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1、一、概述一、概述离子交换层析是常见的层析方式之一，它以离子交换离子交换层析是常见的层析方式之一，它以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行剂为固定相，液体为流动相的系统中进行广泛应用于氨基酸、多肽、蛋白质、糖类、核苷和有广泛应用于氨基酸、多肽、蛋白质、糖类、核苷和有机酸等的分析、制备、纯化以及溶液的脱色、中和等机酸等的分析、制备、纯化以及溶液的脱色、中和等方面方面.第1页/共51页原理：原理：离子交换剂是由离子交换剂是由基质基质、电荷基团电荷基团和和反离子反离子构构成。它在水中呈现不溶解状态，能释放成。它在水中呈现不溶解状态，能释放反离子反离子，此，此时反离子可与溶液中的其他离子或离子化
2、合物相互时反离子可与溶液中的其他离子或离子化合物相互结合，结合后本身的理化性质不发生改变。结合，结合后本身的理化性质不发生改变。羧甲基纤维素羧甲基纤维素 离子交换剂离子交换剂基质基质电荷基团电荷基团反离子反离子纤维素纤维素-O-CH-O-CH2 2-COO-COO-Na-Na+1 1、离子交换层析、离子交换层析第2页/共51页第3页/共51页离子交换树脂如何分离蛋白质洗脱树脂与树脂结合力第4页/共51页2 2、关于离子交换剂、关于离子交换剂.离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以应主要以离子交换离子交换方式进行，或借助离子交换剂方式进行，或借助
3、离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行作用进行 RB+A+RA+B+例如：例如：第5页/共51页离子交换剂应满足的基本条件：离子交换剂应满足的基本条件：有高度的不溶性。即在各种溶剂中不发生溶解 有疏松的多孔结构或巨大的表面积，使交换离子能在交换剂中进行自由扩散和交换；有较多的交换基团；有稳定的物理化学性质。在使用过程中，不因物理或化学因子的变化而发生分解和变形等现象。第6页/共51页l阳离子交换剂：阳离子交换剂：这种交换剂可以与溶液中的正电荷化合物或阳离子这种交换剂可以与溶液中的正电荷化合物或阳离子进行交换反应，根据电荷基团的强弱，可
4、分为强酸性、进行交换反应，根据电荷基团的强弱，可分为强酸性、中强酸性或弱酸性离子交换剂中强酸性或弱酸性离子交换剂l阴离子交换剂：阴离子交换剂：弱碱性、中强碱性、强碱性离子交换剂弱碱性、中强碱性、强碱性离子交换剂第7页/共51页 离离子子交交换换层层析析的的固固相相是是离离子子交交换换体体，包包括括离离子子交交换换树脂、离子交换纤维素、离子交换葡聚糖。树脂、离子交换纤维素、离子交换葡聚糖。带带有有SOSO3 3-或或COOCOO基基团团，通通常常以以SOSO3 3-NaNa 或或COOCOOH H形式出现的叫做阳离子交换基形式出现的叫做阳离子交换基；带带有有N N（C2H5C2H5）基基团团，通
5、通常常以以N N（C C2 2H H5 5）ClCl出出现现的叫做阴离子交换基的叫做阴离子交换基。1.3 离子交换层析离子交换层析第8页/共51页阳离子交换基阳离子交换基强酸性，聚苯乙烯树脂强酸性，聚苯乙烯树脂弱酸性，羧甲基纤维素弱酸性，羧甲基纤维素弱酸性，螯合作用，聚苯乙烯树脂弱酸性，螯合作用，聚苯乙烯树脂第9页/共51页阴离子交换基阴离子交换基强碱性，聚苯乙烯树脂强碱性，聚苯乙烯树脂弱碱性，二乙氨乙基纤维素弱碱性，二乙氨乙基纤维素第10页/共51页-CH2COOH离子交换剂离子交换剂 可电离基团可电离基团 可电离基团可电离基团结构结构阳离子交换剂阳离子交换剂CM-CM-纤维素（弱酸性）纤维
