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1、流式细胞术的质量控制本讲稿第一页，共三十六页一、标本的采集和固定方法的质量控制一、标本的采集和固定方法的质量控制 标本采集是十分重要的环节，在标本的采集过程，需注意：手术切除的新鲜标本或活检针吸标本取材时，要避免出血坏死组织。标本采集后要及时固定或深低温保存，以免组织发生自溶，DNA降解，而造成测试结果的误差。固定剂要采用对组织细胞穿透性强的浓度。本讲稿第二页，共三十六页n例如70%的乙醇固定比75%以上的浓度固定效果好，高浓度的乙醇常造成细胞表面快速形成一个蛋白膜，致使细胞内的物质固定不良，有作者分析研究了自溶对DNA测定的影响，发现自溶的组织细胞常出现假性异倍体，且不固定的组织细胞随时间的
2、延长，DNA含量呈梯度降低，n根据检测的目的，选择什么类型的固定剂，对流式检测质量也有显著的影响，例如细胞DNA的分析，使用醇类固定剂较好而不选择醛类固定剂，醛类固定剂明显影响细胞DNA荧光发射强度，实验证明，醛类固定剂对插入性荧光染料与核酸的结合有很强的干扰作用，其荧光强度仅相当于新鲜组织荧光强度的50-70%左右。本讲稿第三页，共三十六页n如果作流式免疫研究工作，采用新鲜组织是最好的选择，在不能及时检测又没有低温保存条件时，要根据所测物质在细胞内还是在细胞膜表面，在膜表面的抗原物质，以醛类固定剂为宜，尽管醛类固定剂产生的非特异性荧光较强，但不宜采用醇类固定剂，因醇类固定剂可使细胞表面的糖蛋
3、白、脂蛋白脱落丢失，失去标记的位点。n如所测抗原物质在细胞内，可以使用醇类固定剂，这种固定方法简便易行，无需特殊低温冷冻条件，在一般冰箱(0-4)放置即可，能很好的保持细胞形态和生物化学成分不发生变性。本讲稿第四页，共三十六页二、单细胞悬液制备的质量控制二、单细胞悬液制备的质量控制n人体的末梢血液和骨髓细胞及淋巴组织是人体组织中缺乏细胞间连结装置的组织，尤其是血和骨髓细胞是天然的单分散细胞材料，其中的细胞成分在生理状态下呈单分散状态，它是流式分析最合适的样品来源，全血中含有多种有形成分，流式细胞检测是以某一群细胞为检测对象，因此在检测前须将所测的某群细胞成分分离出来，例如，以淋巴细胞DNA定量
4、分析为例，就须把淋巴细胞分离出来，而将其他有核细胞或红细胞去除，对于血小板的分析样品制备过程中须防止过高离心速度造成血小板膜的损伤，出现血小板凝集。本讲稿第五页，共三十六页n新鲜实体组织单细胞样品的制备，实体组织是流式分析工作的主要材料来源，但对其分散单细胞样品的技术和方法，仍存在着很多问题，仍需大量的探索工作，就目前，国内外对实体组织分散单细胞还没有找到一个适用的又通用方法，甚至同样组织，用于不同的实验目的，就需要不同的方法处理，或者每一种组织就是一个单独的问题，因此必须根据实际情况，去选择合适有效的单分散方法，选用的方法必须达到细胞产量高，细胞损伤小的目标，但实际工作中达到这个目标是困难的
5、，多年来对于实体组织的分散解聚多采用酶学法，化学法、机械物理方法以及低渗脱核方法等，根据各种组织的特点，以及实验目的的不同，可选择不同的方法。本讲稿第六页，共三十六页选则酶学方法时，应注选择使用酶类型的问题，含有大量结缔组织的组织器官，选择胶原酶好，不宜选择胃蛋白酶或膜酶，并要注意酶的活性条件和影响因素，要注意酶的溶剂，消化时间，pH值，浓度等方面对酶活性的影响，酶学方法分散组织都有一定的应用限制，特别用于流式免疫荧光实验时，酶处理可能改变或丢失膜的抗原成分，从而影响分析结果，由于酶学方法分散下来的细胞产量低，用组织较多，还要注意酶的纯度，活性单位，以及生产厂家对酶的污染。本讲稿第七页，共三十
