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1、关于生物分析检测技术第1页，讲稿共103张，创作于星期二实时荧光定量实时荧光定量PCR仪、技术原仪、技术原理及应用理及应用一、实时荧光定量一、实时荧光定量PCR仪仪二、实时荧光定量二、实时荧光定量PCR的技术原理的技术原理1.定量与常规的差别定量与常规的差别2.荧光扩增曲线荧光扩增曲线3.荧光阈值和荧光阈值和CT值值4.熔解曲线熔解曲线5.标准曲线标准曲线 第2页，讲稿共103张，创作于星期二6.何为实时？何为实时？7.SYBRGreenI的工作原理的工作原理8.MolecularBeacons（发夹型杂交探针）的工作（发夹型杂交探针）的工作原理原理9.TaqMan（水解型杂交探针）的工作原理
2、（水解型杂交探针）的工作原理10.多色多通道技术应用多色多通道技术应用基因表达分析基因表达分析11.内标技术介绍内标技术介绍三、三、实时荧光定量实时荧光定量PCR技术的应用介绍技术的应用介绍1.医疗方面医疗方面2.研究方面研究方面3.其它方面其它方面四、荧光定量四、荧光定量PCR实验室所需仪器设备清单实验室所需仪器设备清单五、实时定量五、实时定量PCR及应用于植物分子生物学的及应用于植物分子生物学的研究研究第3页，讲稿共103张，创作于星期二一、实时荧光定量一、实时荧光定量PCR仪仪l热循环仪（热循环仪（PCR仪）仪）l荧光检测系统荧光检测系统l计算机及软件系统计算机及软件系统第4页，讲稿共1
3、03张，创作于星期二不产热的光源不产热的光源-发光二极管（发光二极管（LED）灵敏度高的检测器灵敏度高的检测器-光电倍增管（光电倍增管（PMT）优点：优点：不产热不产热-无散热装置，全封闭无散热装置，全封闭无机械转动装置无机械转动装置-抗震性强抗震性强无需经常校准，耐用无需经常校准，耐用灵敏度灵敏度高高线性范围线性范围广广第5页，讲稿共103张，创作于星期二 Opticon实时荧光定量实时荧光定量PCR仪仪荧光检测荧光检测热循环仪热循环仪光色光色:蓝色光蓝色光均一性均一性:0.4C染料染料:FAM,SYBRGreenI,MolecularbeaconsTaqManProbes精确性精确性:0.
4、3C激发光波长：激发光波长：450-495nm发射光波长发射光波长:515-545nm升降温速率升降温速率:最高最高3C/秒秒.灵敏度灵敏度:5nM的荧光素的荧光素温度梯度温度梯度:有有检测范围检测范围:100-108拷贝拷贝容量容量:96样品样品反应管反应管:0.2mL反应管反应管&96孔板孔板操作系统操作系统:WindowsNT第6页，讲稿共103张，创作于星期二第7页，讲稿共103张，创作于星期二二、实时荧光定量二、实时荧光定量PCR的技术原理的技术原理1.1.定量与常规的差别定量与常规的差别l常规常规PCR技术：对技术：对PCR扩增反应的扩增反应的终产物终产物进行定量及定性分析进行定量
5、及定性分析l定量定量PCR技术：对技术：对PCR扩增反应中扩增反应中每一个循环的产物每一个循环的产物进行定量及定性分进行定量及定性分析析第8页，讲稿共103张，创作于星期二SYBR Green I 定量原理定量原理 确定初始模板的浓度确定初始模板的浓度:初始初始DNA量越量越多多,荧光荧光达到某一值（域值）时所需要的达到某一值（域值）时所需要的循环数越少循环数越少LogLog浓度与循环数呈线性关系浓度与循环数呈线性关系：根据样品扩增根据样品扩增达到域值的循环数达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模就可计算出样品中所含的模板量板量第9页，讲稿共103张，创作于星期二实时荧光定量实时荧光定量PC
6、R技术简介技术简介实时荧光定量实时荧光定量PCR技术简介技术简介实时荧光定量实时荧光定量PCR技术简介技术简介实时荧光定量实时荧光定量PCR技术简介技术简介实时荧光实时荧光定量定量PCR：其反应体系中，引入了：其反应体系中，引入了一种一种荧光化学物质荧光化学物质，随着，随着PCR反应的进行，反应的进行，PCR反应反应产物不断累计，荧光信号强度也产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加等比例增加。每每经过一个循环，收集一个荧光强度信号经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我，这样我们就可以通过们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。从而得到