6、素（弱酸性）羧甲基羧甲基P-P-纤维素（中强酸性）纤维素（中强酸性）磷酸基磷酸基SE-SE-纤维素（强酸性）纤维素（强酸性）磺乙基磺乙基-O-CH2-CH2-S-OH=O=OO-P-OH=OOH阴离子交换剂阴离子交换剂AE-AE-纤维素（弱碱性）纤维素（弱碱性）氨基乙基氨基乙基 -O-CH2-CH2-NH2DEAE-DEAE-纤维素纤维素（中强碱）（中强碱）二乙基氨基乙基二乙基氨基乙基 O-CH2-CH2-NC2H5C2H5TEAE-TEAE-纤维素纤维素（强碱型）（强碱型）三乙基氨基乙基三乙基氨基乙基 O-CH2-CH2-N（C2H5）3一些常用的纤维素离子交换剂一些常用的纤维素离子交换剂第
7、11页/共51页二、离子交换剂的类型二、离子交换剂的类型在在惰性载体惰性载体上引入带有电荷的上引入带有电荷的活性基团活性基团（一）按活性功能基团带电荷性质不同（一）按活性功能基团带电荷性质不同阳离子交换剂阳离子交换剂 -带负电荷，与阳离子交换带负电荷，与阳离子交换阴离子交换剂阴离子交换剂 -带正电荷，与阴离子交换带正电荷，与阴离子交换 阴阴离离子子交交换换树树脂脂对对化化学学试试剂剂及及热热都都不不如如阳阳离离子子交交换树脂稳定。换树脂稳定。胶体第12页/共51页1.1.离子交换树脂：离子交换树脂：(1)(1)类型类型聚苯乙烯树脂：聚苯乙烯树脂：（二）按载体种类不同（二）按载体种类不同苯乙烯苯
8、乙烯二乙烯苯二乙烯苯聚苯乙烯聚苯乙烯母体母体母体母体交联剂交联剂交联剂交联剂1.1.离子交换树脂离子交换树脂2.2.离子交换纤维素离子交换纤维素3.3.离子交换凝胶离子交换凝胶第13页/共51页聚丙烯酸聚丙烯酸聚丙烯酸聚丙烯酸阳离子交换树脂阳离子交换树脂阳离子交换树脂阳离子交换树脂甲基丙烯酸甲基丙烯酸甲基丙烯酸甲基丙烯酸 二乙烯苯二乙烯苯二乙烯苯二乙烯苯特点：高交换量特点：高交换量特点：高交换量特点：高交换量 pH8 pH8 pH8 pH电电荷高者荷高者离子离子大者大者浓度浓度大者大者第19页/共51页（5 5）离子交换树脂对离子的亲和）离子交换树脂对离子的亲和力力阳离子树脂阳离子树脂电价数：
9、电价数：NaNa+CaCa+AlAl+TiTi+原子价数相同，原子序数原子价数相同，原子序数 Li Li+NaNa+KK+PbPb+阴离子树脂阴离子树脂强碱性交换树脂强碱性交换树脂CHCH3 3COOCOO-FF-OHOH-HCOOHCOO-CLCL-SCNSCN-BrBr-CrOCrO4 4=NONO3 3-II-CC2 2OO4 4=SOSO4 4=弱碱性交换树脂弱碱性交换树脂F F-Cl Cl-Br Br-=I=I-=CH=CH3 3COOMoCOOMo4 4=POPO4 4=NONO3 3-酒石酒石酸根酸根柠檬酸根柠檬酸根CC2 2OO4 4=SOSO4 4=OH4条件下使用条件下使用
10、,具有羧甲基具有羧甲基2.2.离子交换纤维素离子交换纤维素第21页/共51页3.3.离子交换凝胶离子交换凝胶分离大分子物质分离大分子物质如：葡聚糖（如：葡聚糖（SephadexSephadex）聚丙烯酰胺（聚丙烯酰胺（PAGEPAGE）琼脂糖（琼脂糖（SepharoseSepharose）第22页/共51页l 装装 柱柱l 酸碱处理酸碱处理l 平平 衡衡l 离子交换离子交换l 洗洗 脱脱l 离子交换剂再生离子交换剂再生三、离子交换层析操作过程三、离子交换层析操作过程第23页/共51页第24页/共51页离子交换层析的原理第25页/共51页1.1.离子交换剂的处理、再生和转型离子交换剂的处理、再生
