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1、关于重组蛋白的分离关于重组蛋白的分离纯化纯化第一张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月基因表达体系1.1.原核体系原核体系2.2.真核体系真核体系第二张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月大肠杆菌(Escherichia coli)遗遗传传背背景景清清楚楚，基基因因工工程程操操作作方方便便，商商品品化化表表达载体种类齐全，表达效率高；达载体种类齐全，表达效率高；基基本本不不分分泌泌，易易形形成成包包含含体体(无无正正确确折折叠叠的的立立体体结构结构)，无加糖等修饰，无加糖等修饰第三张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月枯草杆菌(Bacillus subtilis)分泌蛋白质能
2、力强，一般有天然立体结构；分泌蛋白质能力强，一般有天然立体结构；无无加加糖糖修修饰饰功功能能，培培养养液液中中蛋蛋白白酶酶活活性性高高，重重组蛋白易受蛋白酶的水解；组蛋白易受蛋白酶的水解；质粒不稳定，尚无商品化的表达载体质粒不稳定，尚无商品化的表达载体第四张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月其 他乳酸菌乳酸菌 (Lactic acid bacteria)(Lactic acid bacteria)沙门氏菌沙门氏菌(Salmonella typhimuriumSalmonella typhimurium)苏云金杆苏云金杆(Bacillus thuringiensisBacillus th
3、uringiensis)第五张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月真核细胞表达体系 酵母细胞酵母细胞 昆虫细胞昆虫细胞 哺乳动物细胞哺乳动物细胞/组织组织 植物细胞植物细胞/组织组织第六张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月酵母细胞可可生生产产分分泌泌型型蛋蛋白白；有有天天然然立立体体结结构构，有有加加糖糖修修饰功能；可进行染色体整合型基因表达饰功能；可进行染色体整合型基因表达;糖糖链链与与哺哺乳乳动动物物加加工工的的不不一一致致，培培养养上上清清多多糖糖浓浓度高度高;商品化表达体系：商品化表达体系：酿酒酵母酿酒酵母（Saccharomyce cerevisiaeSaccharom
4、yce cerevisiae）;毕赤酵母毕赤酵母 (Pichia pastoris);(Pichia pastoris);裂殖酵母裂殖酵母（Schizosaccharomyce pombeSchizosaccharomyce pombe）第七张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月昆虫细胞可以病毒感染的型式在成虫中生产，也可在体可以病毒感染的型式在成虫中生产，也可在体外培养细胞中生产蛋白外培养细胞中生产蛋白;适合分泌型和膜蛋白的表达，有加糖修饰；适合分泌型和膜蛋白的表达，有加糖修饰；糖链有所区别，表达量有限；糖链有所区别，表达量有限；作为药物宿主细胞未被作为药物宿主细胞未被FDAFDA认可
5、认可第八张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月CHO细胞可进行分泌表达，有天然立体结构，加糖方可进行分泌表达，有天然立体结构，加糖方式与人体蛋白质完全一致；式与人体蛋白质完全一致；表达量不够高，培养成本较高表达量不够高，培养成本较高第九张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月动物乳腺组织分泌生产有天然立体结构和活性的蛋白质至分泌生产有天然立体结构和活性的蛋白质至乳汁，产量高，分离纯化方便，特别适合药乳汁，产量高，分离纯化方便，特别适合药用蛋白的生产；用蛋白的生产；转基因动物制作花费巨大，实验周期长转基因动物制作花费巨大，实验周期长第十张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月鸟类输
6、卵管组织分泌生产有天然立体结构的蛋白质到蛋清，分泌生产有天然立体结构的蛋白质到蛋清，产量高，容易贮存和运输，分离纯化方便；产量高，容易贮存和运输，分离纯化方便；实验成本低，饲养费用低；实验成本低，饲养费用低；加糖方式可能与人有所不同加糖方式可能与人有所不同第十一张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月植物组织植物可大面积种植，可以廉价大规模生产；植物可大面积种植，可以廉价大规模生产；转基因植物制作费时，表达的组织特异性较难转基因植物制作费时，表达的组织特异性较难控制；控制；表达量较难提高，分离纯化不方便表达量较难提高，分离纯化不方便第十二张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月体系选择
