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1、关于基因功能研究常用方法第1页，讲稿共66张，创作于星期日弄清基因的生物学功能,才能明确基因在疾病发生中的具体作用、弄清疾病发生的分子机制。常用的基因功能研究技术包括：（1）DNA克隆技术克隆技术（2）转基因技术和核转移技术（动物克隆）转基因技术和核转移技术（动物克隆）（3）基因敲除技术）基因敲除技术（4）反义技术）反义技术（5）RNA干涉技术干涉技术第2页，讲稿共66张，创作于星期日 第一节第一节 DNA克隆技术克隆技术第3页，讲稿共66张，创作于星期日 克隆克隆(clone)来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。获取同一拷贝的过程称为获取同一拷贝的过程称为
2、克隆化克隆化(cloning)，即即无无性繁殖性繁殖。（一）（一）DNA克隆克隆第4页，讲稿共66张，创作于星期日技术水平：技术水平：分子克隆分子克隆 即即DNA 克隆克隆 细胞克隆细胞克隆个体克隆（动物或植物）个体克隆（动物或植物）第5页，讲稿共66张，创作于星期日DNA克隆克隆应应用用酶酶学学的的方方法法，在在体体外外将将各各种种来来源源的的遗遗传传物物质质（同同源源的的或或异异源源的的、原原核核的的或或真真核核的的、天天然然的的或或人人工工的的DNA）与与载载体体DNA接接合合成成一一具具有有自自我我复复制制能能力力的的DNA分分子子复复制制子子，继继而而通通过过转转化化或或转转染染宿宿
3、主主细细胞胞，筛筛选选出出含含有有目目的的基基因因的的转转化化子子细细胞胞，再再进进行行扩扩增增提提取取获获得大量同一得大量同一DNA分子。分子。也称也称基因克隆或重组基因克隆或重组DNA。第6页，讲稿共66张，创作于星期日生物技术工程生物技术工程:基因工程、蛋白质工程、酶基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等工程、细胞工程等目的目的 分离获得某一感兴趣的基因或分离获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）基因工程基因工程(genetic engineering)实现基因克实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称隆所用的方法及
4、相关的工作称基因工程，又称重组重组DNA工艺学工艺学。第7页，讲稿共66张，创作于星期日（二）工具酶（二）工具酶 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 DNA聚合酶聚合酶 逆转录酶逆转录酶 T4DNA连接酶连接酶 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 末端转移酶末端转移酶 Taq DNA聚合酶聚合酶第8页，讲稿共66张，创作于星期日重组重组DNA技术中常用的工具酶技术中常用的工具酶第9页，讲稿共66张，创作于星期日（三）目的基因（三）目的基因 cDNA基因组基因组DNA目的基因目的基因 分离获得某一感兴趣的基因或分离获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）
5、第10页，讲稿共66张，创作于星期日（四）基因载体（四）基因载体定义定义为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。分子。常用载体常用载体质粒质粒DNA噬菌体噬菌体DNA病毒病毒DNA第11页，讲稿共66张，创作于星期日克隆载体克隆载体(cloning vector)为为使使插插入入的的外外源源DNA序序列列被被扩扩增增而而特特意意设设计的载体称为克隆载体。计的载体称为克隆载体。表达载体表达载体(expression vector)为为使使插插入入的的外外源源DNA序序列列可可转转录录翻翻译译成成多多肽
6、肽链链而特意设计的载体称为表达载体。而特意设计的载体称为表达载体。第12页，讲稿共66张，创作于星期日载体的选择标准载体的选择标准能自主复制；能自主复制；具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；选和鉴定；有克隆位点（外源有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；单一酶切位点，称为多克隆位点；分子量小，以容纳较大的外源分子量小，以容纳较大的外源DNA。第13页，讲稿共66张，创作于星期日1.1.质粒质粒(plasmid)特点特点 能能在在宿宿主主细细胞胞内内独独立立自自主主复复制制；带带有有某某些