11、和转型 取适量的固体离子交换剂先用水浸泡，待充分膨胀后加大量的水悬浮除去细颗粒，尔后改用酸碱浸泡酸碱浸泡，以便除去杂质和使其带上需要的反离子。疏水性离子交换剂可以用2-4倍的2mol/L NaOH或2mol/L HCl溶液处理；而亲水性离子交换剂则只能用0.5mol/L NaOH和0.5mol/L NaCl混合溶液或0.5mol/L HCl处理(室温下处理30分钟)。酸碱处理的次序决定了离子交换剂携带反离子的类型酸碱处理的次序决定了离子交换剂携带反离子的类型。在每次用酸(或碱)处理后，均应先用水洗涤至近中性，再用碱(或酸)处理。末了用水洗涤至中性，经缓冲液平衡后即可使用或装柱。第26页/共51
12、页再再 生：生：使用过的离子交换剂，可采用一定的方法使其恢复原来的性状，这一过程叫做再生。再生可以通过上述的酸、碱反复处理完成转转 型：型：指离子交换剂由一种反离子一种反离子转为另一种反离另一种反离子子的过程。比如，欲使阳离子交换剂转成钠型时，则需用NaOH处理；欲使其转成氢型时，则需用HCl处理；欲使其带铵离子时，则需用NH4OH或NH4Cl处理。第27页/共51页离子交换剂的处理长期使用过的树脂含有很多杂质，欲将其除掉，应先用沸水处理沸水处理，然后用酸、碱处理酸、碱处理。用热的稀酸、稀碱处理效果更好。树脂若含有脂溶性杂质脂溶性杂质时，可用乙醇或丙酮乙醇或丙酮处理。而长期使用过的亲水性离子交
13、换剂亲水性离子交换剂的处理一般只用酸、碱浸泡即可酸、碱浸泡即可。原则上讲，去除杂质的过程应在不破坏离子交换剂的结不破坏离子交换剂的结构和稳定性构和稳定性，不影响其原有交换容量不影响其原有交换容量的前提下进行。第28页/共51页3.3.被分离物质的交换被分离物质的交换 使用离子交换剂的方法有两种：柱层析法（动态法），即将离子交换剂装入层析柱内，让溶液连续通过。该法交换效率高，应用范围广；分批法（静态法），即将离子交换剂置入盛溶液的容器内缓慢地搅拌。该法交换率低，不能连续进行，但是，需要的设备简单，操作容易。第29页/共51页离子交换剂的交换容量离子交换剂的交换容量 柱层析法装柱的操作和要求与吸附
14、柱层析相同。离子交换剂的总用量要依据其交换容量和待吸附物质的总量(包括连续使用的全部量)来计算。当溶液含有各种杂质时，必须考虑使交换量留有充分余地，实际交换量只能按理论交换量的25%-50%计算。在样品纯度极低，或有效成分与杂质的性质相似时，则实际交换量应控制得更低些。层析柱高与直径比例一般要大于101，分离样品的成分复杂时，比例宜高一些，用于样品浓缩和脱盐时，比例可低一些。第30页/共51页 在离子交换层析过程中，常用梯度溶液进行洗脱，而溶液的梯度则是由盐浓度或酸碱度的变化形成的。4.4.被分离物质的洗脱与收被分离物质的洗脱与收集集第31页/共51页梯度混合器第32页/共51页 梯度溶液按组
15、成来分，一般有二种：一种是增加离子强度的梯度溶液。是用一简单的盐(如NaCl或KCl)溶解于稀缓冲液制成的，习惯上不用弱酸或弱碱的盐类；另一种是改变pH值的梯度溶液。该溶液是用两种不同pH值或不同缓冲容量的缓冲液制成的。对于增加离子强度的梯度溶液，不管用于何种类型的离子交换剂，其离子强度绝大部分是增加的。而改变pH值的梯度溶液则不然，如果使用的是阳离子交换剂，pH值应从低到高递增；如果使用的是阴离子交换剂，pH值应从高到低递减，实际许可的pH值范围由待分离物质的稳定pH范围和离子交换剂限制的pH范围来决定。第33页/共51页第34页/共51页 带带电电荷荷量量少少，亲亲和和力力小小的的先先被被