7、一条荧光扩增曲线。第10页，讲稿共103张，创作于星期二2.2.荧光扩增曲线荧光扩增曲线l荧光扩增曲线可以分三个阶段：荧光荧光扩增曲线可以分三个阶段：荧光背景信号阶背景信号阶段段，荧光信号，荧光信号指数扩增阶段指数扩增阶段和和平台期平台期。l荧光背景信号阶段荧光背景信号阶段：扩增的荧光信号被荧光背景：扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。l平台期平台期：扩增产物已：扩增产物已不再呈指数级的增加不再呈指数级的增加。PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的以根据最终的PCR产
8、物量不能计算出起始产物量不能计算出起始DNA拷贝拷贝数。数。l只有在只有在荧光信号指数扩增阶段荧光信号指数扩增阶段：PCR产物量的对产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。择在这个阶段进行定量分析。第11页，讲稿共103张，创作于星期二3.荧光阈值和荧光阈值和CT值值荧光阈值荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值个值，它可以设定在，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段荧光信号指数扩增阶段任意位置上任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省，但一般我们将荧光域值的缺省设置是设置是3-15
9、个循环个循环的的荧光信号的标准偏差的荧光信号的标准偏差的10倍倍。荧光阈值线的位置荧光阈值线的位置一般事实上一般事实上位于减去本底位于减去本底的位置上的位置上，这时的荧光信号超过了荧光背景，这时的荧光信号超过了荧光背景信号并且开始增加。信号并且开始增加。对某一样品的对某一样品的C（t）值值就定义为就定义为荧光量与荧荧光量与荧光阈值线交叉光阈值线交叉时的时的循环数循环数。即每个反应管内。即每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为数被称为CT值值（thresholdvalue）。定量荧光扩增曲线定量荧光扩增曲线是荧光量与循环数的图表。是荧光量
10、与循环数的图表。第12页，讲稿共103张，创作于星期二第13页，讲稿共103张，创作于星期二4.熔解曲线熔解曲线在在PCR结束后，我们可以根据结束后，我们可以根据变性过程中的荧光值变化变性过程中的荧光值变化绘出每个样品的绘出每个样品的熔解曲线熔解曲线。绘制熔解曲线时，绘制熔解曲线时，Real-TimePCR仪连续监测每个样仪连续监测每个样品在从品在从双链完全配对双链完全配对到到完全解链的升温过程中完全解链的升温过程中荧光荧光值的变化过程值的变化过程。不同的扩增产物因为其不同的扩增产物因为其长度长度和和GC含量含量不同不同而在而在不一不一样的温度样的温度下解链，当下解链，当产物解链时，产物解链时
11、，SYBRGreen的荧的荧光值将降低光值将降低并被仪器监测到。由此绘制出并被仪器监测到。由此绘制出荧光强度荧光强度随温度变化随温度变化的的负一次倒数图负一次倒数图。荧光强度变化的拐点（熔点，荧光强度变化的拐点（熔点，Tm）即为即为熔解峰值熔解峰值。熔解曲线是扩增反应的熔解曲线是扩增反应的质控途径质控途径，当图中，当图中没有没有出现出现杂峰杂峰，也未出现，也未出现主峰的异常增宽主峰的异常增宽：表明实验中：表明实验中未出现未出现污污染染、引物二聚体引物二聚体和和非特异性扩增非特异性扩增。第14页，讲稿共103张，创作于星期二第15页，讲稿共103张，创作于星期二第16页，讲稿共103张，创作于星
12、期二5.标准曲线标准曲线CT值与起始模板的关系值与起始模板的关系研究表明，研究表明，每个模板的每个模板的CT值与该模板的起始拷值与该模板的起始拷贝数的对数贝数的对数存在存在线性关线性关系系：起始拷贝数越多，起始拷贝数越多，CT值越小值越小。利用利用已知起始拷贝数的已知起始拷贝数的标准品标准品可作出标准曲线，可作出标准曲线，其中其中横坐标代表横坐标代表CT值，值，纵坐标代表起始拷贝数纵坐标代表起始拷贝数的对数的对数（如图（如图3所示）。所示）。因些因些只要获得未知样品只要获得未知样品的的CT值值，即可从标准曲，即可从标准曲线上计算出线上计算出该样品的起该样品的起始拷贝数始拷贝数。第17页，讲稿共