7、研究基因功能研究基因功能:大肠杆菌大肠杆菌,裂殖酵母裂殖酵母,昆虫细胞昆虫细胞,CHO,CHO细胞细胞多肽药物生产多肽药物生产:大肠杆菌大肠杆菌,毕氏酵母毕氏酵母,CHO,CHO细胞细胞,乳腺组织乳腺组织疫苗疫苗:大肠杆菌大肠杆菌,酵母酵母,大多数沿用细胞培养产物进行灭毒大多数沿用细胞培养产物进行灭毒单抗生产单抗生产:杂交瘤细胞杂交瘤细胞工业酶生产工业酶生产:各种微生物各种微生物 第十三张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月重组蛋白的分离纯化策略 重组蛋白分离纯化方法选择的基因原则针对不同的产物表达形式采取不同的策略针对不同的产物表达形式采取不同的策略针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析
8、类型针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型多种分离纯化技术的联合运用多种分离纯化技术的联合运用合适分离纯化介质的选择合适分离纯化介质的选择第十四张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月针对不同的产物表达形式采取不同的策略采用分泌型战略表达重组蛋白，通常体积大、浓度低，因此应在纯化之前采用沉淀或超滤等方法先进行浓缩处理；采用包涵体型战略表达重组蛋白，应先离心回收包涵体；采用融合型战略表达重组蛋白，一般是胞内可溶性的，拟首先选用亲和层析进行纯化表达在细胞膜和细胞壁之间的间隙中的蛋白质，应用低浓度的溶菌酶处理，然后再用渗透压休克法释放重组蛋白。第十五张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月
9、针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型 等电点处于极端区域（pI5 或 pI8）的重组蛋白应首选离子交换法进行分离，这样很容易除去几乎所有的杂蛋白；重组蛋白特异性的配体、底物、抗体、糖链等都是首选亲和层析纯化方法的重要条件，原则是它们与目标蛋白之间的解离常数应在合适的范围内（10-8-10-4 mol/L）；疏水层析和反相层析是根据蛋白质的疏水性差异进行分离的；凝胶过滤层析是根据蛋白的分子量和体积差异进行分离的；径向层析是近年来发展起来的集层析分离和膜分离于一体的一种复合技术，在流量、负荷量等参数方面显示出极大的优越性。第十六张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月多种分离纯化技术的联合
10、运用在进行重组蛋白的纯化时，通常需要综合使用多种技术，一般来说，在选择分离纯化方法时应遵循下列原则：应选择不同分离纯化机理的方法联合使用应选择不同分离纯化机理的方法联合使用应首先选择能除去含量最多杂质的方法应首先选择能除去含量最多杂质的方法应尽量选择高效的分离方法应尽量选择高效的分离方法应将最费时、成本最高的分离纯化方法安排在最后阶段应将最费时、成本最高的分离纯化方法安排在最后阶段第十七张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月合适分离纯化介质的选择常用的蛋白质分离纯化介质有Sephadex和Seperose。理想的分离纯化介质应具有下列性质：对目标蛋白具有较高的分离效率对目标蛋白具有较高的
11、分离效率对目标蛋白不会造成变性对目标蛋白不会造成变性化学性能和机械性能稳定，重复性好化学性能和机械性能稳定，重复性好价格低廉价格低廉第十八张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月Protein purificationPreparation of the bacterial lysateIt is a critical step.Optimal conditions maximize cell lysis and the fraction of the recombinant protein that is extracted while minimizing protein oxidat
12、ion,unwanted proteolysis and sample contamination with genomic DNA.The lysis buffer should contain a strong buffer to overcome the contribution of the bacterial lysate,high ionic strength to enhance protein solubility,protease inhibitors and a reducing agent such as TECP to prevent oxidation of the
