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1、蛋白质的构件分子蛋白质的构件分子Protein Architecture一、氨基酸一、氨基酸第1页/共82页（一）（一）蛋白质水解蛋白质水解蛋白质和多肽的肽键可被催化水解蛋白质和多肽的肽键可被催化水解酸酸/碱碱能将蛋白能将蛋白完全水解完全水解 酶酶水解一般是水解一般是部分水解部分水解得到各种得到各种AAAA的混合的混合物物得到多肽片段和得到多肽片段和AAAA的混合物的混合物氨基酸是蛋白质的基本结构单元氨基酸是蛋白质的基本结构单元蛋白质蛋白质月示月示胨胨多肽多肽肽肽AAAA 1*104 5*103 2*103 1000 200 100 -500第2页/共82页（二）（二）氨基酸的结构氨基酸的结构
2、地球上天然形成的地球上天然形成的AA 有有300种以上。种以上。构成蛋白质的构成蛋白质的AA只有只有20余种余种，且都，且都是是-氨基酸氨基酸。第3页/共82页什么是氨基酸？什么是氨基酸？第4页/共82页第5页/共82页-C-C-C-C-COOH-C-C-C-C-COOH -C-C-C-C(NH-C-C-C-C(NH2 2)-COOH -)-COOH -氨基酸氨基酸 -C-C-C(NH-C-C-C(NH2 2)-C-COOH -)-C-COOH -氨基酸氨基酸 -C-C(NH-C-C(NH2 2)-C-C-COOH -)-C-C-COOH -氨基酸氨基酸什么是什么是-氨基酸？氨基酸？第6页/共
3、82页 大多数大多数AAAA在中性在中性pHpH时呈时呈兼性离子兼性离子状态状态:除甘氨酸外，除甘氨酸外，1919种种AAAA都具有旋光性。都具有旋光性。除胱氨酸和酪氨酸外，其余除胱氨酸和酪氨酸外，其余AAAA都能溶于水。都能溶于水。COO-NH3+第7页/共82页二、氨基酸的分类二、氨基酸的分类（一）常见的蛋白质氨基酸（一）常见的蛋白质氨基酸第8页/共82页按基的化学结构分类：按基的化学结构分类：、脂肪族、脂肪族aaaa（）中性（）中性aaaa甘氨酸甘氨酸丙氨酸丙氨酸缬氨酸缬氨酸亮氨酸亮氨酸异亮氨酸异亮氨酸第9页/共82页（2 2）含羟基或硫）含羟基或硫aaaa丝氨酸丝氨酸苏氨酸苏氨酸半胱氨
4、酸半胱氨酸甲硫氨酸甲硫氨酸第10页/共82页第11页/共82页（）酸性（）酸性aaaa及其酰胺及其酰胺天冬氨酸天冬氨酸谷氨酸谷氨酸门冬酰胺门冬酰胺谷氨酰胺谷氨酰胺第12页/共82页（）碱性（）碱性aaaa赖氨酸赖氨酸精氨酸精氨酸第13页/共82页、芳香族、芳香族aaaa苯丙氨酸苯丙氨酸酪氨酸酪氨酸色氨酸色氨酸第14页/共82页、杂环、杂环aaaa组氨酸组氨酸脯氨酸脯氨酸第15页/共82页按基的极性性质分类：按基的极性性质分类：、非极性基、非极性基aaaa丙氨酸丙氨酸缬氨酸缬氨酸亮氨酸亮氨酸异亮氨酸异亮氨酸苯丙氨酸苯丙氨酸色氨酸色氨酸甲硫氨酸甲硫氨酸脯氨酸脯氨酸第16页/共82页、不带电荷的极性
5、基、不带电荷的极性基aaaa天冬氨酸天冬氨酸谷氨酰胺谷氨酰胺半胱氨酸半胱氨酸甘氨酸甘氨酸丝氨酸丝氨酸苏氨酸苏氨酸酪氨酸酪氨酸第17页/共82页3 3、带正电荷的基、带正电荷的基aaaa赖氨酸赖氨酸精氨酸精氨酸组氨酸组氨酸第18页/共82页4 4、带负电荷的基、带负电荷的基aaaa天冬氨酸天冬氨酸谷氨酸谷氨酸第19页/共82页（二）不常见的蛋白质氨基酸（二）不常见的蛋白质氨基酸 由常见由常见aa经修饰而来。经修饰而来。脯氨酸脯氨酸4-羟脯氨酸羟脯氨酸第20页/共82页5-羟赖氨酸羟赖氨酸赖氨酸赖氨酸第21页/共82页-羧基谷氨酸羧基谷氨酸6-N-甲基赖氨酸甲基赖氨酸第22页/共82页（三）非蛋白
