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1、人教教学基因工程人教高中生物选修人教教学基因工程人教高中生物选修设想设想一一能否让水稻植株也能够固定空能否让水稻植株也能够固定空气中的氮？气中的氮？能否让细菌能否让细菌“吐出吐出”蚕丝？蚕丝？设想二设想二能否让微生物产生出人的胰岛能否让微生物产生出人的胰岛素、干扰素等珍贵的药物？素、干扰素等珍贵的药物？设想三设想三第1页/共75页“基因工程基因工程”技技术术 即根据人类的即根据人类的意愿定向改变生物意愿定向改变生物-令人神往令人神往!第2页/共75页 基因工程培育基因工程培育基因工程培育基因工程培育抗虫棉抗虫棉抗虫棉抗虫棉的简要过程：的简要过程：的简要过程：的简要过程：普通棉花普通棉花普通棉花
2、普通棉花(无抗虫特性无抗虫特性无抗虫特性无抗虫特性)苏云金芽孢杆苏云金芽孢杆苏云金芽孢杆苏云金芽孢杆菌菌菌菌获获获获取取取取抗虫基因抗虫基因抗虫基因抗虫基因（目的基因目的基因目的基因目的基因）与运载体与运载体与运载体与运载体DNADNA拼接拼接拼接拼接导入导入导入导入棉花细胞棉花细胞棉花细胞棉花细胞(含抗虫基因含抗虫基因含抗虫基因含抗虫基因)棉花植株棉花植株棉花植株棉花植株(有抗虫特性有抗虫特性有抗虫特性有抗虫特性)基因工程实例基因工程实例基因工程实例基因工程实例:第3页/共75页 什么叫基因工程？什么叫基因工程？什么叫基因工程？什么叫基因工程？基因工程是指按照人们的愿望基因工程是指按照人们的
3、愿望基因工程是指按照人们的愿望基因工程是指按照人们的愿望,进行进行进行进行严格的设计严格的设计严格的设计严格的设计,并通过在并通过在并通过在并通过在生物体外生物体外生物体外生物体外进行进行进行进行DNA DNA 重组等技术，赋予生物以新的遗传特性重组等技术，赋予生物以新的遗传特性重组等技术，赋予生物以新的遗传特性重组等技术，赋予生物以新的遗传特性,从而创造出更符合人们需要的新的生物类从而创造出更符合人们需要的新的生物类从而创造出更符合人们需要的新的生物类从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于型和生物产品。由于型和生物产品。由于型和生物产品。由于基因工程基因工程基因工程基因工程是
4、在是在是在是在DNADNA分子水平上进行设计和施工的分子水平上进行设计和施工的分子水平上进行设计和施工的分子水平上进行设计和施工的,因此又叫因此又叫因此又叫因此又叫做做做做DNADNA重组技术或重组技术或重组技术或重组技术或基因拼接技术基因拼接技术基因拼接技术基因拼接技术.（一）基因工程的概念（一）基因工程的概念（一）基因工程的概念（一）基因工程的概念第4页/共75页基因工程的别名基因工程的别名基因工程的别名基因工程的别名操作环境操作环境操作环境操作环境操作对象操作对象操作对象操作对象操作水平操作水平操作水平操作水平基本过程基本过程基本过程基本过程实质实质实质实质结果结果结果结果基因拼接技术或
5、基因拼接技术或基因拼接技术或基因拼接技术或DNADNADNADNA重组技术重组技术重组技术重组技术生物体外生物体外生物体外生物体外基因基因基因基因DNADNADNADNA分子水平分子水平分子水平分子水平人们需要的新的生物类型和生物产品人们需要的新的生物类型和生物产品人们需要的新的生物类型和生物产品人们需要的新的生物类型和生物产品切割切割切割切割 拼接拼接拼接拼接 导入导入导入导入 表达表达表达表达基因重组基因重组基因重组基因重组基因工程的若干问题基因工程的若干问题:第5页/共75页DNADNA重组技术重组技术(基因工程基因工程)的的 基本工具基本工具做工程是需要工具的做工程是需要工具的.第6页
6、/共75页 前面介绍的利用前面介绍的利用前面介绍的利用前面介绍的利用基因工程基因工程基因工程基因工程培育培育培育培育抗虫棉抗虫棉抗虫棉抗虫棉的的的的主要步骤有哪几个主要步骤有哪几个主要步骤有哪几个主要步骤有哪几个?步骤一：步骤一：步骤一：步骤一：从苏云金芽孢杆菌细胞内提从苏云金芽孢杆菌细胞内提从苏云金芽孢杆菌细胞内提从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来取出来取出来取出来抗虫基因抗虫基因抗虫基因抗虫基因(目的基因目的基因目的基因目的基因).步骤二：步骤二：步骤二：步骤二：抗虫基因与抗虫基因与抗虫基因与抗虫基因与运载体运载体运载体运载体DNADNA连连连连接接接接步骤三：步骤三：步骤三：步骤三：抗虫基因