16、洗洗脱脱下下来来，带带电电荷荷量量多多，亲亲和和力力大大的的后被洗脱下来。后被洗脱下来。洗脱顺序第35页/共51页离子交换层析法大致分为5个步骤离子扩散到树脂表面离子扩散到树脂表面 离子通过树脂扩散到交换位置离子通过树脂扩散到交换位置 在交换位置进行离子交换；被交换的分子所带在交换位置进行离子交换；被交换的分子所带 电荷愈多，它与树脂的结合愈紧密，也就愈不电荷愈多，它与树脂的结合愈紧密，也就愈不 容易被其它离子取代容易被其它离子取代 被交换的离子扩散到树脂表面被交换的离子扩散到树脂表面 冲洗液通过，被交换的离子扩散到外部溶液中冲洗液通过，被交换的离子扩散到外部溶液中 第36页/共51页第37页
17、/共51页低盐高盐分离结束第38页/共51页四、操作注意点四、操作注意点（一）离子交换剂的选择一）离子交换剂的选择原则：原则：根根据据被被分分离离物物质质的的性性质质选选择择同同一一性性质质离离子子交交换换剂剂中中选选用用对对被被分分离离物物质质各各组组分分之之间间结合力差异大结合力差异大的型号交换剂的型号交换剂第39页/共51页1.1.被分离物质带何种被分离物质带何种电荷电荷2.2.被分离物质被分离物质分子的大小分子的大小 大分子物质选用凝胶，其次选用纤维素大分子物质选用凝胶，其次选用纤维素考虑因素：考虑因素：根据分离过程的实验条件根据分离过程的实验条件 强酸强碱强酸强碱应用广泛应用广泛 弱
18、酸型弱酸型只能在碱性范围内使用只能在碱性范围内使用 弱碱型弱碱型只能在酸性范围内使用只能在酸性范围内使用第40页/共51页3.3.被分离物质所处的环境被分离物质所处的环境4.4.被分离物质的物理化学性质被分离物质的物理化学性质5.5.被分离物质的大概数量被分离物质的大概数量第41页/共51页带电荷不同蛋白在特定pH值下有不同带电性质第42页/共51页原则原则：不不能能发发生生化化学学反反应应，避避免免使使样样品品变变性性（二）缓冲液的选择（二）缓冲液的选择第43页/共51页原则原则：所用所用洗脱液洗脱液比比吸着物质吸着物质具有具有更活泼的离子或基团更活泼的离子或基团 改变改变pHpH或离子强度
19、或离子强度 增强洗脱液与离子交换剂的结合力增强洗脱液与离子交换剂的结合力 降低分离物与离子交换剂的结合力降低分离物与离子交换剂的结合力 洗脱方式：洗脱方式：梯度洗脱梯度洗脱(三三)洗脱剂洗脱剂第44页/共51页五、应用五、应用 分分离离多多肽肽蛋蛋白白、氨氨基基酸酸、核核酸酸及及其他带电的生物分子。其他带电的生物分子。第45页/共51页阳阳离离子子交交换换层层析析过过程程离子交离子交换树脂换树脂蛋白质蛋白质高离子高离子强度洗强度洗脱液洗脱液洗高离子高离子强度洗强度洗脱液洗脱液洗加加样样平平衡衡液液洗洗收集收集第46页/共51页第47页/共51页时时时时刻刻刻刻要要要要记记记记住住住住：蛋蛋白白
20、质质是是由由氨氨基基酸酸聚聚合合形形成成的的聚聚合合物物，所所以以蛋蛋白白质质也也存存在在等等电电点点（pI），蛋蛋白白质质在在溶溶液液中中带带电电状状况况同氨基酸相同，取决于所处溶液的同氨基酸相同，取决于所处溶液的pH 值。值。当当pI pH时时，蛋蛋白白质带净正电荷。质带净正电荷。第48页/共51页思考题已知蛋白X等电点为7，设计实验利用阴离子交换树脂纯化。第49页/共51页答案：建立阴离子交换柱，比如Q-Sepharose。用pH8.5的缓冲液平衡柱子，同时蛋白X溶解于pH8.5的缓冲液中，在此pH值下蛋白X带有负电，将含有蛋白X的混合液上样，然后用起始液冲洗，蛋白X会与此柱结合，然后盐梯度洗脱。第50页/共51页感谢您的观看！第51页/共51页