13、protein.第十九张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月About gel filtrationThe choice of gel filtration as the next step after IMAC may be surprising,considering its lower resolving power compared with ion exchange or other adsorption chromatography methods,but this step is often sufficient after IMAC if the protein was
14、abundant in the lysate.Moreover,gel filtration is more generic,can be performed in any buffer condition,and can be used to resolve the oligomerization state of the target protein.Superdex 75 and Superdex 200 prep grade,XK 16/60 columns are most useful for 1-30mg of protein in a sample volume of up t
15、o 7.5 ml.第二十张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月第二十一张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月分泌型战略表达重组蛋白的分离纯化策略要分泌的多肽有一个疏水的氨基突出，它负责向内质网的转运这个末端突出通常由大约20个氨基酸组成，并且在内质网中从成熟蛋白上剪切下来。人们已经利用含有合适重组质粒的酵母细胞分泌了大量的非酵母多肽，而且绝大多数情况下都用到了a-因子信号序列。第二十二张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月外源基因的表达产物，通过运输或分泌的方式穿过细胞的外膜进入培养基中，即为分泌型外源蛋白。外源蛋白以分泌型蛋白表达时，须在N端加入1530个氨基酸组成的信号肽
16、（signal peptides）序列。信号肽N端的最初几个氨基酸为极性氨基酸，中间和后部为疏水氨基酸，它们对蛋白质分泌到细胞膜外起决定性作用。当蛋白质分泌到位于大肠杆菌细胞内膜与外膜之间的外周质时，信号肽被信号肽酶所切割。以分泌型蛋白的形式表达外源基因的优点：分泌型可能使蛋白质按适当的方式折叠，有利于形成正确的空间构相，获得有较好生物学活性或免疫原性的蛋白质。甚至有些在细胞内表达时无活性的蛋白质分泌后则有活性。第二十三张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月分泌到细胞外周质的蛋白质产物较稳定，不易被细胞内蛋白酶所降解。简化了发酵后处理的纯化工艺。缺点：外源蛋白分泌型表达通常产量不高，有时
17、信号肽不被切割或在不适当的位置发生切割。第二十四张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月人肝再生增强因子在毕赤酵母中的表达、纯化和生物学活性的研究1、重组载体的构建特导引物设计，以特导引物设计，以pBV220-ALRpBV220-ALR质粒为模板扩增目的条带质粒为模板扩增目的条带构建酵母表达重组质粒，转化毕赤酵母构建酵母表达重组质粒，转化毕赤酵母GS115GS115重组蛋白的表达及鉴定重组蛋白的表达及鉴定rhALRrhALR的纯化的纯化第二十五张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月rhALR的纯化菌液上清经低盐透析后，超过DEAE-Sepharose FF柱的饱和吸附量上样，洗脱组分
18、脱盐后再上DEAE-Sepharose FF 柱，然后再用Sephades G-75 柱进一步纯化。第二十六张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月离子交换琼脂糖：离子交换琼脂糖：离子交换琼脂糖是携带离子交换琼脂糖是携带DEAEDEAE或或CMCM基团的基团的Sepharose CL-6BSepharose CL-6B DEAE-Sepharose（阴离子型）和CM-Sepharose（阳离子型）的离子交换介质具有硬度大、性质稳定，流速好，分离能力强等优点尤其是介质受pH和离子强度的影响所引起的膨胀和收缩效应较小，因此具有稳定的外形体积。第二十七张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月
19、离子交换介质的选择原则离子交换介质的选择原则对对pIpI=5=5的某酸性蛋白质的某酸性蛋白质当蛋白质为阴离子时，当蛋白质为阴离子时，在在pHpH5.5-9.05.5-9.0的范围内，的范围内，应首选应首选DEAEDEAE纤维素；纤维素；当蛋白质为阳离子时，当蛋白质为阳离子时，在在pHpH3.5-4.53.5-4.5的范围内，的范围内，应首选应首选CMCM纤维素纤维素1122334466778899101055pHpH+-蛋蛋白白质质净净电电荷荷等电点等电点吸附阴离子交换剂吸附阴离子交换剂吸附阳离子交换剂吸附阳离子交换剂pH pH pI pI pI（-）第二十八张，PPT共一百零五页，创作于20