7、抗虫基因抗虫基因抗虫基因导入导入导入导入受体受体受体受体(普通棉花普通棉花普通棉花普通棉花)细胞细胞细胞细胞思考思考:提示提示:共四步共四步;步骤四是步骤四是“检测和鉴定检测和鉴定”.第7页/共75页上述的三个步骤中上述的三个步骤中上述的三个步骤中上述的三个步骤中各各各各需要什么需要什么需要什么需要什么工具工具工具工具？步骤一的工具：步骤一的工具：步骤一的工具：步骤一的工具：步骤二的工具：步骤二的工具：步骤二的工具：步骤二的工具：步骤三的工具：步骤三的工具：步骤三的工具：步骤三的工具：“分子手术刀分子手术刀分子手术刀分子手术刀”限制性内切限制性内切限制性内切限制性内切酶酶酶酶“分子缝合针分子缝
8、合针分子缝合针分子缝合针”DNADNADNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶“分子运载车分子运载车分子运载车分子运载车”载体载体载体载体这里的这里的“分子分子”是指是指_分子分子.DNA(DNA(目的基因、载体目的基因、载体)第8页/共75页这三种工具的这三种工具的作用作用各是什么各是什么?第9页/共75页1.1.限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶“分子手术刀分子手术刀分子手术刀分子手术刀”限制酶主要是从原核微生物中分离纯化出来限制酶主要是从原核微生物中分离纯化出来限制酶主要是从原核微生物中分离纯化出来限制酶主要是从原核微生物中分离纯化出来的。能识别双链的。能识别双
9、链的。能识别双链的。能识别双链DNADNA的某种的某种的某种的某种特定核苷酸序列特定核苷酸序列特定核苷酸序列特定核苷酸序列，并且使并且使并且使并且使每一条链中每一条链中每一条链中每一条链中特定部位的两个核苷酸之间特定部位的两个核苷酸之间特定部位的两个核苷酸之间特定部位的两个核苷酸之间(此处叫此处叫此处叫此处叫“切点切点切点切点”)的的的的磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键断开断开断开断开(注意注意注意注意:不是不是不是不是氢键氢键氢键氢键).).（二）（二）（二）（二）DNADNA重组技术的基本工具及其作用重组技术的基本工具及其作用重组技术的基本工具及其作用重组技术的基本工具及其作用注意
10、注意注意注意:一种限制酶只能识别一种限制酶只能识别一种限制酶只能识别一种限制酶只能识别一种一种一种一种特定的特定的特定的特定的核苷酸序核苷酸序核苷酸序核苷酸序列列列列,并且能在并且能在并且能在并且能在一个一个一个一个特定的特定的特定的特定的切点切点切点切点上切割上切割上切割上切割DNADNA分子。分子。分子。分子。即即即即：特异性特异性特异性特异性.(注意注意注意注意:特异性表现在两个方面特异性表现在两个方面特异性表现在两个方面特异性表现在两个方面.).).).)第10页/共75页AATTGCCTTAAGDNADNA双链及双链及“磷酸二酯键磷酸二酯键”磷磷酸酸二二酯酯键键第11页/共75页 1
11、.1.大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌(EcoR(EcoR)的一种限制酶能识别的脱的一种限制酶能识别的脱的一种限制酶能识别的脱的一种限制酶能识别的脱氧核苷酸序列是氧核苷酸序列是氧核苷酸序列是氧核苷酸序列是(用碱基表示用碱基表示用碱基表示用碱基表示)_;)_;切点在切点在切点在切点在_之间。之间。之间。之间。限制限制限制限制酶酶酶酶看图回答看图回答:GAATTCGAATTCGG和和和和A A2.2.若从切点处切开若从切点处切开,形成的两个形成的两个DNADNA片断是片断是怎样的怎样的?第12页/共75页限制性内切酶的特异性表现在限制性内切酶的特异性表现在:特定的核苷酸序列特定的核苷酸序列-是是“
12、回文序列回文序列”(?).特定的切点特定的切点.第13页/共75页 被限制酶切开的被限制酶切开的被限制酶切开的被限制酶切开的DNADNA两条单链的切口，带两条单链的切口，带两条单链的切口，带两条单链的切口，带有几个有几个有几个有几个伸出的伸出的伸出的伸出的核苷酸核苷酸核苷酸核苷酸，他们之间正好，他们之间正好，他们之间正好，他们之间正好互补配对互补配对互补配对互补配对，这样的这样的这样的这样的切口切口切口切口叫叫叫叫黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端.注意注意:切口处的切口处的两条单链一长一短两条单链一长一短两条单链一长一短两条单链一长一短.伸出来的那伸出来的那伸出来的那伸出来的那一条长链叫一条长
