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1、血清学反应凝集反应凝集反应沉淀反应沉淀反应 中和反应中和反应补体结合反应补体结合反应免疫标记技术免疫学检验主要内容免疫细胞检测TCTCBCBCNKCNKCMM、中性粒细胞中性粒细胞酶标记技术酶标记技术金标记技术金标记技术荧光标记技术荧光标记技术同位素标记技术同位素标记技术 其它技术化学发光免疫技术化学发光免疫技术免疫比浊分析技术免疫比浊分析技术其它其它第1页/共27页抗原抗体的总体原理抗原抗体的总体原理 根据抗原抗体的反应有特异性，根据抗原抗体的反应有特异性，可用已知抗原测定未知抗体；可用已知抗原测定未知抗体；也可用已知抗体测定未知抗原。也可用已知抗体测定未知抗原。抗原抗体反应特点抗原抗体反应
2、特点 1.1.特异性特异性 2.2.可逆性可逆性 3.3.可见性可见性 4.4.阶段性阶段性血清学反应条件血清学反应条件 1.1.电解质电解质 2.PH 2.PH 3.3.温度温度抗人血清？第2页/共27页根据抗原抗体反应的方式和特性分为根据抗原抗体反应的方式和特性分为:双向免疫扩散双向免疫扩散 对流免疫电泳对流免疫电泳 单向免疫扩散单向免疫扩散 免疫电泳免疫电泳 火箭电泳火箭电泳 沉淀反应类型环状沉淀环状沉淀 絮状沉淀絮状沉淀琼脂扩散琼脂扩散 荚膜膨胀荚膜膨胀第3页/共27页对流免疫电泳对流免疫电泳双向琼脂扩散双向琼脂扩散示教：示教：单向琼脂扩散单向琼脂扩散火箭免疫电泳火箭免疫电泳免疫电泳免
3、疫电泳环状沉淀环状沉淀 实验内容第4页/共27页一、目的 掌握对流免疫电泳与双向琼脂扩散的掌握对流免疫电泳与双向琼脂扩散的操作步骤，结果观察及实际应用。并在此操作步骤，结果观察及实际应用。并在此基础上了解各类琼脂扩散试验的特点。基础上了解各类琼脂扩散试验的特点。第5页/共27页 二、原理1.总试验原理：总试验原理：沉淀反应是指可溶性抗沉淀反应是指可溶性抗原与相应抗体在一定条件下发生结合并出原与相应抗体在一定条件下发生结合并出现肉眼可见的沉淀物。现肉眼可见的沉淀物。2.2.双向免疫扩散试验原理：双向免疫扩散试验原理：可溶性抗原可溶性抗原与相应抗体在琼脂介质中相互扩散，当扩与相应抗体在琼脂介质中相
4、互扩散，当扩散到两者浓度比例合适的部位相遇时，即散到两者浓度比例合适的部位相遇时，即出现乳白色的沉淀线。出现乳白色的沉淀线。AgAb第6页/共27页 用用已已知知抗抗血血清清（或或抗抗原原）检检测测未未知知抗抗原原（或抗体）；（或抗体）；抗原或抗体的纯度鉴定；抗原或抗体的纯度鉴定；抗原或抗体相对量的估计。抗原或抗体相对量的估计。1:21:4 1:8 1:16双向琼脂扩散的用途第7页/共27页第8页/共27页沉淀线形成的位置与抗原、抗体浓度有关，抗原浓度越浓，形沉淀线形成的位置与抗原、抗体浓度有关，抗原浓度越浓，形成的沉淀线距离抗原孔越远，抗体浓度越浓，形成的沉淀线距成的沉淀线距离抗原孔越远，抗
5、体浓度越浓，形成的沉淀线距抗体孔越远，因此，当固定抗体的浓度，稀释抗原，可根据已抗体孔越远，因此，当固定抗体的浓度，稀释抗原，可根据已知浓度的抗原沉淀线的位置，测定未知抗原的浓度；反之固定知浓度的抗原沉淀线的位置，测定未知抗原的浓度；反之固定抗原的浓度，亦可测定抗体的效价。抗原的浓度，亦可测定抗体的效价。第11页/共27页3.3.对流免疫电泳对流免疫电泳原理原理 抗原在抗原在P PH H8.68.6的缓冲液中带负电荷的缓冲液中带负电荷，将，将 抗原抗原置于阴极端，由阴极向阳极移动；置于阴极端，由阴极向阳极移动；抗体因抗体因电渗电渗作用而流向阴极。当抗原抗体作用而流向阴极。当抗原抗体在两孔间相遇