20、22年6月What happens in ion exchange?sampleapplicationand washelutionequilibrationregeneration-+-anionexchangerbead第二十九张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月+-equilibrationanionexchangerbead第三十张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月-+-sampleapplicationand wash第三十一张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月-+-elution第三十二张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月-+regeneration
21、第三十三张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月离子交换层析的基本操作离子交换层析的基本操作层析柱平衡平衡缓冲液的用量至少为柱体积的平衡缓冲液的用量至少为柱体积的 2 2 倍倍平衡缓冲液的流速可略高于正常操作流速平衡缓冲液的流速可略高于正常操作流速平衡终点以流出液的离子浓度、导电性、平衡终点以流出液的离子浓度、导电性、pHpH值与缓冲液一致值与缓冲液一致 为准，其中为准，其中pHpH值最重要值最重要第三十四张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月离子交换层析的基本操作离子交换层析的基本操作样品进柱为了达到满意的分离效果，进样量一般为介质交换容量的为了达到满意的分离效果，进样量一般为介质
22、交换容量的10-20%10-20%为了避免进样溶液中的离子强度过高，样品浓度不宜太高为了避免进样溶液中的离子强度过高，样品浓度不宜太高交换容量：离子交换剂中全部可交换的离子或功能基团的总数交换容量：离子交换剂中全部可交换的离子或功能基团的总数第三十五张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月离子交换层析的基本操作离子交换层析的基本操作样品洗脱恒定洗脱恒定洗脱阶段洗脱阶段洗脱梯度洗脱梯度洗脱101020203030404050506060707080809090分子浓度分子浓度离子强度离子强度pHpH值值第三十六张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月阴离子交换法色谱条件：DEAE-Sep
23、harose FF 阴离子交换填料；XK26/20色谱柱，体积89.32ml;8ml/min;0.2灵敏度A液：5ommol/L Tris-Hcl(pH8.0)B液：50mmol/L Tris-Hcl+1 mol/NaCl(pH8.0)以A液为平衡液，B液为100%洗脱液，各洗脱浓度由Pharmacia FPLC系统自动将A液和B液混合产生。第三十七张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月阴离子交换层析：透析上清超过饱和吸附量上样后，目的蛋白主要集中在0.1mol/L NaCl洗脱峰，但还含有很多杂质；在1mol/L NaCl 洗脱峰中只存在少量目的蛋白超饱和上样的0.1mol/L NaC
24、l 洗脱峰脱盐后再上样，目的蛋白集中在0.2mol/L NaCl 洗脱峰，杂质含量已较少。第三十八张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月第三十九张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月凝胶层析凝胶层析的基本原理凝胶介质的基本性质凝胶介质的选用原则凝胶层析的基本操作第四十张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月凝胶层析的基本原理凝胶层析的基本原理 凝胶层析是凝胶层析是利用有一定孔径范围的利用有一定孔径范围的多孔凝胶多孔凝胶作为固定相，对混合作为固定相，对混合物中各组份按分子大小进行分离的层析技术，又称为物中各组份按分子大小进行分离的层析技术，又称为分子筛分子筛 分子直径比凝胶最大孔
25、隙直径大的，会被全部排阻在凝胶颗粒之分子直径比凝胶最大孔隙直径大的，会被全部排阻在凝胶颗粒之外，即外，即全排阻；全排阻；两种全排阻的分子即使大小不同，也不能分开；它们两种全排阻的分子即使大小不同，也不能分开；它们下行速度快下行速度快 分子直径比凝胶最小孔隙直径小的，能进入凝胶颗粒的全部孔隙分子直径比凝胶最小孔隙直径小的，能进入凝胶颗粒的全部孔隙即使大小不同也不能分开；它们的下行速度慢即使大小不同也不能分开；它们的下行速度慢 鉴于上述原理，鉴于上述原理，凝胶层析可用于重组蛋白溶液脱盐、分子量测定凝胶层析可用于重组蛋白溶液脱盐、分子量测定以及以及分离纯化分离纯化。第四十一张，PPT共一百零五页，创