13、链叫一条长链叫一条长链叫黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端第14页/共75页限制限制限制限制酶酶酶酶在在G和和A之间被之间被限制酶限制酶切断的是化学键是切断的是化学键是_.第15页/共75页“黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端”和和和和“平末端平末端平末端平末端”当限制酶在它识别序列的当限制酶在它识别序列的当限制酶在它识别序列的当限制酶在它识别序列的中心轴线中心轴线中心轴线中心轴线的的的的两侧两侧两侧两侧将将将将DNADNA的两条链分别切开时，产生的是的两条链分别切开时，产生的是的两条链分别切开时，产生的是的两条链分别切开时，产生的是黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端.而当限制酶在它识别序列的而当限
14、制酶在它识别序列的而当限制酶在它识别序列的而当限制酶在它识别序列的中心轴线处中心轴线处中心轴线处中心轴线处切开切开切开切开时，产生的则是时，产生的则是时，产生的则是时，产生的则是平末端平末端平末端平末端。第16页/共75页第17页/共75页 1.1.要想获得某要想获得某要想获得某要想获得某一个一个一个一个特定性状的基因特定性状的基因特定性状的基因特定性状的基因(即即即即”目的基因目的基因目的基因目的基因”)必须要用限制酶切几个切口？必须要用限制酶切几个切口？必须要用限制酶切几个切口？必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？可产生几个黏性末端？可产生几个黏性末端？可产生几个黏性末端？要切两
15、个切口，产生四个黏性末端要切两个切口，产生四个黏性末端要切两个切口，产生四个黏性末端要切两个切口，产生四个黏性末端.2.2.如果把两种来源不同的如果把两种来源不同的如果把两种来源不同的如果把两种来源不同的DNADNA用同一种限用同一种限用同一种限用同一种限制酶来切割，产生制酶来切割，产生制酶来切割，产生制酶来切割，产生黏性末端相同吗黏性末端相同吗黏性末端相同吗黏性末端相同吗？会产生相同的黏性末端会产生相同的黏性末端会产生相同的黏性末端会产生相同的黏性末端.思考思考:第18页/共75页第19页/共75页你是否想过你是否想过?限制酶限制酶是否会切割自己细胞里的是否会切割自己细胞里的DNADNA呢呢
16、?为什么为什么?这对于其自身有意义吗这对于其自身有意义吗?第20页/共75页DNADNA连接酶的连接酶的种类种类(根据来源分根据来源分)及其在及其在功能功能上上的异同的异同.-见课文见课文P5.P5.来源来源功功能能同同异异名称名称E.ColiDNA连接酶连接酶T4DNA连接酶连接酶大肠杆菌大肠杆菌T4噬菌体噬菌体形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键只能只能:互补的互补的黏性末端黏性末端黏性末端和平末黏性末端和平末端端均可均可第21页/共75页 显然显然显然显然,若将上述两者的黏性末端黏合若将上述两者的黏性末端黏合若将上述两者的黏性末端黏合若将上述两者的黏性末端黏合(连接连接连接连接)起来，就似乎可以
17、合成新的起来，就似乎可以合成新的起来，就似乎可以合成新的起来，就似乎可以合成新的DNADNADNADNA分子分子分子分子(重组重组重组重组DNADNA分子分子分子分子)了了了了 用什么工具连接呢用什么工具连接呢?这个工具是怎样将两者连这个工具是怎样将两者连接起来的接起来的?第22页/共75页2.DNA2.DNA连接酶连接酶“分子缝合针分子缝合针”第23页/共75页 DNA DNA DNA DNA连接酶可把黏性末端之间的缝隙连接酶可把黏性末端之间的缝隙连接酶可把黏性末端之间的缝隙连接酶可把黏性末端之间的缝隙“缝合缝合缝合缝合”起来，即把梯子两边扶手的起来，即把梯子两边扶手的起来，即把梯子两边扶手
18、的起来，即把梯子两边扶手的断口断口断口断口(注意位置注意位置注意位置注意位置)连连连连接起来，这样一个重组的接起来，这样一个重组的接起来，这样一个重组的接起来，这样一个重组的DNADNADNADNA分子就形成了分子就形成了分子就形成了分子就形成了.思考思考:DNA连接酶连接酶的作用是使断口处的相邻的两个的作用是使断口处的相邻的两个脱氧核苷酸之间形成脱氧核苷酸之间形成_键键.第24页/共75页第25页/共75页 异异:DNADNA连接酶连接酶:是将几个是将几个DNADNA片段片段连接起来连接起来;不需不需DNADNA模板模板.DNADNA聚合酶聚合酶:则是将则是将脱氧核苷酸脱氧核苷酸连接连接(聚