13、103张，创作于星期二lThistechnologyisverysensitiveinthatitisabletodetectsinglecopiesofgenesandrequiresverylittlestartingmaterialacrossawidespectrumofconditions.lThesystemmonitorsPCRateachcycleofareaction,andestimatesthecyclewhenthereactionreacheslogphaseincrements(whenthemostusefulquantitativeinformationabou
14、tthesampleisavailable)lQuantitationcanberelativetoaninternalstandardsuchasahousekeepinggene,orabsolutewhencomparedtoastandardcurvegeneratedfromknownconcentrations.第18页，讲稿共103张，创作于星期二6.何为实时？何为实时？试剂方面：试剂方面：如何做到如何做到相对荧光强度反应的是相对荧光强度反应的是PCR产物的产物的相对相对量；如何做到量；如何做到相对荧光强度相对荧光强度反应的是反应的是特定特定PCR产物产物的的相对量相对量；仪器方
15、面：仪器方面：如何如何测定相对荧光强度测定相对荧光强度Opticon实时荧光定量实实时荧光定量实PCR仪试剂仪试剂工作原理工作原理l工作原理工作原理l哪一步可以观察到荧光信号？哪一步可以观察到荧光信号？变性；复性；延变性；复性；延伸伸l应用应用第19页，讲稿共103张，创作于星期二第20页，讲稿共103张，创作于星期二第21页，讲稿共103张，创作于星期二7.SYBRGreenI的工作原理的工作原理lSYBRGreenI结合到结合到双链双链DNA的小沟部的小沟部lSYBRGreenI染料只有和染料只有和双链双链DNA结合后才发荧结合后才发荧光。光。lSYBRGreen的的最大吸收波长最大吸收波
16、长约为约为497nm，发发射波长射波长最大约为最大约为520nm。l在在PCR反应体系中，加入过量反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，荧光染料，SYBR荧光染料荧光染料特异性地掺入特异性地掺入DNA双链双链后，发射强后，发射强荧光信号荧光信号;而而不掺入不掺入链中的链中的SYBR染料分子染料分子仅有微弱仅有微弱荧光信号背景荧光信号背景，从而保证，从而保证荧光信号的增加与荧光信号的增加与PCR产产物的增加同步物的增加同步。l变性：无荧光信号，未结合变性：无荧光信号，未结合SYBRGreenIDyel通过产物的通过产物的Tm值值来来确定产物确定产物第22页，讲稿共103张，创作于星期二第23页，
17、讲稿共103张，创作于星期二第24页，讲稿共103张，创作于星期二第25页，讲稿共103张，创作于星期二第26页，讲稿共103张，创作于星期二SYBRGreen的特点的特点由于它与所有的双链由于它与所有的双链DNA相结合，不必因为模板不相结合，不必因为模板不同而特别定制，因此同而特别定制，因此通用性好通用性好，且，且价格相对较低价格相对较低。利用利用荧光染料可以指示双链荧光染料可以指示双链DNA熔点熔点的性质，通过熔的性质，通过熔点曲线分析可以点曲线分析可以识别扩增产物识别扩增产物和和引物二聚体引物二聚体，因而可，因而可以以区分非特异扩增区分非特异扩增。此外，由于一个此外，由于一个PCR产物可
18、以与多个分子的染料结合，产物可以与多个分子的染料结合，因此因此SYBRGreen的检测的检测灵敏度很高灵敏度很高。但是，由于但是，由于SYBRGreen与所有的双链与所有的双链DNA相结合，相结合，因此由因此由引物二聚体、单链二级结构引物二聚体、单链二级结构以及以及错误的扩增产物错误的扩增产物引起的引起的假阳性假阳性会影响定量的精确性。会影响定量的精确性。通过测量通过测量升高温度后荧光的变化升高温度后荧光的变化可以可以帮助降低非特异帮助降低非特异产物的影响产物的影响。由熔解曲线来分析产物的均一性由熔解曲线来分析产物的均一性有助于有助于更更准确地准确地分析分析SYBRGreenI。第27页，讲稿