6、六页化学方法，往往单独应用分散组织效果不理想，应与酶学方法综合使用，分散效果更佳。机械方法，常采用剪碎，网搓研磨，细针抽吸等，对细胞损伤大，产生的细胞碎片多，细胞团块多，在使用机械法时，要给于组织适当的压力，这种适当的压力需要有较多的制样实践经验技术人员来操作。低渗方法，其溶液是一种低渗液体，造成细胞膜的破坏，使细胞核自行释放出来，是一个裸核悬液样品，本方法简便，可以改变样品的变异系数，但要避免脱核时间过长，造成核膨胀碎裂。本讲稿第八页，共三十六页 以上几种方法是目前对实体组织解聚常用的方法，往往不是单用，常常是一种或二种方法的结合使用，总的来说，对实体组织分散为单细胞还存在很多困难，因此还需
7、要深入探讨流式样品的制备技术，制备出完整细胞产量高，细胞损伤小的合格悬液,获得更好的流式检测结果。本讲稿第九页，共三十六页三、石蜡包埋组织单细胞制备的质量控制三、石蜡包埋组织单细胞制备的质量控制n石蜡包埋组织标本的材料选择，应经病理医师仔细检查，选取无自溶，坏死的组织对肿瘤组织标本，选取含肿瘤组织细胞丰富的区域，且经病理形态或细胞学核实病理诊断。n切取适当厚度的石蜡组织片，大量研究证明，切取40-50m厚度的切片是适宜的，过厚的组织片消化费时，消化下来的细胞数少，过薄的切片可产生大量的细胞碎片，影响检测结果，使肿瘤异倍体的检出率减少，我们研究了石蜡切片不同厚度(5,10,20,30,40,50
8、m)对流式分析DNA影响发现较薄的切片造成碎片较多,噪音增加,组方图的基线提高,影响倍体分析的精度。本讲稿第十页，共三十六页n在组织脱蜡的过程中，一定将蜡脱净，残留的石蜡可，影响酶的消化活性，检查是否将蜡脱净的方法是弃去二甲苯(Hedley强调用Histoclear，即组织清洗剂代替二甲苯脱蜡，效果更好)，加入100%乙醇，如果无絮状物浮起，示蜡已脱净n梯度酒精(100%70%50%)水化要充分,使组织还原到与新鲜组织相似的状态。n消化酶液要掌握适当的浓度、pH值、温度等，不造成酶的活性降低为宜，消化时间很重要，时间短细胞消化不下来，时间长，消化下来的细胞又被破坏，在制备石蜡包埋单细胞时，常规
9、使用0.5%胃蛋白酶PH 1.5。本讲稿第十一页，共三十六页n石蜡包埋组织的单细胞制备方法的建立，使流式细胞术在医学研究中得到更广泛的应用，但仍存在一些问题有待进一步解决，主要存在问题如下：样品中的碎片较多，所测得的DNA组方图质量不及新鲜组织好，组方图的峰位较宽CV值偏大。异倍体率减少，由于组方图细胞峰CV值较大，一些近于二倍体的DNA异倍体峰被掩盖。S期细胞百分比不如新鲜组织的S期计算精确，S期细胞的计算偏高，这仍然与CV值较大有关本讲稿第十二页，共三十六页 DNA二倍体标准不稳定，Schutter等发现用新鲜正常组织的二倍体细胞或者用其他生物细胞 DNA含量(例如，鸡红细胞，鳟鱼血细胞等