19、聚合合)成成DNA;DNA;需以需以DNADNA的一条链为模板的一条链为模板.提示提示:注意比较基因工程中的注意比较基因工程中的DNADNA连接酶连接酶和和DNADNA复制中的复制中的DNADNA聚合酶聚合酶的作用有何的作用有何异同异同?同同:两种酶都是形成两种酶都是形成磷酸二酯键磷酸二酯键.第26页/共75页 -导入过程需要运输导入过程需要运输“目目的基因的基因”的工具的工具载体载体。如何将如何将目的基因目的基因(如上例中的如上例中的“抗虫抗虫基因基因”)导入导入受体细胞受体细胞(即接受即接受目的基因目的基因的生物的细胞的生物的细胞,如上例中的棉花细胞如上例中的棉花细胞)？注意注意:一般地一
20、般地,不能将目的基因直接导入受体细胞不能将目的基因直接导入受体细胞.第27页/共75页载体载体是什么是什么(生物化学生物化学成分成分)?它从哪里获得它从哪里获得?它它是如何承载目的基因的是如何承载目的基因的?第28页/共75页3.3.3.3.基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体-“分子运输车分子运输车分子运输车分子运输车”.常用的运载体主要有两类：常用的运载体主要有两类：常用的运载体主要有两类：常用的运载体主要有两类：1 1 1 1）质粒质粒质粒质粒:一些细菌细胞质里的一些细菌细胞质里的一些细菌细胞质里的一些细菌细胞质里的质粒质粒质粒质粒.2
21、 2 2 2）病毒病毒病毒病毒:噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体(即细菌病毒即细菌病毒即细菌病毒即细菌病毒)或某些或某些或某些或某些动、植物动、植物动、植物动、植物病毒病毒病毒病毒.第29页/共75页什么是质粒什么是质粒什么是质粒什么是质粒?是一种裸露的、结构简是一种裸露的、结构简是一种裸露的、结构简是一种裸露的、结构简单、单、单、单、独立于独立于独立于独立于细菌染色体细菌染色体细菌染色体细菌染色体(即即即即原原原原核的核的核的核的DNADNADNADNA)之外之外之外之外，并具有自，并具有自，并具有自，并具有自我复制能力的双链环状我复制能力的双链环状我复制能力的双链环状我复制能力的双链环状DNADN
22、ADNADNA分子分子分子分子.质粒是基因工程最常用质粒是基因工程最常用质粒是基因工程最常用质粒是基因工程最常用的载体的载体的载体的载体.绝大多数细菌质粒都是绝大多数细菌质粒都是绝大多数细菌质粒都是绝大多数细菌质粒都是闭合环状闭合环状闭合环状闭合环状DNADNADNADNA分子。有的一分子。有的一分子。有的一分子。有的一个细菌中有一个，有的一个个细菌中有一个，有的一个个细菌中有一个，有的一个个细菌中有一个，有的一个细菌中有多个细菌中有多个细菌中有多个细菌中有多个.小结小结:质粒是小型、质粒是小型、环状的环状的DNADNA分子分子.第30页/共75页 最常用的质粒是最常用的质粒是最常用的质粒是最
23、常用的质粒是大肠杆菌的质粒，大肠杆菌的质粒，大肠杆菌的质粒，大肠杆菌的质粒，其中常含有其中常含有其中常含有其中常含有抗药基抗药基抗药基抗药基因因因因，如四环素的标，如四环素的标，如四环素的标，如四环素的标记基因。质粒的存记基因。质粒的存记基因。质粒的存记基因。质粒的存在与否对宿主细胞在与否对宿主细胞在与否对宿主细胞在与否对宿主细胞生存没有决定性作生存没有决定性作生存没有决定性作生存没有决定性作用，但复制只能在用，但复制只能在用，但复制只能在用，但复制只能在宿主细胞内完成。宿主细胞内完成。宿主细胞内完成。宿主细胞内完成。质粒的一种质粒的一种:大肠杆菌的质粒大肠杆菌的质粒大肠杆菌的质粒大肠杆菌的质
24、粒注意注意:能充当载体的是大肠杆菌的能充当载体的是大肠杆菌的质粒质粒,而而不是大肠不是大肠杆菌杆菌.第31页/共75页载体的载体的载体的载体的作用作用作用作用有哪些？有哪些？有哪些？有哪些？1.1.作为运输工具，将目的基因作为运输工具，将目的基因作为运输工具，将目的基因作为运输工具，将目的基因(如抗虫基因如抗虫基因如抗虫基因如抗虫基因)转移到受体细胞转移到受体细胞转移到受体细胞转移到受体细胞(如棉花细胞如棉花细胞如棉花细胞如棉花细胞)中去。中去。中去。中去。2.2.利用载体在受体细胞利用载体在受体细胞利用载体在受体细胞利用载体在受体细胞(如棉花细胞如棉花细胞如棉花细胞如棉花细胞)内，对内，对内