6、质氨基酸（三）非蛋白质氨基酸 150多种多种多是蛋白质中多是蛋白质中L型型-AA衍生物衍生物有一些是有一些是-，-，-AA有些是有些是D-型型AA第23页/共82页鸟氨酸鸟氨酸瓜氨酸瓜氨酸第24页/共82页（1）必需氨基酸包括：缬氨酸，亮氨酸、异）必需氨基酸包括：缬氨酸，亮氨酸、异亮氨酸，苏氨酸，蛋氨酸，色氨酸，苯丙氨酸、亮氨酸，苏氨酸，蛋氨酸，色氨酸，苯丙氨酸、赖氨酸赖氨酸人体必需氨基酸有八种：人体必需氨基酸有八种：Met Trp Lys Val Ile Leu Phe Thr Arg His 假假 设设 来来 写写 一一 两两 本本 书书 精精 组组 组氨酸和精氨酸虽然人体能自己合成，但效
7、率组氨酸和精氨酸虽然人体能自己合成，但效率较低，尤其在婴幼儿时期，需要由外界供给也称较低，尤其在婴幼儿时期，需要由外界供给也称为半必需氨基酸。为半必需氨基酸。（2 2）非必需氨基酸。）非必需氨基酸。按人体是否能自我合成分类按人体是否能自我合成分类第25页/共82页三、氨基酸的酸碱性质三、氨基酸的酸碱性质（一）兼性离子（一）兼性离子第26页/共82页非离子型非离子型两性离子型两性离子型第27页/共82页H3NCHCOOHR+（pHpI）H3NCHCOO-R+（pH=pI）H2NCHCOO-R（pHpI）（二）氨基酸的解离（二）氨基酸的解离PI：等电点，使蛋白质沉淀时的：等电点，使蛋白质沉淀时的P
8、H值值第28页/共82页（三）氨基酸的等电点（三）氨基酸的等电点当当溶溶液液为为某某一一pHpH值值时时，AAAA主主要要以以兼兼性性离离子子的的形形式式存存在在，分分子子中中所所含含的的正正负负电电荷荷数数目相等，净电荷为目相等，净电荷为0 0。这一。这一pHpH值即为值即为AAAA的等电点（的等电点（p pI I）。在在p pI I时，时，AAAA在电场中既不向正极也不向负极移动，即处于两性离子状态。在电场中既不向正极也不向负极移动，即处于两性离子状态。第29页/共82页Ka1*Ka2=l侧链不含离解基团的中性侧链不含离解基团的中性AAAAlpI=(pK1+pK2)/2 第30页/共82页
9、甘甘氨氨酸酸滴滴定定曲曲线线第31页/共82页对于侧链含有可解离基团的对于侧链含有可解离基团的AApI取决于两性离子两边取决于两性离子两边pK值的算术平均值值的算术平均值酸性酸性AA：pI=(pK1+pKR-COO-)/2 碱性碱性AA：pI=(pK2+pKR-NH2)/2 第32页/共82页谷谷氨氨酸酸滴滴定定曲曲线线第33页/共82页组组氨氨酸酸滴滴定定曲曲线线第34页/共82页第35页/共82页四、氨基酸的化学反应四、氨基酸的化学反应（一）一）-氨基参加的反应氨基参加的反应（二）（二）-羧基参加的反应羧基参加的反应（三）（三）-羧基和羧基和-氨基都参加的反应氨基都参加的反应（四）（四）侧
10、链侧链R R基参加的反应基参加的反应第36页/共82页（一）（一）-氨基参加的反应氨基参加的反应1.1.与亚硝酸反应与亚硝酸反应2.2.与酰化试剂反应与酰化试剂反应3.3.烃基化反应烃基化反应4.4.形成形成SchiffSchiffs s碱反碱反应应5.5.脱氨基反应脱氨基反应第37页/共82页 NH2 OH R CH COOH+HNO2 R CH COOH+H2O+N2lVan Slyke 法测氨基氮（体积）的基础。法测氨基氮（体积）的基础。lN2中的中的1/21/2为氨基氮。为氨基氮。氨基酸定量和蛋白质水解程度的测定。氨基酸定量和蛋白质水解程度的测定。第38页/共82页NO2FO2N+H2