19、共103张，创作于星期二第28页，讲稿共103张，创作于星期二CYBRGreenI 的应用范围及优缺点的应用范围及优缺点起始模板浓度定量起始模板浓度定量融解曲线分析：可区分单一产物、变异产物、多种产物融解曲线分析：可区分单一产物、变异产物、多种产物和（或）引物二聚体和（或）引物二聚体基因型分析基因型分析l使用方便：不必设计复杂的引物使用方便：不必设计复杂的引物l没有序列特异性：可以用于不同的模板没有序列特异性：可以用于不同的模板l便宜便宜l灵敏灵敏l与与非特异性产物非特异性产物结合结合第29页，讲稿共103张，创作于星期二8.MolecularBeacons（发夹型杂交探针）的工作原理发夹型杂
20、交探针）的工作原理原理：荧光谐振能量传递（原理：荧光谐振能量传递（FRET）l环环与与目标序列目标序列完全配对完全配对l茎茎由由互补配对的序列互补配对的序列组成组成l变性变性:产生产生非特异性非特异性的荧光的荧光l延伸延伸:没有没有荧光荧光第30页，讲稿共103张，创作于星期二第31页，讲稿共103张，创作于星期二第32页，讲稿共103张，创作于星期二l分子分子Beacons是一种在是一种在靶靶DNA不存在不存在时形成时形成茎环结构茎环结构的的双标记寡核苷酸探针双标记寡核苷酸探针。l在此在此发夹结构发夹结构中：位于分子一端的荧光基团中：位于分子一端的荧光基团与分子另一端的淬灭基团紧紧与分子另一
21、端的淬灭基团紧紧靠近靠近。l在此结构中，在此结构中，荧光基团被激发后荧光基团被激发后不是产生光不是产生光子子，而是将，而是将能量传递给淬灭剂能量传递给淬灭剂，这一过程称，这一过程称为为荧光谐振能量传递（荧光谐振能量传递（FRET）。第33页，讲稿共103张，创作于星期二分子信标的结构：是一个具有分子信标的结构：是一个具有茎环茎环（loop-stem）结构的）结构的寡核苷酸探针寡核苷酸探针，通常，通常有有2535个核苷酸，两端分别标上一个个核苷酸，两端分别标上一个荧荧光基团和淬灭基团光基团和淬灭基团。分子分子Beacons的茎环结构中，的茎环结构中，环环的部分用于的部分用于与靶序列杂交与靶序列杂
22、交（与目标序列互补），通常（与目标序列互补），通常由由1530个核苷酸组成，要求个核苷酸组成，要求与靶序列杂与靶序列杂交后交后能形成能形成与探针靶序列与探针靶序列双螺旋双螺旋有关的有关的反式构型反式构型，并，并使干的部分打开使干的部分打开，尽量得使，尽量得使荧光基团和淬灭基团分开荧光基团和淬灭基团分开足够的距离足够的距离。一般一般茎茎（干干的部分）一般的部分）一般5-8个核苷酸长个核苷酸长（碱基对），并（碱基对），并相互配对相互配对形成茎的结构。形成茎的结构。第34页，讲稿共103张，创作于星期二l荧光基团荧光基团连接在连接在茎臂的一端茎臂的一端，一般连在，一般连在5端端；而；而淬灭基团淬灭基
23、团一般连在一般连在3端端。l通常用通常用4-（4-二甲基氨基偶氮苯基）苯甲酸二甲基氨基偶氮苯基）苯甲酸（DABCYL）作为）作为淬灭基团淬灭基团。l分子分子Beacons必须非常仔细的设计，以致于在必须非常仔细的设计，以致于在复复性温度性温度下：下：l模板不存在模板不存在时形成时形成茎环结构茎环结构；l模板存在模板存在时则时则与模板配对与模板配对。l自由状态自由状态时，分子信标呈时，分子信标呈发夹型结构发夹型结构，荧光基，荧光基团和淬灭基团靠得团和淬灭基团靠得很近很近，二者之间发生，二者之间发生能量转移能量转移（FRET和和直接能量转移直接能量转移），荧光基团的能量被淬），荧光基团的能量被淬灭
24、基团吸收并以灭基团吸收并以热热的形式散发，荧光几乎完全的形式散发，荧光几乎完全被猝被猝灭灭。第35页，讲稿共103张，创作于星期二当有当有靶序列存在靶序列存在的时候，靶序列和分子信的时候，靶序列和分子信标的探针序列杂交形成有一定刚性的标的探针序列杂交形成有一定刚性的双螺双螺旋结构旋结构，导致分子信标的，导致分子信标的构象改变构象改变，干干的的部分打开，荧光基团与猝灭基团部分打开，荧光基团与猝灭基团分开分开，二，二者之间的能量转移终止；者之间的能量转移终止；在有在有相应的单色光激活相应的单色光激活时，荧光基团发出时，荧光基团发出荧光。荧光强度与溶液中荧光。荧光强度与溶液中靶序列的多少靶序列的多少
25、成成正比，通过检测正比，通过检测荧光的强度荧光的强度就可以计算出就可以计算出靶序列的量。靶序列的量。Beacons与模板配对与模板配对后：后：分子分子Beacons的构的构象改变象改变使得使得荧光基团与淬灭剂分开荧光基团与淬灭剂分开；当荧；当荧光基团被激发时，它发出光基团被激发时，它发出自身波长自身波长的的光子光子。第36页，讲稿共103张，创作于星期二分子分子Beacons不同于不同于SYBRGreen的一个的一个优点就是它优点就是它特异性地检测感兴趣特异性地检测感兴趣的的目标目标DNA。通过通过精心设计分子精心设计分子Beacons和和优化反应条优化反应条件件（温度和缓冲液）后，其灵敏度非