25、，对内，对目的基因目的基因目的基因目的基因(如抗虫基因如抗虫基因如抗虫基因如抗虫基因)进行大量复制。进行大量复制。进行大量复制。进行大量复制。第32页/共75页作为载体必须具备哪些条件？作为载体必须具备哪些条件？作为载体必须具备哪些条件？作为载体必须具备哪些条件？1 1）能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。）能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。）能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。）能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。2 2）载体）载体）载体）载体DNADNA必须有一个或多个限制酶切点，以便目必须有一个或多个限制酶切点，以便目必须有一个或多个限制酶切点，以便目必须有一个或多个限制酶切点，以便目的基因插
26、入到载体上去。的基因插入到载体上去。的基因插入到载体上去。的基因插入到载体上去。3 3）具有某些标记基因，便于进行筛选。如抗菌素的）具有某些标记基因，便于进行筛选。如抗菌素的）具有某些标记基因，便于进行筛选。如抗菌素的）具有某些标记基因，便于进行筛选。如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等。抗性基因、产物具有颜色反应的基因等。抗性基因、产物具有颜色反应的基因等。抗性基因、产物具有颜色反应的基因等。4)4)载体载体载体载体DNADNA必须是安全的必须是安全的必须是安全的必须是安全的,不会对受体细胞有害不会对受体细胞有害不会对受体细胞有害不会对受体细胞有害,或不或不或不或不能进入到除受体细胞
27、外的其他生物细胞中去能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去;5)5)载体载体载体载体DNADNA分子大小应适合分子大小应适合分子大小应适合分子大小应适合,以便提取和在体外进行以便提取和在体外进行以便提取和在体外进行以便提取和在体外进行操作操作操作操作,太大就不便操作太大就不便操作太大就不便操作太大就不便操作.第33页/共75页双基练习：双基练习：双基练习：双基练习：一、基因工程的概念一、基因工程的概念一、基因工程的概念一、基因工程的概念 基因工程是指按照人们的愿望基因工程是指按照人们的愿望基因工程是指按照人们的愿望基因
28、工程是指按照人们的愿望,进行严格的设计进行严格的设计进行严格的设计进行严格的设计,通过体外通过体外通过体外通过体外_和和和和_等技术等技术等技术等技术,赋予生物以心得赋予生物以心得赋予生物以心得赋予生物以心得遗传特性遗传特性遗传特性遗传特性,创造出符合人们的需要的新的创造出符合人们的需要的新的创造出符合人们的需要的新的创造出符合人们的需要的新的_和和和和_._.又叫做又叫做又叫做又叫做DNADNA的重组技术的重组技术的重组技术的重组技术 .二、二、二、二、DNADNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具重组技术的基本工具重组技术的基本工具 1.1.限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切
29、酶限制性核酸内切酶-“-“分子手术刀分子手术刀分子手术刀分子手术刀”(1)(1)主要来源主要来源主要来源主要来源:从从从从_生物中分离出来的生物中分离出来的生物中分离出来的生物中分离出来的.(2)(2)特点特点特点特点:能够识别能够识别能够识别能够识别DNADNA特定的核苷酸序列特定的核苷酸序列特定的核苷酸序列特定的核苷酸序列,切开切开切开切开 第34页/共75页两个两个两个两个_之间的之间的之间的之间的_ ._ .(3)DNA (3)DNA末端末端末端末端:限制酶切割限制酶切割限制酶切割限制酶切割DNADNA产生的产生的产生的产生的DNADNA末末末末端有两种形式端有两种形式端有两种形式端有
30、两种形式:_:_和和和和_._.2.DNA 2.DNA连接酶连接酶连接酶连接酶-“-“分子缝合针分子缝合针分子缝合针分子缝合针”(1)(1)作用作用作用作用:恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的的的的_._.(2)(2)种类种类种类种类:E.coli DNAE.coli DNA连接酶连接酶连接酶连接酶:只能缝合只能缝合只能缝合只能缝合DNADNA的的的的_ T4 DNAT4 DNA连接酶连接酶连接酶连接酶:既可缝合既可缝合既可缝合既可缝合DNADNA的的的的_,_,又可又可又可又可缝合双链缝合双链缝合
31、双链缝合双链DNADNA的的的的_._.第35页/共75页 3.3.基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体-”-”分子运输车分子运输车分子运输车分子运输车”(1)(1)载体的种类载体的种类载体的种类载体的种类 质粒质粒质粒质粒:是一种裸露的是一种裸露的是一种裸露的是一种裸露的,结构简单结构简单结构简单结构简单,独立于细菌染独立于细菌染独立于细菌染独立于细菌染色体之外色体之外色体之外色体之外,并能够自我并能够自我并能够自我并能够自我_能力的双链能力的双链能力的双链能力的双链_ _ DNA DNA 分子分子分子分子;_._._._.(2)(2)载体