10、)作为石蜡包埋组织细胞DNA含量的标准不适用，石蜡包埋组织比新鲜组织细胞DNA荧光强度低，且样品间的荧光强度不稳定，解决DNA二倍体标准不稳定的办法，可将正常组织与肿瘤组织作为一个内标的二倍体标准参照，可减少DNA倍体分析的误差，对存档中的石蜡包埋组织材料，可以采用正常组织石蜡包埋标本，作为一个外参的二倍体标准，但要求采用的外参二倍体样品和肿瘤样品中加入内标准样品(例如鸡血细胞等)。本讲稿第十三页，共三十六页四、脱落细胞样品的采集四、脱落细胞样品的采集 脱落细胞样品的采集要保证足够的细胞数，在临床实际工作中，可以收集到大量自然脱落的细胞标本，这些细胞标本经简单处理后，即可得到较好的单分散细胞，
11、例如胸腹水，内镜刷检细胞，膀脱冲洗液等，这些材料得到的流式检测结果，要小心谨慎的分析解释，结果的生物学意义，因这些材料获得前结果常出现阴性或假阳性结果，因其中的白细胞常有变性，且样品细胞数量少，制备出一个合格的单细胞样品，其细胞数要求在1106/ml，其杂质碎片团块重叠细胞应小于2%以下，否则应放弃检测，对肿瘤细胞DNA异倍体的分析样品中，至少应有20%的肿瘤细胞存在，(因占主峰1/5以上的异倍体峰才可确认为异倍体)。本讲稿第十四页，共三十六页 五、细胞悬液荧光染色的质量控制五、细胞悬液荧光染色的质量控制 单细胞悬液样品荧光染色对流式定量分析的精度很重要，目前常使用的荧光染料有EB、PI、DA
12、PI、AO、FITC、PE等，对细胞染色时应特别注意染料的特性及量效关系，定量细胞学荧光染色易受到多种因素的影响，以致造成不正确的测定结果，了解荧光染色的影响因素，将有助于在荧光定量细胞学分析中，尽可能避免测量误差，并进行有效的校正措施，如下的一些常见影响因素需特别注意。本讲稿第十五页，共三十六页 温度对荧光染色强度的影响温度对荧光染色强度的影响：n在一般情况下，环境温度的升高对荧光染色有明显的影响，温度升高可造成溶液粘滞性增加，溶剂和荧光染料分子的动力增大使荧光猝灭的可能性增加，这就使荧光分子和其他分子之间的相互碰撞几率增加，因此，影响了荧光分子发光量子产额。n一般认为，温度升高时，荧光减弱
13、，荧光减弱的百分比称温度系数，就一般荧光物质而言，温度系数大约为1%，如果温度在20时，一般荧光染料即出现温度猝灭效应，随温度的升高，荧光猝灭作用越强以致造成完全猝灭，温度在20以下，荧光分子发光量子产额的变化不明显，基本上保持恒量，因此在荧光测定时要保持染色后的样品在适当低温环境下选行，尽可能减少样品的照射时间，有条件时应使样品观察室做到恒温装置，会得到更好的荧光定量结果。本讲稿第十六页，共三十六页2.荧光染色液的浓度与荧光发射强度有直接比例荧光染色液的浓度与荧光发射强度有直接比例关系：关系：n在溶液较稀时，荧光强度与浓度成比关系，随浓度加大，荧光强度也增大，当荧光染料达到一定浓度时，如继续
14、增加浓度不仅不会使荧光强度有相应的增加，反而使荧光强度减低，这种因染料浓度增大使荧光量子的产额下降的现象称为浓度猝灭现象，因此在研究浓度与荧光强度关系时，必须检查所得的荧光值是曲线高峰前的浓度，还是曲线高峰后的浓度(方法是减少溶液浓度，如荧光减弱则为高峰前浓)。n浓度造成荧光猝灭原因,主要是缔合分子形成,缔合分子中的电子共振作用,而消耗了激发分子的能量而参与猝反作用。本讲稿第十七页，共三十六页n实验表明，当溶液稀释后，荧光染料分子之间的相互作用完全消失时,荧光量子产额最大，荧光强度发射最强，当溶液浓度增加时，荧光分子之间发生碰撞效应，各能级间的干扰明显增加，从而引起荧光量子产额下降，另一个主要