26、常（温度和缓冲液）后，其灵敏度非常高，可用于高，可用于单核苷酸多态性单核苷酸多态性（SNPs）的）的检测。检测。但是，为检测某一特定的目标但是，为检测某一特定的目标DNA，每每一个探针都必须一个探针都必须单独仔细地设计单独仔细地设计。分子分子Beacons是美国纽约公共健康研究学是美国纽约公共健康研究学会的技术专利。会的技术专利。第37页，讲稿共103张，创作于星期二第38页，讲稿共103张，创作于星期二第39页，讲稿共103张，创作于星期二第40页，讲稿共103张，创作于星期二MolecularBeacons 的应用范围及优缺点的应用范围及优缺点 定量起始模板浓度定量起始模板浓度基因型分析基
27、因型分析鉴定产物鉴定产物单核苷酸多态性（单核苷酸多态性（SNP）检测检测l对目标序列有对目标序列有很高的特异性很高的特异性，用于，用于SNP检测的最灵敏的检测的最灵敏的试剂之一试剂之一l荧光背景荧光背景低低l设计设计困难困难l无终点分析功能无终点分析功能l只能用于只能用于一个特定的目标一个特定的目标l价格较价格较高高第41页，讲稿共103张，创作于星期二9.TaqMan（水解型杂交探针）的工作原理水解型杂交探针）的工作原理目标特异性探针目标特异性探针5为荧光素，为荧光素，3为淬灭剂为淬灭剂模板和探针杂交模板和探针杂交延伸延伸:聚合反应，聚合反应，Taq酶切下酶切下5端荧光端荧光素素出出现荧光现
28、荧光第42页，讲稿共103张，创作于星期二第43页，讲稿共103张，创作于星期二第44页，讲稿共103张，创作于星期二第45页，讲稿共103张，创作于星期二第46页，讲稿共103张，创作于星期二第47页，讲稿共103张，创作于星期二第48页，讲稿共103张，创作于星期二TaqMan(水解型杂交探针水解型杂交探针)的的应用范围及优缺点应用范围及优缺点 定量起始模板浓度定量起始模板浓度基因型分析基因型分析产物鉴定产物鉴定SNP分析分析l对目标序列有对目标序列有很高的特异性很高的特异性,特别适合于特别适合于SNP检测检测l与与MolecularBeacons相比，相比，设计相对简单设计相对简单l价格
29、较价格较高高l只适合于一个只适合于一个特定的目标特定的目标l不能不能进行融解曲线分析进行融解曲线分析第49页，讲稿共103张，创作于星期二QuantitativeReal-TimePolymeraseChainReactionfortheCoreFacilityUsingTaqManandthePerkin-Elmer/AppliedBiosystemsDivision7700SequenceDetectorDeborah S.GroveNucleic Acid Facility,Life Science Consortium,The Pennsylvania State University
30、,University Park,PA 16802第50页，讲稿共103张，创作于星期二ProbelAprobe(ie,TaqMan)isdesignedtoannealtothetargetsequencebetweenthetraditionalforwardandreverseprimers.lTheprobeislabeledatthe5endwithareporterfluorochrome(usually6-carboxyfluorescein6-FAM，6-羧基荧光素羧基荧光素)andaquencherfluorochrome(6-carboxy-tetramethyl-rhod
31、amineTAMRA,6-羧基羧基-四甲基四甲基-若丹明若丹明)addedatanyTpositionoratthe3end.lTheprobeisdesignedtohaveahigherTmthantheprimers,andduringtheextensionphase,theprobemustbe100%hybridizedforsuccessoftheassay.第51页，讲稿共103张，创作于星期二PrinciplelAslongasbothfluorochromesareontheprobe,thequenchermoleculestopsallfluorescencebythe