32、的特点载体的特点载体的特点载体的特点 能够在细胞内能够在细胞内能够在细胞内能够在细胞内_;_;有一个或多个有一个或多个有一个或多个有一个或多个_切割位点切割位点切割位点切割位点,便于供源便于供源便于供源便于供源DNADNA的插入的插入的插入的插入.具有具有具有具有_基因基因基因基因,供重组供重组供重组供重组DNADNA的鉴定和选择的鉴定和选择的鉴定和选择的鉴定和选择.第36页/共75页第37页/共75页基因工程的基本操作流程基因工程的基本操作流程第38页/共75页基因工程的基本操作程序主要包括基因工程的基本操作程序主要包括基因工程的基本操作程序主要包括基因工程的基本操作程序主要包括四个基本步骤
33、：四个基本步骤：四个基本步骤：四个基本步骤：1 1）目的基因目的基因目的基因目的基因的获取的获取的获取的获取2 2）“基因表达载体基因表达载体基因表达载体基因表达载体”的构建的构建的构建的构建3 3）将目的基因）将目的基因）将目的基因）将目的基因导入导入导入导入受体细胞受体细胞受体细胞受体细胞(即即即即“转化转化转化转化”)4 4）目的基因的）目的基因的）目的基因的）目的基因的检测检测检测检测与与与与鉴定鉴定鉴定鉴定第39页/共75页第40页/共75页步骤一：步骤一：步骤一：步骤一：目的基因目的基因目的基因目的基因的获取的获取的获取的获取什么叫什么叫什么叫什么叫目的基因目的基因目的基因目的基因
34、?主要是指编码蛋白质的结构基因主要是指编码蛋白质的结构基因主要是指编码蛋白质的结构基因主要是指编码蛋白质的结构基因.第41页/共75页获取获取目的基因目的基因的途径有哪些的途径有哪些?1.1.从从从从“基因文库基因文库基因文库基因文库”中获取中获取中获取中获取.2.2.2.2.利用利用利用利用“PCRPCRPCRPCR技术技术技术技术”扩增扩增扩增扩增.3.3.3.3.直接人工合成直接人工合成直接人工合成直接人工合成(适合于基因较小且已知适合于基因较小且已知适合于基因较小且已知适合于基因较小且已知其核苷酸顺序其核苷酸顺序其核苷酸顺序其核苷酸顺序)-见课文见课文.共三条共三条.第42页/共75页
35、从从从从基因文库基因文库基因文库基因文库中获取中获取中获取中获取“目的基因目的基因目的基因目的基因”：什么叫什么叫“基因文库基因文库”?分为分为:1.基因组文库基因组文库:基因文库中包含了一种生物所有的基因基因文库中包含了一种生物所有的基因,这这种基因文库叫做基因组文库种基因文库叫做基因组文库.2.部分基因文库部分基因文库:基因文库中包含了一种生物的一部分基因基因文库中包含了一种生物的一部分基因,这种基因文库叫做部分基因文库这种基因文库叫做部分基因文库.如如cDNA文库文库.将含有某种生物不同基因的许多将含有某种生物不同基因的许多DNADNA片段片段,导入导入受受体菌体菌的群体中储存的群体中储
36、存,各个受体菌分别含有这种生物的不各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因同的基因,称为基因文库称为基因文库(gene library)(gene library)类似从图书馆里取书类似从图书馆里取书.第43页/共75页第44页/共75页利用利用PCRPCR技术技术扩增扩增“目的基因目的基因”.1.1.概念概念:PCR:PCR即即“聚合酶链式反应聚合酶链式反应”,是一种在生是一种在生物体外复制特定物体外复制特定DNADNA片断的技术片断的技术.2.2.原理原理:DNA:DNA的半保留复制的半保留复制.3.3.过程过程:(:(见图见图).).4.4.优点优点:大量大量获取目的基因获取目的基因.(.
37、(指数式扩增指数式扩增,近近2 2n n)第45页/共75页提示与思考提示与思考:1.1.图中的图中的“模板模板DNADNA”就就是已知核苷是已知核苷酸序列的酸序列的目的基因目的基因.2.2.引物引物是人工合成是人工合成的的,与模板与模板DNA(DNA(即目即目的基因的基因)互补互补,作用作用是使是使_._.3.3.加热的作用是使加热的作用是使_._.4.4.聚合酶聚合酶(Tap(Tap酶酶)是是指指_(_(选选:DNADNA聚合聚合酶酶;RNA;RNA聚合酶聚合酶),),其其特点是特点是_._.5.5.原料是原料是_._.6.6.每扩增一次每扩增一次,目的目的基因基因的数目增加的数目增加_.