26、作于2022年6月凝胶介质的基本性质凝胶介质的基本性质 葡聚糖凝胶的种类有葡聚糖凝胶的种类有G10G10、G15G15、G25G25、G50G50、G75G75、G100G100、G150G150G200G200，G50G50即表示每克即表示每克干凝胶的吸水量为干凝胶的吸水量为5.05.0毫升毫升 葡聚糖凝胶对碱比较稳定，在酸性环境中其糖苷键易水解葡聚糖凝胶对碱比较稳定，在酸性环境中其糖苷键易水解 湿态的葡聚糖可加热到湿态的葡聚糖可加热到110110，干的则能耐受，干的则能耐受120120高温高温葡聚糖凝胶（Sephadex）Sephadex LH Sephadex LH是羟丙基化的是羟丙基化
27、的SephadexSephadex，这类层析介质的流动相既这类层析介质的流动相既可使用缓冲水溶液，也可使用极性有机溶剂，因此可使用缓冲水溶液，也可使用极性有机溶剂，因此适用于非水溶性溶适用于非水溶性溶 质的凝胶过滤质的凝胶过滤 第四十二张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月凝胶介质的选用原则凝胶介质的选用原则 将样品中的大分子物质与小分子物质分开，称为组别分离，其分将样品中的大分子物质与小分子物质分开，称为组别分离，其分离策略是离策略是使高分子物质完全被排阻使高分子物质完全被排阻，小分子物质完全渗入凝胶内。小分子物质完全渗入凝胶内。组别分离一般选用组别分离一般选用Sephadex G-2
28、5Sephadex G-25或或G-50G-50，对于小肽和低分子量对于小肽和低分子量的物质（分子量范围的物质（分子量范围1000-50001000-5000）的脱盐可选用）的脱盐可选用Sephadex G-10Sephadex G-10、G-G-组别分离1515、Bio-Gel P-2Bio-Gel P-2或或P-P-44第四十三张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月 将样品中一些分子量比较接近的物质分开，这种分离叫分级分离将样品中一些分子量比较接近的物质分开，这种分离叫分级分离该策略是该策略是使高分子物质完全被排阻使高分子物质完全被排阻，小分子物质完全渗入凝胶内。小分子物质完全渗入凝
29、胶内。分级分离一般选用分级分离一般选用排阻限度略大于样品中最高分子量物质的凝胶排阻限度略大于样品中最高分子量物质的凝胶在层析过程中，样品中各组份均能不同程度地深入到凝胶内部，但由在层析过程中，样品中各组份均能不同程度地深入到凝胶内部，但由分级分离于深入凝胶空隙程度上的差异，最后得到分离。于深入凝胶空隙程度上的差异，最后得到分离。第四十四张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月凝胶层析的基本操作凝胶层析的基本操作平衡溶液的流速应低于层析时需要的流速平衡溶液的流速应低于层析时需要的流速注意凝胶的断层和气泡注意凝胶的断层和气泡层析柱平衡操作压控制平衡和洗脱时应维持流速恒定平衡和洗脱时应维持流速恒
30、定恒定的操作压是恒流的先决条件恒定的操作压是恒流的先决条件第四十五张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月上柱样品溶液的体积根据分离要求来确定：上柱样品溶液的体积根据分离要求来确定：进样体积进行组别分离时，样品溶液最大可为柱体积的进行组别分离时，样品溶液最大可为柱体积的10%10%进行分级分离时，样品溶液的体积要小，使样品层尽可能进行分级分离时，样品溶液的体积要小，使样品层尽可能窄，这样洗脱出的峰形好窄，这样洗脱出的峰形好第四十六张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月凝胶色谱层析色谱条件：Sephadex G-75凝胶填料；XK16/80色谱柱，体积160.75ml;1ml/min;
31、0.2灵敏度。洗脱液：0.9%NaCl(pH5.5)第四十七张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月 洗脱第洗脱第1 1峰主要为峰主要为rhALRrhALR四聚体；洗脱第四聚体；洗脱第2 2峰峰为目的蛋白峰，为目的蛋白峰，rhALRrhALR二聚体，纯度大于二聚体，纯度大于95%95%，rhALRrhALR最后得率为最后得率为52%52%。第四十八张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月包涵体型战略表达重组蛋白的分离纯化策略包涵体：在一定条件下，外源基因的表达产物在大肠杆菌中积累并致密地集中在一起形成无膜的裸露结构，这种结构称为包涵体。包涵体存在部位：细胞质、细胞周质第四十九张，PPT
32、共一百零五页，创作于2022年6月包涵体的组成蛋白质非蛋白质外源基因的表达产物：占大部分，具有正确的氨基酸序列，但空间构相错误，因而包涵体蛋白一般没有生物学活性。受体细胞本身的表达产物：如RNA聚合酶、核糖核蛋白、外膜蛋白以及表达载体编码的蛋白等。：包括DNA、RNA和脂多糖等。包涵体形成的本质是细胞内蛋白质的不断聚集，主要包括三个方面：折叠状态的蛋白质的聚集作用；非折叠状态的蛋白质的聚集作用；蛋白质折叠中间体的作用。第五十张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月 当重组蛋白以包涵体形式存在时，可获得高表达、高纯度的重组蛋白，当重组蛋白以包涵体形式存在时，可获得高表达、高纯度的重组蛋白，避