6、时，在两者比例适当处形成在两孔间相遇时，在两者比例适当处形成白色沉淀线。白色沉淀线。特点：特点：简便、快速、短时简便、快速、短时间出结果，敏感性高于双间出结果，敏感性高于双扩扩5-10 5-10 倍。倍。用途：用途：抗原、抗体的测定抗原、抗体的测定第13页/共27页 三、材料人血清（人血清（Ag）抗人血清抗人血清(Ab)PH8.6巴比妥缓冲液巴比妥缓冲液生理盐水生理盐水琼脂粉、玻片琼脂粉、玻片打孔器打孔器加样器、电泳仪等。加样器、电泳仪等。第14页/共27页 四、方法 1.1.配制配制1%1%琼脂：琼脂：称取琼脂称取琼脂0.5g +0.5g +巴比妥缓冲巴比妥缓冲液50ml对流免疫电泳加热溶解
7、第15页/共27页 四、方法 2.2.配制琼脂板配制琼脂板:倾入倾入3.53.54ml4ml加热琼脂加热琼脂/片片3.3.在琼脂在琼脂板板上打孔：孔径上打孔：孔径3 3、抗原、抗体孔间、抗原、抗体孔间 距距5 5，抗原孔间距，抗原孔间距2 2。4.4.加样：加样：(见图样见图样)5.5.电泳：将琼脂板放入电泳槽、抗体端接阳极，电泳：将琼脂板放入电泳槽、抗体端接阳极，纱布做引桥，电流为纱布做引桥，电流为3 34mA/4mA/（玻片宽度）（玻片宽度）电泳电泳404050min50min。对流免疫电泳琼脂板厚度3mm第16页/共27页 四、方法 1.1.配制配制1%1%琼脂：琼脂：称取琼脂称取琼脂0
8、.5g +0.5g +生理盐水生理盐水50ml双向免疫扩散加热溶解加热溶解第17页/共27页 四、方法 2.2.制板：制板：3.53.5-4.ml-4.ml加热琼脂加热琼脂/片片 3.3.在琼脂上打孔在琼脂上打孔：4.4.加加样：中间加入抗原、周围加稀释的抗体样：中间加入抗原、周围加稀释的抗体5.5.放室温放室温2424小时看结果小时看结果双向免疫扩散双向免疫扩散AbAg 1:21:41:81:16 1:32 1:64 注意：佐剂抗原实验组采用此方法测定血清效价第18页/共27页佐剂抗原采用免疫双扩散法检测血清效价（P：10）效价在1:16以上即可决定采血 1:2、1：4、1：8、1：16、1
9、：32、1：64稀释AgAb第19页/共27页 加样量要精确，不能逸出孔外，否则结加样量要精确，不能逸出孔外，否则结果不好观察；果不好观察；制板时，玻片要清洁，边缘要整齐制板时，玻片要清洁，边缘要整齐;孔距约孔距约5mm5mm左右，太远看不到实验现象。左右，太远看不到实验现象。第20页/共27页 五、结果 对流免疫电泳 双向免疫扩散 第21页/共27页 示教 1 单向免疫扩散方法：方法：用抗体制板、用抗体制板、打孔打孔 、加样、单向、加样、单向扩散扩散2424小时看结果小时看结果 结果第22页/共27页 免疫电泳 示教 2 方法：方法：制板、打孔、加样、电泳制板、打孔、加样、电泳2 2小时小时
10、挖槽、加抗体、双扩散挖槽、加抗体、双扩散2424小时看结果。小时看结果。免疫电泳扩散模式图 A1b：白蛋白 血浆免疫电泳各区带所含蛋白成分 结果第23页/共27页 火箭电泳抗原 示教 3方法：方法：抗体琼脂板的制备、加样、电泳。抗体琼脂板的制备、加样、电泳。+结果第24页/共27页 环状沉淀反应 示教 4 当抗原与相应抗体当抗原与相应抗体 比例适当时，比例适当时，接触接触 面出现乳白色的环面出现乳白色的环 状物即为阳性沉淀状物即为阳性沉淀 反应。反应。Ab Ag抗人血清人血清第25页/共27页实验报告要求：实验报告要求：绘图表示对流免疫电泳绘图表示对流免疫电泳、双向琼脂扩散双向琼脂扩散的的结果结果,并予以简单的说明并予以简单的说明。对流免疫电泳与琼脂双向扩散试验各有何优缺点对流免疫电泳与琼脂双向扩散试验各有何优缺点？如果本试验中没有出现沉淀线考虑有何因素如果本试验中没有出现沉淀线考虑有何因素?琼脂扩散有哪些类型？有何用途？琼脂扩散有哪些类型？有何用途？六、讨论第26页/共27页谢谢您的观看！第27页/共27页