的加入不利于甲烷氧化菌的生氧化菌的生长，其形成的其形成的络合物不利于甲合物不利于甲烷氧化菌更好的利用金属元素。氧化菌更好的利用金属元素。目前目前虽然甲然甲烷氧化菌氧化菌还没有形成工没有形成工业化利用，但其巨大的利用价化利用，但其巨大的利用价值潜潜力会推力会推动这一一类产业的快速的快速发展。展。谢谢各位评委老师！