32、reporter.lHowever,asTaqpolymeraseextendstheprimer,theintrinsic（内在的，固有的）（内在的，固有的）5to3nucleaseactivityofTaqdegradestheprobe,releasingthereporterfluorochrome.lTheamountoffluorescencereleasedduringtheamplificationcycleisproportionaltotheamountofproductgeneratedineachcycle.第52页，讲稿共103张，创作于星期二Fluorogenic5
33、nucleasechemistry.(1)ForwardandreverseprimersareextendedwithTaqpolymeraseasinatraditionalPCRreaction.Aprobewithtwofluorescentdyesattachedannealstothegenesequencebetweenthetwoprimers.(2)Asthepolymeraseextendstheprimer,theprobeisdisplaced.(3)Aninherentnucleaseactivityinthepolymerasecleavesthereporterd
34、yefromtheprobe.(4)Afterreleaseofthereporterdyefromthequencher,afluorescentsignalisgenerated.第53页，讲稿共103张，创作于星期二lThesensitivityofdetectionallowsacquisitionofdatawhenPCRamplificationisstillintheexponentialphase.lThisisdeterminedbyidentifyingthecyclenumberatwhichthereporterdyeemissionintensitiesrisesab
35、ovebackgroundnoise;thiscyclenumberiscalledthethresholdcycle(Ct).lTheCtisdeterminedatthemostexponentialphaseofthereactionandismorereliable.lTheCtisinverselyproportionaltothecopynumberofthetargettemplate;thehigherthetemplateconcentration,thelowerthethresholdcyclemeasured.第54页，讲稿共103张，创作于星期二Oneofthevie
36、wsavailableaftercompletionoftherunisanamplificationwindow.Thiswindowshowstheamountoffluorescenceobtainedineachamplificationcycleforeachreaction.Thethresholdcycle(Ct)isshownbythedarkerhorizontalline.第55页，讲稿共103张，创作于星期二AdvantagelProvidesanaccuratemethodfordeterminationoflevelsofspecificDNAandRNAsequen
37、cesintissuesamples.lBasedondetectionofafluorescentsignalproducedproportionallyduringamplificationofaPCRproduct.lTurn-aroundtimefordataacquisitionandanalysisisshort,lResultsaremorereliablethanbytraditionalPCRmethods.lSybrgreenIdetectionislessexpensiveandnosequencespecificprobeisrequired.lUserswillals