7、些遗遗传信息传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状。会赋予宿主细胞一些遗传性状。第14页，讲稿共66张，创作于星期日噬菌体噬菌体DNA改造系统改造系统 gt系列（插入型，适用系列（插入型，适用cDNA克隆）克隆）EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）系列（置换型，适用基因组克隆）2.噬菌体噬菌体(phage)M13噬菌体噬菌体DNA改造系统（含改造系统（含lacZ基因）基因）M13mp系列系列pUC系列系列第15页，讲稿共66张，创作于星期日酵母人工染色体酵母人工染色体(yeast artificial chromosome,YAC)细菌人工染色体细菌人工染色体(bacterial artific
8、ial chromosome,BAC)动物病毒动物病毒DNA改造的载体改造的载体（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）其他其他第17页，讲稿共66张，创作于星期日二、重组二、重组DNA技术基本原理技术基本原理克隆基本过程克隆基本过程目的基因的获取目的基因的获取DNA导入受体菌导入受体菌外源基因与载体的连接外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建克隆载体的选择和构建重组体的筛选重组体的筛选克隆基因的表达克隆基因的表达 第18页，讲稿共66张，创作于星期日 以以 质质 粒粒 为为 载载 体体 的的DNA 克克 隆隆 过过 程程目目 录录第19页，讲稿共66
9、张，创作于星期日（一）目的基因的获取（一）目的基因的获取1.化学合成法化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列氨基酸序列。2.基因组基因组DNA文库文库(genomic DNA library)3.cDNA文库文库(cDNA library)4.聚合酶链反应聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)（见第（见第22章）章）第20页，讲稿共66张，创作于星期日（二）克隆载体的选择和构建（二）克隆载体的选择和构建若将外源基因连接到复制子(基因载体)上,外源DNA就可以作为复制子的一部分在受体细胞内复制.在基
10、因克隆中基因载体的选择与构建是一项技术性很强的工作,直接影响到基因克隆的成败.第21页，讲稿共66张，创作于星期日（三）外源基因与载体的连接（三）外源基因与载体的连接1.1.粘性末端连接粘性末端连接方式：方式：(1)同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接(2)不同限制酶切位点连接不同限制酶切位点连接配伍末端连接配伍末端连接非配伍末端连接非配伍末端连接第22页，讲稿共66张，创作于星期日受体菌条件受体菌条件安全宿主菌安全宿主菌（从大肠杆菌（从大肠杆菌K-12改造）改造）限制酶和重组酶缺陷限制酶和重组酶缺陷处于感受态处于感受态导入方式导入方式转化转化 转染转染 感染感染（四）重组（四）重组DNA
11、导入受体菌导入受体菌第23页，讲稿共66张，创作于星期日（五）重组体的筛选（五）重组体的筛选 1.直接选择法直接选择法(1)抗药性标记选择抗药性标记选择(2)标志补救标志补救(marker rescue)(3)分子杂交法分子杂交法原位杂交原位杂交Southern印迹印迹 2.免疫学方法免疫学方法如免疫化学方法及酶免检测分析等如免疫化学方法及酶免检测分析等第24页，讲稿共66张，创作于星期日重组重组DNA技术操作的主要步骤技术操作的主要步骤载体载体质粒质粒噬菌体噬菌体病毒病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）基因组基因组DNA cDNA 人工合成人工合成PCR产物产物限制酶消化限制酶消化开
12、环载体开环载体DNA目的基因目的基因连接酶连接酶重组体重组体转化转化体外包装，转染体外包装，转染带重组体的宿主带重组体的宿主筛选筛选表型筛选表型筛选酶切电泳鉴定酶切电泳鉴定菌落原位杂交菌落原位杂交目目 录录第25页，讲稿共66张，创作于星期日第二节第二节 转基因技术与核转移技术转基因技术与核转移技术第26页，讲稿共66张，创作于星期日转基因技术转基因技术采采用用基基因因转转移移技技术术使使目目的的基基因因整整合合入入受受精精卵卵细细胞胞或或胚胚胎胎干干细细胞胞，然然后后将将细细胞胞导导入入动动物物子子宫宫，使使之之发发育育成个体。成个体。转基因转基因被导入的目的基因被导入的目的基因转基因动物转
13、基因动物(transgenic animal)目的基因的受体动物目的基因的受体动物一、转基因技术一、转基因技术第27页，讲稿共66张，创作于星期日第28页，讲稿共66张，创作于星期日转基因生物是指用实验方法导入的外源基因在染色体基因组内稳定整和并能遗传给后代的一类动物。自从1982年Palmiter等首次将大鼠生长激素基因导人小鼠受精卵雄性原核中，获得了个体比对照组大一倍的转基因“超级小鼠”以来，这项高新技术受到各国重视，发展迅速，取得不少突破，全世界已申请的工程动物专利达到80多项。第29页，讲稿共66张，创作于星期日转基因动物是动物整体水平研究目的基因的转基因动物是动物整体水平研究目的基因