33、免蛋白酶对外源蛋白的降解，但不具有生物活性。避免蛋白酶对外源蛋白的降解，但不具有生物活性。要对其进行分离纯化，就需要对包涵体进行变复性处理。然要对其进行分离纯化，就需要对包涵体进行变复性处理。然而不论以那种表达形式产生的重组蛋白。其纯化的方法都与传统而不论以那种表达形式产生的重组蛋白。其纯化的方法都与传统的生物大分子分离方式相似。包涵体的分离纯化也是利用其物理的生物大分子分离方式相似。包涵体的分离纯化也是利用其物理和化学性质的差异。即以分子的大小、形状、溶解度、等电点、和化学性质的差异。即以分子的大小、形状、溶解度、等电点、亲疏水性以及与其它分子的亲和性等性质建立起来的。亲疏水性以及与其它分子
34、的亲和性等性质建立起来的。由于包涵体难溶，必须首先将其溶解后才能进行蛋白纯化，可由于包涵体难溶，必须首先将其溶解后才能进行蛋白纯化，可以用变性剂以用变性剂(尿素或盐酸胍尿素或盐酸胍)溶解包涵体，这样获得的重组蛋白产量虽高，溶解包涵体，这样获得的重组蛋白产量虽高，却会破坏蛋白质的二级结构，需经蛋白复性才可能恢复它的生物活性。却会破坏蛋白质的二级结构，需经蛋白复性才可能恢复它的生物活性。包涵体的分离纯化第五十一张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月主要方法金属亲和层析凝胶过滤层析离子交换层析疏水层析双水相萃取技术反胶团相转移技术第五十二张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月Intera
35、ction between neighboring residues in the 6His tag and Ni-NTA matrix第五十三张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月第五十四张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月第五十五张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月Purification mechanism of recombinant His-tagged proteinsAdvantages:easy to identify and purify第五十六张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月人细胞周期蛋白D1在大肠杆菌BL21中的表达及纯化1 原核表达载体
36、的构建pUC118-cycDpET-28c(+)EcoR IT4DNA连接酶连接酶pET-28c-cycDDH5,鉴定克隆子阅读框架的正确性鉴定克隆子阅读框架的正确性第五十七张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月第五十八张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月2 融合基因在大肠杆菌中的诱导表达pET-28c-cycD提取质粒，转入提取质粒，转入BL21表达宿主表达宿主30g/ml Kan,LB37 过夜培养，之后按过夜培养，之后按1：100转接转接OD600=0.6 IPTG=0.1mmol/L诱导表达，每隔诱导表达，每隔1小时取样，确定最佳时间为小时取样，确定最佳时间为4小时小时第
37、五十九张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月pET-28c-cycD转化的菌株经IPTG诱导后在分子量约43 000处出现一条蛋白条带。灰度扫描分析表明目的基因在IPTG诱导4h后表达量最大，约占菌体总蛋白的23。分别对表达菌体的裂解上清和沉淀进行12 SDS-PAGE分析，发现目的蛋白主要分布在裂解沉淀中，说明表达的CyclinD1蛋白以包涵体形式存在。第六十张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月3 包涵体的洗涤与变性大量诱导表达后，离心收集菌体大量诱导表达后，离心收集菌体0.1倍培养物体积的溶液倍培养物体积的溶液A悬浮悬浮超声裂菌4 000 g于于4 离心离心15 min，回收
38、的沉淀即为粗制包涵体，回收的沉淀即为粗制包涵体0.5 Triton X-100和2 molL尿素的磷酸缓冲液依次洗涤悬于溶液悬于溶液B搅拌溶解1 h12 500 g，30 min离心，收集上清离心，收集上清第六十一张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月溶液A：20 mmol/L磷酸钠，500 mmol/L NaCl，10 mmol/L咪唑，0.1 mmol/L PMSF，1 mmol/L巯基乙醇，pH=7.4磷酸缓冲液:20 mmol/L磷酸钠,500 mmol/L NaCl，pH=7.4溶液B:8 mol/L尿素，20 mmol/L磷酸钠500 mmol/L NaCl，10 mmol/