38、oneedtopurchaseflat-top,opticalcapsor0.2mmthermalmicrosealfilmfortheirplates.Allotherplatesandcapswillnotworkwiththenewmachines.第56页，讲稿共103张，创作于星期二ApplicationsTheapplicationsforquantitativereal-timePCRareinnumerable（数不清的）（数不清的）.lDetectionofgenomicorviralDNAintissuescanbeavaluablediagnostictool.lGene
39、expressioncanbemeasuredafterextractionoftotalRNAandpreparationofcDNAbyareversetranscription(RT)step.lSetupandanalysisaresimpleandcanmoreeasilybeextendedtotheclinicalenvironmentthantraditionalPCRtechniques.lAnallelicdiscriminationassaythatcandetectsingle-basenucleotidemutationsandpolymorphisms.第57页，讲
40、稿共103张，创作于星期二Allelic(等位基因的等位基因的)discriminationassaylTheseassaysrequiretwoseparateprobesthatdifferonlybyonebasemismatch.lOneprobelabeledwith6-FAM(6-6-羧基荧光素羧基荧光素)representsoneallele（等位基因）（等位基因）,andtheotherprobelabeledwiththefluorochromeVICrepresentstheotherallele.lAmismatchleadstoalessefficientamplifi
41、cation.Fluorescencespectraarecollectedaftertherun,andusingmulticomponentanalysis,thesoftwareextractsthecontributionofeachcomponentdyetotheobservedspectrum.第58页，讲稿共103张，创作于星期二uHomozygotesforFAMshowanincreaseintheFAMsignalbutnoincreaseintheVICsignal,andhomozygotesfortheVICprobeshowanincreaseinthatsign
42、al.Heterozygotes（杂合子）（杂合子）showintermediateincreasesofFAMandVICsignals.uAllthreegroupsareclearlydistinguishable,andthesensitivityissimilartothatforthequantitativePCRapplication第59页，讲稿共103张，创作于星期二 10.10.多色多通道技术应用多色多通道技术应用 基因表达分析基因表达分析第60页，讲稿共103张，创作于星期二第61页，讲稿共103张，创作于星期二第62页，讲稿共103张，创作于星期二第63页，讲稿共103
43、张，创作于星期二PRIMERANDPROBEDESIGNPrimersandprobesmustbecarefullydesignedbecauseofthecostsassociatedwithproducingprobeswithdifferentdyesat5and3ends.lPE/ABDPrimerExpresssoftware,whichisspecificallydesignedtoselecttheprimersandprobes.Therequiredparametersforwell-designedprimersandprobehavebeenwellbuiltintot
44、heprogram.lTheseparametersincludeaTmfortheprobethatis10Chigherthantheprimers,primerTmisbetween58Cand60C,ampliconsizebetween50and150bases,absenceof5Gs.第64页，讲稿共103张，创作于星期二nPrimerandprobedesignisdifferentfortheallelicdiscriminationassays.Theprobesdesignedforeachalleleshouldbecenteredoverthemismatchedba