11、NCHCOOHRNO2O2NHNCHCOOHR+HF弱碱性弱碱性DNP-氨基酸氨基酸（黄色黄色）DNFBSanger 法测定法测定N N末端氨基酸基础末端氨基酸基础第39页/共82页N=C=S +NCHCOOHHHRPITCNCNCHCOOHHHRSPTC-PTC-氨基酸氨基酸NCHRSNCCOPTH-PTH-氨基酸氨基酸pH8.3无水无水HFHF苯异硫氰酸酯苯异硫氰酸酯PITCPITC苯氨基硫甲酰衍生物苯氨基硫甲酰衍生物苯乙内硫脲衍生物苯乙内硫脲衍生物EdmanEdman降解法基础降解法基础第40页/共82页 R R COOH R COOH R COO COO C=O+H C=O+H2 2N
12、 CH C=N CH N CH C=N CH H R H R H R H R醛醛 氨基酸氨基酸 Schiffs碱碱 （西佛碱）（西佛碱）-H20+H20第41页/共82页在生物体内经在生物体内经AA氧化酶氧化酶催化催化即脱去即脱去-氨基而转变为酮酸。氨基而转变为酮酸。第42页/共82页（二）（二）-羧基参加的反应羧基参加的反应1.1.成盐或成酯反应成盐或成酯反应2.2.成酰氯反应成酰氯反应3.3.脱羧基反应脱羧基反应4.4.叠氮反应叠氮反应第43页/共82页（2 2）成酯）成酯 NH2 干燥，干燥，HCl R CH COOH+C2H5OH 回流回流 R CH COOC2H5+H2ONH3Cl保
13、护羧基保护羧基（1）与）与NaOH等形成盐等形成盐第44页/共82页 HN-保护基保护基 R CH-COOH +PCl5 HN-保护基保护基 R CH-COOCl +POCl3 +HCl保护氨基保护氨基 活化羧基活化羧基第45页/共82页 NH2 脱羧酶脱羧酶 RCH-COOH R-CH2-NH2 +CO2第46页/共82页 YNH O NH2NH2 RCHCOCH3 YNH O HNO2 RCHCNHNH2 YNH O RCHCN-N+N+2H2O 酰化氨基酸甲酯酰化氨基酸甲酯 肼肼酰化氨基酰肼酰化氨基酰肼酰化氨基酰叠氮酰化氨基酰叠氮肽的人工合成肽的人工合成第47页/共82页（三）（三）-羧
14、基和羧基和-氨基都参加的反应氨基都参加的反应1 1、与与茚三酮反应茚三酮反应 2 2、成肽成肽反应反应第48页/共82页弱酸弱酸 加热加热第49页/共82页（四）（四）侧链侧链R R基参加的反应基参加的反应1 1、TyrTyr（酪氨酸）（酪氨酸）2 2、碱性、碱性AAAA2 2、碱性、碱性AAAA3 3、带硫、带硫AAAA第50页/共82页Tyr酚基在酚基在3和和5位上易发生亲电取代反应，位上易发生亲电取代反应，如碘化和硝化如碘化和硝化黄色反应黄色反应第51页/共82页Pauly反应反应第52页/共82页His侧链咪唑基侧链咪唑基与重氮苯磺酸生与重氮苯磺酸生成橘黄色化合物成橘黄色化合物Paul
15、y反应反应第53页/共82页Arg侧链胍基与侧链胍基与环己二酮生成环己二酮生成缩合物缩合物第54页/共82页Trp侧链吲哚基能被侧链吲哚基能被N-溴代琥珀酰亚胺溴代琥珀酰亚胺氧化氧化分光光度法测定分光光度法测定Trp含量含量第55页/共82页Met侧链上甲硫基：强亲核基团与烃化试剂成锍盐侧链上甲硫基：强亲核基团与烃化试剂成锍盐保护巯基保护巯基第56页/共82页与二硫硝基苯甲酸发生硫醇与二硫硝基苯甲酸发生硫醇-二硫化物交换二硫化物交换pH8.0时时412nm最大光吸收最大光吸收分光光度法测定分光光度法测定-SH第57页/共82页Cys的巯基不稳定，易被氧化成二硫键的巯基不稳定，易被氧化成二硫键巯