15、原因由于荧光染料浓度增加过大时，造成荧光分子不均匀分布，靠近入射光面的吸收光强，而进入溶液深层时，光吸收越少，发出的荧光分子也越少，称这种现象为内滤光效应(Interfilter Ef-fect)。n鉴于荧光染料浓度对荧光强度的影响之大，因此要选择最合适的浓度，对于荧光定量检测技术是极其重要的。本讲稿第十八页，共三十六页3.pH 值对荧光发射强度的影响值对荧光发射强度的影响：n荧光分子在溶剂中处于离子化状态，因此，溶液中的氢离子浓度对荧光强度影响极大，荧光分子发光的最有利条件是其在溶剂中呈离子化或极化状态，从而通过染料分子本身所具有的斥力作用尽可能避免分子之间的相互碰撞作用，每一种荧光分子的发
16、光量的产额最高，都有自己合适的pH值。4.其他一些影响荧光强度的因素其他一些影响荧光强度的因素：n像醛类固定剂(戊二醛，甲醛),可以干扰荧光染料与核酸分子的结合,像溶剂中的一些不发光的物质(如溴化物、碘化物、氨基苯、硝基苯、铁、银离子等)均可造成荧光的猝灭现象。本讲稿第十九页，共三十六页 六、流式细胞仪器操作技术的质控六、流式细胞仪器操作技术的质控 为使流式细胞在整个实验过程中，各种液流系统电子和各个光学系统的调整处于最佳工作状态，能保证定量检测的准确性和检测精度，应调整仪器的变异系数在最小范围，分辩率在最好的状态，为避免在测量过程中仪器条件的漂移，可能引起定量检测的误差，一个校正仪器的参考标
17、准样品的使用是必不可少的。1.对流式细胞仪的线性校正对流式细胞仪的线性校正 常使用不同大小的荧光微球来测量，仪器的线性会对细胞的定量分析的精度产生显著影响，如果仪器处于非线性状态，对定量细胞DNA含量和细胞周期分布有重要的影响，在定量分析时常常使用的是线性测量，所以对于校正仪器线性的精度尤为重要。本讲稿第二十页，共三十六页2.流式细胞仪的变异系数流式细胞仪的变异系数(CV值值)n流式细胞仪的变异系数是光学元件校正，准值的精确度，CV值是评价仪器精度的很重要的指标，仪器是否准直。n校正是通过一个非生物样品(荧光微球)或生物细胞样品(人淋巴细胞，鸡细细胞等)的检测来验证，这校正仪器的样品即为标准样
18、品，其物理性质、生物学性质、化学性质相对一致。n对于这样一个标准样品，其CV值应越小越好，CV值越小说明仪器准直校正的精度越高，对于一个非生物的荧光微球，一般CV值在2-3.0%左右。本讲稿第二十一页，共三十六页n对于其他正常二倍体细胞含量的组方图的CV值应小于8%，如果大于8%，这个样品应舍掉，对于肿瘤细胞样品的CV值可以大于8%，这与肿瘤细胞异质性有关，对于生物细胞样品本身的生化成分含量的异质性大小，固定方法，处理程序和荧光染色等都可能造成CV值的变化。n一般认为，实测结果CV值包括两部分，一个CV值是使用标准样品测得的仪器CV值，另一个CV值是实验样品所测得的值，这个CV值，是实验样品和
19、仪器CV值的总和。本讲稿第二十二页，共三十六页 对对于于校校正正仪仪器器的的标标准准样样品品则则有有一一些些特特殊殊要要求求：样品要求物理、化学性质稳定，不随时间、温度、压力而变化，样品所带有的荧光物质也要稳定，样品的形态大小一致。每个粒子不发生粘连，易长期保存，其光学特性，测量产生的各种参数与体积、大小呈比例关系，标准样品对于成功操作仪器系统是极其重要的。流流式式细细胞胞仪仪的的分分选选技技术术在在细细胞胞生生物物研研究究中中具具有有很很重重要要的的价价值值，但由于光学电学流体力学，超声振荡装置的操作更具有高度的操作精度，分选技术不能常规应用于临床医学细胞标本的分选。本讲稿第二十三页，共三十