39、L咪唑，0.1 mmol/L PMSF，1 mmol/L巯基乙醇，pH=7.4第六十二张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月重组菌制备包涵体经洗涤后，用8 mol/L尿素变性，加到HisTrap HP Ni 螫合亲和层析柱上，利用咪唑置换，洗脱下特异结合的蛋白。洗脱蛋白经12的SDSPAGE分析表明，纯化的表达产物在分子量43 0o0处显示出一条蛋白带，凝胶薄层扫描分析纯度达98 以上。第六十三张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月4 目的蛋白的亲和层析纯化和复性变性上清变性上清微孔滤膜过滤预先用溶液预先用溶液B平衡过平衡过HisTrap HP柱柱l0倍柱体积的缓冲液倍柱体积的缓冲
40、液Bl0倍柱体积的缓冲液倍柱体积的缓冲液C洗柱洗柱5倍柱体积缓冲液倍柱体积缓冲液D特异性洗脱，分步收集，每管约特异性洗脱，分步收集，每管约1 mL第六十四张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月缓冲液C：缓冲液B中含20 mmol/L咪唑缓冲液D:缓冲液B中含500 mmol/L咪唑第六十五张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月收集液进行收集液进行12的的SDS-PAGE检测检测合并含有目的蛋白的各管样品，适当稀释，装入透析袋复性合并含有目的蛋白的各管样品，适当稀释，装入透析袋复性含含6 molL尿素的磷酸缓冲液尿素的磷酸缓冲液4 透析过夜透析过夜分别用分别用4 mol/L,3 mo
41、l/L,2 mol/L,1 mol/L,0.5 mol/L的梯度透析各的梯度透析各4 h以上以上PBS缓冲液透析过夜缓冲液透析过夜蛋白溶液在蛋白溶液在44 下下12 500 g离心离心20 min上清即为可溶性复性蛋白，冻干后备用上清即为可溶性复性蛋白，冻干后备用第六十六张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月纯化的目的蛋白采取逐步降低尿素浓度的分段透析复性方法，除去蛋白溶液中的尿素，使变性的蛋白在此过程中自然复性，获得复性的重组CyclinD1蛋白的纯度达-98 以上第六十七张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月Western blot检测表达产物BL21(DE3)菌裂解液菌裂解液
42、,诱导诱导4 h的转化菌裂解液的转化菌裂解液,纯化的融合蛋白纯化的融合蛋白SDS-PAGE电转移至硝酸纤维素电转移至硝酸纤维素(NC)膜上膜上封闭封闭抗抗CyclinD1单克隆抗体和辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠单克隆抗体和辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG进行孵育进行孵育二氨基联苯二胺二氨基联苯二胺(DAB)显色显色第六十八张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月第六十九张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月融合表达蛋白的分离纯化 与纯化包涵体相比，细胞质中以可溶性形式表达蛋白质的分离纯化过程比较复杂，一般要通过亲合层析才能达到比较高的纯度。目标蛋白与有亲合配基的序列融合表达既可
43、以提高分离纯化的效率，又能在融合蛋白切离的过程中得到没有附加甲硫氨酸目标蛋白。金黄色葡萄球菌蛋白G、A和衍生物Z，日本血吸虫谷胱甘肽-S-转移酶，大肠杆菌麦芽糖结合蛋白，His-tag 等是目前常用的与目标基因融合表达的序列。第七十张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月第七十一张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月第七十二张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月表达融合蛋白的优点(1)融合蛋白较稳定，不易被细菌蛋白酶水解。(2)如果大肠杆菌的结构基因是一段信号肽，可产生分泌型产物。(3)可利用针对原核部分的单抗进行亲和层析，便于纯化。(4)原核蛋白部分可用蛋白酶切掉，释放出天然
44、的真核蛋白质。(5)目的蛋白溶解性好，由于受体蛋白的存在，融合蛋白往往能在胞内形成良好的空间构象，且大多具有水溶性。第七十三张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月节杆菌乙内酰脲水解酶与GST蛋白融合表达及纯化GST结合位点结合位点第七十四张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月GST-融合蛋白的表达和纯化流程第七十五张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月结核分枝杆菌16kDa与GST融合表达及纯化1、16kDa基因的扩增与表达载体的构建设计带有酶切位点的上下游引物设计带有酶切位点的上下游引物5-TCAGAATTCATGAAGCTCACCACAATGA-3(EcoRI)5-TCA