16、基在有痕量的金属离子如：巯基在有痕量的金属离子如：Cu2+，Fe2+，Co2+或或Mn2+时，易被氧化时，易被氧化第58页/共82页Cys中的二硫键可被氧化剂（过甲酸）以中的二硫键可被氧化剂（过甲酸）以及还原剂（巯基化合物）打开。及还原剂（巯基化合物）打开。磺基丙氨酸磺基丙氨酸第59页/共82页第60页/共82页五、五、AAAA的光学活性和光谱性的光学活性和光谱性质质（一）（一）AA的光学活性和立体化学的光学活性和立体化学第61页/共82页L-甘油醛甘油醛D-甘油醛甘油醛第62页/共82页L-丙氨酸丙氨酸D-丙氨酸丙氨酸第63页/共82页第64页/共82页L-丙氨酸丙氨酸D-丙氨酸丙氨酸第65
17、页/共82页（二）氨基酸的光谱性质（二）氨基酸的光谱性质可见光区：无吸收可见光区：无吸收远紫外和红外区：都吸收远紫外和红外区：都吸收近紫外区（近紫外区（200400nm）：）：Tyr/Trp/Phe 原因：原因：-C=C-C=C-C=C-C=C-1、紫外吸收光谱、紫外吸收光谱第66页/共82页Trp 280nmTrp 280nmTyr 275nmTyr 275nmPhe 257nmPhe 257nm蛋白质含量测定蛋白质含量测定280nm第67页/共82页第68页/共82页、核磁共振波谱、核磁共振波谱第69页/共82页六、氨基酸混合物的分析分离六、氨基酸混合物的分析分离 利用利用AAAA成分分配
18、系数的差异成分分配系数的差异（一）分配层析法的一般原理（一）分配层析法的一般原理 第70页/共82页层析系统层析系统固定相固定相流动相流动相附着在固相上的液体附着在固相上的液体固体固体第71页/共82页 按两相所处状态分：按两相所处状态分：流动相流动相液体液体气体气体固固定定相相液液体体液液层析液液层析气液层析气液层析固固体体液固层析液固层析气固层析气固层析第72页/共82页柱柱固定相装于柱内固定相装于柱内纸纸固定相是液体，吸附在滤纸上，将样品固定相是液体，吸附在滤纸上，将样品点在纸上，用流动相展开点在纸上，用流动相展开薄层薄层将有适当粘度的固定相涂在薄板上将有适当粘度的固定相涂在薄板上薄膜薄
19、膜与纸层析相似，与纸层析相似，纸用其它高分子有机吸附剂代替纸用其它高分子有机吸附剂代替 按操作形式分：按操作形式分：第73页/共82页吸附吸附固体固体 吸附能力不同吸附能力不同分配分配液体液体 分配系数不同分配系数不同离子交换离子交换 离子交换剂离子交换剂 亲和性不同亲和性不同凝胶凝胶多孔凝胶，多孔凝胶，通过速度不同通过速度不同亲和亲和固定相只能与一种组分结合，固定相只能与一种组分结合，分开其它无亲和力的组分分开其它无亲和力的组分 按层析原理分：按层析原理分：固定相固定相 各组分对固定相各组分对固定相第74页/共82页（二）分配柱层析（二）分配柱层析 填充物为亲水性的不溶物质如纤维素、填充物为亲水性的不溶物质如纤维素、淀粉、硅胶等，收集的组分用茚三酮淀粉、硅胶等，收集的组分用茚三酮 显色定量。显色定量。第75页/共82页第76页/共82页（三）纸层析（三）纸层析（四）薄层层析（四）薄层层析第77页/共82页（五）离子交换层析（五）离子交换层析第78页/共82页（六）气液层析（六）气液层析第79页/共82页固定相支持剂颗粒细，表面积大；固定相支持剂颗粒细，表面积大；采取高压，洗脱速度快。采取高压，洗脱速度快。（七）高效液相层析（七）高效液相层析第80页/共82页Thank you!第81页/共82页感谢您的观看！第82页/共82页