20、六页七、流式细胞分析资料处理的质量控制七、流式细胞分析资料处理的质量控制n样样品品的的中中碎碎片片杂杂质质和和团团块块过过多多，所测细胞数仅占20%以下，组方图的基线抬高，尤其不能进行细胞周期分析，尽管目前有计算机的硬件删除或软件补偿来消除碎片和团块的影响，也应放弃不作分析处理。n一个样品细胞数检测应在一个样品细胞数检测应在1万个细胞万个细胞(不包括碎片、杂质、团块)如果单独作DNA倍体分析而不作细胞周期的处理，小于1万个细胞也可以，但异倍体细胞占总细胞数的10%以下时，不可盲目下结论，至少异倍体细胞占总细胞的20%以上，可以确定异倍体的存在。本讲稿第二十四页，共三十六页n正常二倍体细胞组方图
21、的正常二倍体细胞组方图的CV值大于值大于8%以上以上，因放弃细胞周期的分析，但肿瘤细胞CV值大于8%，这与肿瘤细胞DNA异质性增大有关。n对于一个正常人体的二倍体细胞群对于一个正常人体的二倍体细胞群，G0/1期细胞占85-90%左右，S+G2M细胞占10-15%，但在同一个体的不同正常组织，细胞DNA含量也有漂移，在不同个体的同源组织也会出现10%的漂移。nS期细胞计算准确性期细胞计算准确性，S期细胞作为评价肿瘤的增殖活性又大量报道认为，S期有明显的临床预后意义，但由于在S期计算方面的误差,而造成评价S期在肿瘤生物学行为不确切性.本讲稿第二十五页，共三十六页 对于S期细胞计算较准确的方法，就是
22、分别作两次样品的检测，加入DNA倍体标准样品检测一次，不加二倍体标准的样品检测一次，GO/1峰应是一个正态分布(或称高斯分布)但实际测量过程,有部分组方图有时会出现GO/1峰的右偏峰或脱尾(Teiling)现象，或出现一个右或左侧的峭峰(Kurtosis)，造成S期细胞计算的不准确性，对于这样峰位，除了可用计算机软件加以消除外，可放弃S期的计算，对于二倍体肿瘤的S期细胞或G2M期细胞的计算，大多数作者认为不能作为真正二倍体肿瘤的S期，因其中包括了正常二倍体细胞的S期，可以采用一些特殊标记或多参数分析二倍体肿瘤的S期或单独作为二倍体肿瘤样品的检测而不加二倍体内标准。本讲稿第二十六页，共三十六页n
23、DNA倍体标准的质量控制倍体标准的质量控制：DNA倍体的标准是根据正常二倍体细胞DNA含量的分布范围而确定的，对于二倍体的标准的选择，应遵照如下原则：采用同个体同源正常组织。同种固定方法。相同的样品处理方法。同样的染色方法,同步染色。同样的仪器检测条件。正常二倍体细胞作为内标准。本讲稿第二十七页，共三十六页 在不具备同个体，同源组织的情况下，可以使用鸡红细胞，或其他生物细胞为内参标准，作为计算倍体的标准细胞，但这种标准细胞的使用，仅限于新鲜组织倍体的判定，对于 石蜡包埋组织倍体标准，解决的办法是将正常组织与肿瘤组织同时包埋于一个石蜡组织块中，这样正常组织作为一个二倍体内标准,能减少DNA倍体分