45、se,andtheprobesonlyhavetodifferbythatbase.nAnothermajordifferenceisthattheprobefortheseassayshasalowerTmrequirementthantheTaqManPCRassays.第65页，讲稿共103张，创作于星期二PrescreeningassaySYBRGreencanbeusedasaprobelessalternativetotheTaqMansystem.Becauseitbindstoalldouble-strandedDNA,itisimperativetoensurethatthe
46、PCRproductbeingquantifiedisaclean,singleproduct,becauseanyprimer-dimersorbackgroundsmearsaredetected.Itcanbeusedasaprescreeningassaybeforeorderingaprobe.Iftheresultsaresatisfactory,theprobecanbeorderedandTaqManreactionsrunwithhigherspecificity.第66页，讲稿共103张，创作于星期二 11.内标技术介绍内标技术介绍第67页，讲稿共103张，创作于星期二第6
47、8页，讲稿共103张，创作于星期二第69页，讲稿共103张，创作于星期二 三、三、实时荧光定量实时荧光定量PCR技术的技术的应用介绍应用介绍第70页，讲稿共103张，创作于星期二荧光定量荧光定量PCR技术的应用技术的应用对对DNA、RNA样品进行定量和定性分析样品进行定量和定性分析l定量分析包括定量分析包括绝对定量绝对定量分析和分析和相对定量相对定量分析。分析。l前者可以得到前者可以得到某个样本中基因的某个样本中基因的拷贝数拷贝数和和浓浓度；度；l后者可以对后者可以对不同方式处理的两个样本不同方式处理的两个样本中的中的基基因表达水平因表达水平进行进行比较比较。l可以可以不定期不定期对对PCR产
48、物或样品进行产物或样品进行定性分析定性分析如：如：l利用利用熔解曲线熔解曲线分析识别分析识别扩增产物扩增产物和和引物二聚引物二聚体体，以，以区分非特异扩增区分非特异扩增；l利用利用特异性探针特异性探针进行进行基因型分析基因型分析及及SNP检测检测等。等。第71页，讲稿共103张，创作于星期二目前实时荧光目前实时荧光PCR技术已经被广泛应用技术已经被广泛应用于于基础科学研究基础科学研究、临床诊断临床诊断、疾病研究疾病研究及及药物研发药物研发等领域。其中最主要的应用等领域。其中最主要的应用集中在以下几个方面：集中在以下几个方面：比较经过比较经过不同处理样本不同处理样本之间之间特定基因特定基因的的表
49、达差异（如表达差异（如药物处理药物处理、物理处理物理处理、化化学处理学处理等），及等），及特定基因特定基因在在不同相不同相的表的表达差异；达差异；比较比较正常组织正常组织与与病理组织病理组织中各种中各种mRNA表达量差异；表达量差异；验证验证基因芯片基因芯片实验结果；实验结果；验证验证RNA干扰干扰实验结果。实验结果。第72页，讲稿共103张，创作于星期二第73页，讲稿共103张，创作于星期二第74页，讲稿共103张，创作于星期二第75页，讲稿共103张，创作于星期二第76页，讲稿共103张，创作于星期二第77页，讲稿共103张，创作于星期二四、荧光定量四、荧光定量PCR PCR 实验室实验室
50、所需仪器设备清单所需仪器设备清单l专用工作服和工作鞋l专用办公用品l一次性手套、一次性吸水纸l微量加样器一套（覆盖11000ul）以上物品各一套以上物品各一套。l28和-20或-80冰箱l混匀器l耐高压处理的离心管和加样器吸头(带滤心）l高速台式冷冻离心机第78页，讲稿共103张，创作于星期二五、实时定量五、实时定量PCR PCR 及应用于及应用于植物分子生物学的研究植物分子生物学的研究lMicroarray最强大的功能是最强大的功能是平行分析平行分析，在单次实验中同，在单次实验中同时观察时观察上万种上万种RNA的相对量变，也因为的相对量变，也因为平行处理平行处理之故，无之故，无法对每一个法对