38、_.7.7.“退火退火”DNADNA解链解链第46页/共75页提示提示:PCRPCR的基本操作的基本操作(过程过程):):PCR是一种反复循环的是一种反复循环的DNA合成反应过程合成反应过程,其基本反其基本反应有三个步骤：应有三个步骤：1.变性变性:通过通过加热加热(高温高温)使模板使模板DNA完全变性成为单链完全变性成为单链,同时引物自身和引物之间存在的局部双链也得以消除同时引物自身和引物之间存在的局部双链也得以消除.2.退火退火:将温度下降至适宜温度，使将温度下降至适宜温度，使引物引物与模板与模板DNA退退火结合；火结合；3.延伸延伸:将温度升高将温度升高,热稳定热稳定DNADNA聚合酶聚
39、合酶(即耐高温即耐高温)以以dNTP(即脱氧核苷酸即脱氧核苷酸)为底物为底物(即原料即原料)催化合成催化合成DNA链延链延伸伸.以上三步为一个循环，新合成的以上三步为一个循环，新合成的DNADNA分子又可以作为下一轮合分子又可以作为下一轮合成的模板，经多次循环后即可达到扩增成的模板，经多次循环后即可达到扩增DNADNA片段的目的片段的目的.显然显然,每循环每循环(扩增扩增)一次一次,就需要添加一次就需要添加一次(共两个共两个)引物引物.第47页/共75页提示提示:两个两个引物引物、一个、一个模板模板.第48页/共75页人工合成人工合成目的基因目的基因 如果基因比较小，核苷酸序列又已知，也可如果
40、基因比较小，核苷酸序列又已知，也可以通过以通过DNADNA合成仪用化学方法直接合成。合成仪用化学方法直接合成。1.1.通过通过反转录法反转录法合成合成:又分为又分为:目的基因的目的基因的目的基因的目的基因的mRNAmRNA(已知已知已知已知)单链单链单链单链DNADNA双链双链双链双链DNADNA(即目的基因即目的基因即目的基因即目的基因)反转录反转录反转录反转录合成合成合成合成第49页/共75页2.2.直接合成直接合成.根据已知蛋白质的根据已知蛋白质的根据已知蛋白质的根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相氨基酸序列，推测出相氨基酸序列，推测出相氨基酸序列，推测出相应的信使应的信使应的信使应的信
41、使RNARNARNARNA序列，然后序列，然后序列，然后序列，然后按照碱基互补配对原则，按照碱基互补配对原则，按照碱基互补配对原则，按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的推测出它的结构基因的推测出它的结构基因的推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化核苷酸序列，再通过化核苷酸序列，再通过化核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为学方法，以单核苷酸为学方法，以单核苷酸为学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。原料合成目的基因。原料合成目的基因。原料合成目的基因。蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNAmRNAmRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列的核苷
42、酸序列的核苷酸序列结构基因的核苷酸序结构基因的核苷酸序结构基因的核苷酸序结构基因的核苷酸序列列列列推测推测推测推测推测推测推测推测目的基因目的基因目的基因目的基因化学合成化学合成化学合成化学合成第50页/共75页 在获取在获取目的基因目的基因后后,如何将目的基如何将目的基因导入因导入受体细胞受体细胞呢呢?能直接导入吗能直接导入吗?必须借助必须借助载体载体!第51页/共75页 怎样借助怎样借助载体载体将将目的目的基因基因导入受体细胞呢导入受体细胞呢?必须把必须把目的基因目的基因“装装到到”载体载体上上!如何装如何装?第52页/共75页步骤二：步骤二：步骤二：步骤二：基因表达载体基因表达载体的构建
43、的构建的构建的构建.什么是什么是“基因表达载体基因表达载体”?就是已经装上了就是已经装上了(含有含有)目的基因目的基因的载体的载体.第53页/共75页 1 1）用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个）用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个）用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个）用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个切口，露出切口，露出切口，露出切口，露出黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端。2 2）用）用）用）用同一种同一种同一种同一种限制酶切取限制酶切取限制酶切取限制酶切取目的基因目的基因目的基因目的基因，使其产生，使其产生，使其产生，使其产生相同的黏性末端。相同的黏性末端。相同的黏性末端。相同的黏性