24、析的误差。本讲稿第二十八页，共三十六页n假性异倍体的识别与排除假性异倍体的识别与排除：假性异倍体多出现在近二倍体肿瘤(Near diploid)或DNA指数小于1.30以下的异倍体肿 瘤。假性异倍体出现的原因主要有组织自溶 造成或在组织固定前或期间细胞DNA出现变 性(而非降解阶段)染色质结构发生变性与荧 光染料结合增加或减少，更多出现在异倍体 细胞数仅占总测细胞数的5-10%的情况下。本讲稿第二十九页，共三十六页对于二倍体为主峰的右侧出现的异倍体峰，用0.5%胃蛋白酶或1%的DNA酶消化3-5分钟，如果再测仍然出现异倍体峰可为真性异倍体，如果异倍体峰消失，则认为是假性异倍体。对于二倍体峰左侧
25、出现的异对于二倍体峰左侧出现的异倍体峰(称亚二倍体)要首先排除自溶的原因。另一种方法，可以采用传统遗传学染色体核型分析去伪存真，但也不是一个完美的识别及排除假性异倍体的方法。本讲稿第三十页，共三十六页有作者对染色体核型与DNA倍体进性了对比分 析研究，发现染色体倍体与DNA倍体之间仍有15%左右不符合，其中原因：染色体中的DNA含量增加(即每条染色体包装 增大)，而染色体条数未增加 染色体条数增加而总DNA含量未增加 染色体的DNA含量与荧光染料的结合不成比 例。本讲稿第三十一页，共三十六页八、流式免疫学检测的质量控制八、流式免疫学检测的质量控制 n在免疫荧光染色过程中常出现一些人为非特异性荧
26、光在免疫荧光染色过程中常出现一些人为非特异性荧光，造成本底荧光过高造成本底荧光过高，出现假阳性结果出现假阳性结果，常见的原因常见的原因有有：降低抗体非特异性结合的措施不够。洗涤不充分。细胞重叠和凝集团块。细胞碎片过多贴附在细胞上。本讲稿第三十二页，共三十六页n解决这些影响因素的方法解决这些影响因素的方法：使动物血清蛋白等封闭非特异性结合位点，荧光抗体染色后充分洗涤。减少重叠细胞和碎片。设对照样品，与抗体来源的同型对照和荧光抗体的本底对照。判定阳性标记和定量荧光分析时应注意减去本底荧光。为使免疫荧光的定量分析更精确，应用计算 机程序软件，用拟合曲线方法从实验组的曲 线峰值中减去对照组的曲线峰值，
27、采用本讲稿第三十三页，共三十六页 Histgroma substruct graph 程序定量分析,或用 Kolmogorov-Smirnov(KS.Test)程序分析，均 可得到更准确的免疫荧光定量分析结果。对于免疫荧光染色过程中，还应注意到膜能 量的转换，出现荧光的环形分布、点状荧 光分布、帽状荧光形成(又称帽化)，为保证 细胞免疫荧光定量分析精确和稳定，在冷环 境下操作染色或加入叠氮钠可以预防这些现 象的出现。本讲稿第三十四页，共三十六页对于需要保存不能马上进行定量分析的标本，在免疫荧光染色后，不固定可以在4放置48小时不出现荧光强度或标记阳性率降低。时间更长时需要进行固定保存，但固定方法要求方法步骤简单，固定液单一，不明显影响细胞膜表面抗原的免疫荧光标记，细胞体积和荧光强度等，可保存较长时间。较理想的固定剂为1-4%的多聚甲醒缓冲液或4%的甲醒缓冲液(pH7.2)，实验证明，固定1-2个月，仍可得到较好定量分析结果，对细胞膜内的抗原物质的免疫荧光检测，可用70%和冷乙醇(-20)固定可获得满意的检测结果。本讲稿第三十五页，共三十六页n免疫荧光染色多采用直标法和间标法免疫荧光染色多采用直标法和间标法，直标法不易引入样品的非特异性荧光，干扰少，数据处理容易，而间标法由于其具有免疫标记放大作用，同时对非特异荧光有放大，而引起的非特异性荧光信号强。本讲稿第三十六页，共三十六页