45、CTCGACCTACGGCTCCCAAATCAGC-3(Sal I)扩增目的基因扩增目的基因双酶切产物及载体双酶切产物及载体pGEX-6P-1连接转化大肠杆菌转化大肠杆菌DH5a及及JM109感受态细胞感受态细胞双酶切及测序验证双酶切及测序验证第七十六张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月第七十七张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月第七十八张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月2、融合蛋白在大肠杆菌中的表达挑取阳性克隆接种于挑取阳性克隆接种于LA培养基活化培养基活化37，200r/min,6h分别取分别取50 L转接于转接于5mL LA37,OD600 0.5-0.8加入加
46、入IPTG 1mmol/L 每隔每隔1h收集菌体收集菌体重悬菌体重悬菌体SDS-PAGE检测检测取少量培养物，离心收集沉淀（作为空白对照）取少量培养物，离心收集沉淀（作为空白对照）37，230r/min,3h第七十九张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月第八十张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月3、融合蛋白的纯化收集菌体收集菌体重悬于裂解液，超声裂菌，离心重悬于裂解液，超声裂菌，离心取上清加入取上清加入4 mL谷胱甘肽树脂颗粒谷胱甘肽树脂颗粒4,230r/min结合结合3h离心去上清，加入离心去上清，加入PBS混匀，离心去上清洗涤混匀，离心去上清洗涤5次次沉淀中加入沉淀中加入GS
47、T660 L4,230r/min,10min离心，上清即为纯化蛋白离心，上清即为纯化蛋白裂解液裂解液：PBS,PMSF:5mg/mL，DTT:5mg/mL,Tween 20:10mg/mL，溶菌酶:10mg/mL第八十一张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月第八十二张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月A strategy for high-level expression of soluble and functional human interferon a as a GST-fusion protein in E.coliConstruction of recombinant
48、 pGEX-hIFNa2bexpression vectorhINFa2b cDNA was cloned by an RTPCR approach using mRNA prepared from healthy individual leukocytes exposed in vitro to the Newcastle disease virusThe cDNA corresponding to the IFNa2b published sequence was amplified using a forward primer that introduced an EcoRI site
49、at the 5 end of the gene(5-TGGAATTCTGTGATCTGCCTCAAACCCA-3)and a reverse primer containing the XhoI site at the 30 end of the gene(5-CGCTCGAGTCATTCCTTACTTCTTAAACTTTC-3)purified PCR productdigested with EcoRI and XhoI restriction enzymesinserted into the plasmid pGEX4T1第八十三张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月Screen
50、ing of pGEX4T1/IFNa2b recombinant plasmids containing the cDNA sequence encoding hIFNa2b was performed by a restriction mapping analysis using Bgl II restrictionthe nucleotide sequence of the selected clones was checked by automated DNA Sequencing Analysis using the ABI-PRISM377 DNA sequencer第八十四张，P