44、末端。3 3）将切下的）将切下的）将切下的）将切下的目的基因目的基因目的基因目的基因片段插入质粒的切口处，片段插入质粒的切口处，片段插入质粒的切口处，片段插入质粒的切口处，再加入适量再加入适量再加入适量再加入适量DNADNA连接酶，形成了一个重组连接酶，形成了一个重组连接酶，形成了一个重组连接酶，形成了一个重组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）分子（重组质粒）分子（重组质粒）目的基因与载体的结合过程，实际上是不同目的基因与载体的结合过程，实际上是不同目的基因与载体的结合过程，实际上是不同目的基因与载体的结合过程，实际上是不同来源的来源的来源的来源的基因重组基因重组基因重组基因重组的过
45、程的过程的过程的过程基因表达载体基因表达载体基因表达载体基因表达载体的构建步骤的构建步骤的构建步骤的构建步骤.-见课文见课文见课文见课文.第54页/共75页提示与思考提示与思考:1.“1.“基因表达载基因表达载体体”就是已插入就是已插入目的基因目的基因的载体的载体.2.2.看左图回答看左图回答:基因表达载体基因表达载体由哪些部分组成由哪些部分组成?_.?_.第55页/共75页3.3.启动子启动子:是有特殊结构的是有特殊结构的DNADNA片断片断,位于目的基位于目的基因的首端因的首端,是是RNARNA聚合酶聚合酶的识别和结合的部位的识别和结合的部位.有有它才能驱动它才能驱动目的基因目的基因转录转
46、录出出MRNA.MRNA.最终获得蛋白最终获得蛋白质质.(不是不是复制复制!)!)4.4.终止子终止子:位于目的基因的端尾端位于目的基因的端尾端.作用是终止作用是终止转录转录.5.5.标记基因标记基因:是为了鉴别受体细胞里是否已经含是为了鉴别受体细胞里是否已经含有目的基因有目的基因,从而将含目的基因的细胞筛选出来从而将含目的基因的细胞筛选出来.如如“抗生素基因抗生素基因”、“荧光标记基因荧光标记基因”等等.(醒醒目的目的,特别的标记特别的标记)6.6.复制原点复制原点是载体是载体复制复制(不是转录不是转录)时的起点时的起点.第56页/共75页 什么叫什么叫什么叫什么叫转化转化转化转化?将将将将
47、目的基因进入受体细胞内，并且在受体目的基因进入受体细胞内，并且在受体目的基因进入受体细胞内，并且在受体目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内细胞内细胞内细胞内维持稳定维持稳定维持稳定维持稳定(如复制如复制如复制如复制)和和和和表达表达表达表达(即转录、翻即转录、翻即转录、翻即转录、翻译为特定蛋白质及表现特定性状等译为特定蛋白质及表现特定性状等译为特定蛋白质及表现特定性状等译为特定蛋白质及表现特定性状等)的过程的过程的过程的过程.受体细胞受体细胞是指什么是指什么?它包括哪些细胞它包括哪些细胞?提示提示:注意注意,目的基因目的基因是随着是随着基因表达载体基因表达载体被导入受被导入受体细胞的体细胞
48、的,而不是被单独导入的而不是被单独导入的.步骤三：步骤三：步骤三：步骤三：转化转化转化转化-将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞第57页/共75页1.1.将目的基因导入将目的基因导入植物植物细胞细胞-农杆菌农杆菌转化法转化法.第58页/共75页提示提示:(1)(1)农杆菌农杆菌及及农杆菌转化法农杆菌转化法:农杆菌是农杆菌是土壤土壤中的一种细菌中的一种细菌.能感染双子叶植物和裸子植物能感染双子叶植物和裸子植物.其细胞里含其细胞里含TiTi质粒质粒,该质粒上含有一段该质粒上含有一段DNADNA叫叫“T-DNAT-DNA”(叫叫“可转移的可转移的D
49、NADNA”).).将将目的基因目的基因插入到该插入到该“T-DNAT-DNA”中中,通过使农杆菌感染植物通过使农杆菌感染植物,而将目的基因转化入植物细胞并将其插入到而将目的基因转化入植物细胞并将其插入到植物细胞中的染色体的植物细胞中的染色体的DNADNA上上.(2)(2)将目的基因导入将目的基因导入植物植物细胞的方法还有细胞的方法还有:基因枪法基因枪法和和花粉通道法花粉通道法.第59页/共75页将目的基因导入植物细胞的其他方法将目的基因导入植物细胞的其他方法:花粉管通道法花粉管通道法 基因枪法基因枪法.第60页/共75页2.2.将目的基因导入将目的基因导入动物动物细胞细胞-显微注射法显微注射
50、法.第61页/共75页 用口径为用口径为用口径为用口径为1m1m的的的的DNADNA注注注注射器，将大量射器，将大量射器，将大量射器，将大量目的基因目的基因目的基因目的基因片段片段片段片段(注意注意注意注意:是含是含是含是含目的基因目的基因目的基因目的基因的的的的“基因表达载体基因表达载体基因表达载体基因表达载体”,而不是而不是而不是而不是裸的目的基因裸的目的基因裸的目的基因裸的目的基因)注入到受精注入到受精注入到受精注入到受精卵的核内，然后把经过注射卵的核内，然后把经过注射卵的核内，然后把经过注射卵的核内，然后把经过注射的受精卵移植到另一只雌性的受精卵移植到另一只雌性的受精卵移植到另一只雌性