14、的生物技术，特点是生物技术，特点是“分子及其细胞水平的操分子及其细胞水平的操作，组织及动物整体水平表达作，组织及动物整体水平表达”第30页，讲稿共66张，创作于星期日转基因动物构建过程转基因动物构建过程转基因载体的构建将转基因载体导入受精卵细胞或者胚胎干细胞将转基因受精卵或胚胎干细胞植入假孕小鼠子宫中对转基因动物进行鉴定第31页，讲稿共66张，创作于星期日转基因的技术方法转基因的技术方法DNA显微注射法克隆法胚胎干细胞技术逆转录病毒介导的基因转移精子载体法等各有优点和缺点，常用的是显微注射和克隆法第32页，讲稿共66张，创作于星期日转基因动物的鉴定转基因动物的鉴定Southern杂交确定外源基
15、因的整合以及整合的拷贝数RT-PCR确定外源基因的转录和转录水平Western杂交确定外源基因蛋白质的表达情况实时PCR（荧光定量PCR）第33页，讲稿共66张，创作于星期日转基因技术的应用转基因技术的应用（1）建立致病基因表达、调控的动物模型（2）动植物新品种的培育（3）各种基因工程产品的制备（4）探讨生殖细胞的基因治疗方法第34页，讲稿共66张，创作于星期日囊性纤维变性是一种遗传囊性纤维变性是一种遗传病，患者体内会产生粘稠的粘病，患者体内会产生粘稠的粘液，阻塞肺部、胰腺和消化器液，阻塞肺部、胰腺和消化器官的内部通道，大约有一半的官的内部通道，大约有一半的患者活不过患者活不过3131岁。英国
16、岁。英国PPTPPT公司公司培育了植入人体基因的克隆羊，培育了植入人体基因的克隆羊，羊奶中含有能够治疗囊性纤维变羊奶中含有能够治疗囊性纤维变性的人体蛋白。性的人体蛋白。维尔莫特所在的研究所曾向维尔莫特所在的研究所曾向德国一家药厂出售一头这样的德国一家药厂出售一头这样的转基因羊转基因羊转基因羊转基因羊，获得，获得5050万英镑。万英镑。第35页，讲稿共66张，创作于星期日核转移技术核转移技术 即即动动物物整整体体克克隆隆技技术术，将将动动物物体体细细胞胞核核全全部部导导入入另另一一个个体体的的去去胞胞核核的的受受精精卵卵内内，使使之之发发育成个体，即克隆育成个体，即克隆(clone)。这这样样的
17、的个个体体所所携携带带的的性性状状仅仅来来自自一一个个父父亲亲或或母亲个体母亲个体,为无性繁殖为无性繁殖.19961996年年,克克隆隆羊羊”多多莉莉”的的产产生生成成为为当当年年分子生物学发展最重要的事件分子生物学发展最重要的事件二、核转移技术二、核转移技术第36页，讲稿共66张，创作于星期日克隆羊克隆羊“多利多利多利多利”第37页，讲稿共66张，创作于星期日第38页，讲稿共66张，创作于星期日基因剔除技术基因剔除技术也称也称基因靶向基因靶向(gene targeting)灭活，有目灭活，有目的去除动物体内某种基因的技术。的去除动物体内某种基因的技术。第三节、基因剔除技术第三节、基因剔除技术
18、第39页，讲稿共66张，创作于星期日基因剔除程序基因剔除程序将灭活的基因放入胚胎干细胞(ES细胞),使这一灭活的基因通过同源重组取代原有目的基因,筛选到基因定点灭活的细胞后,通过显微注射到小鼠囊胚.细胞在小鼠囊胚参与胚胎的发育,最终形成嵌合体小鼠,由于一部分生殖细胞来源于ES细胞,通过小鼠培养可获得纯合子基因剔除小鼠.第40页，讲稿共66张，创作于星期日 基因转移和基因剔除技术在基因转移和基因剔除技术在医学中的应用医学中的应用建立动物疾病可遗传的模型建立动物疾病可遗传的模型,探讨疾病发生机制探讨疾病发生机制 单基因决定疾病模型单基因决定疾病模型 进行基因剔除以模拟基因失活进行基因剔除以模拟基因
19、失活.单基因疾病模型单基因疾病模型:地中海贫血地中海贫血,动脉硬化动脉硬化,老年痴呆等老年痴呆等 多基因决定疾病模型多基因决定疾病模型 多基因疾病模型多基因疾病模型:肿瘤肿瘤,高血压高血压,糖尿病糖尿病第41页，讲稿共66张，创作于星期日第四节第四节 基因沉默技术基因沉默技术第42页，讲稿共66张，创作于星期日基因沉默技术基因沉默技术反义(antisen)技术RNA干涉(RNAInterference,RNAi)第43页，讲稿共66张，创作于星期日反义技术反义技术反义RNA是根据RNA序列合成的互补RNA,可分为三类:作用于核蛋白体结合位点或与靶mRNA形成双链;作用于非编码区;作用于启动子反
20、义DNA在DNA或RNA水平上以至转录与翻译,其稳定性好,有广泛药用价值核酶是具有酶活性的RNA,参与RNA加工与成熟,人工合成的核酶能抑制特定基因的表达第44页，讲稿共66张，创作于星期日RNA干涉干涉(RNAi)RNA干涉技术是利用体外合成的短双链RNA(21-23nt)抑制细胞内特定基因表达的技术,是转录后基因失活的一种研究基因功能的有力工具机制:第45页，讲稿共66张，创作于星期日RNAiRNAi技术技术技术技术DicerRNAiRNAi技术技术第46页，讲稿共66张，创作于星期日siRNA55335533第47页，讲稿共66张，创作于星期日Initiation StepATPATPA
21、DP+ppiADP+ppiDICERKINASERdRP第48页，讲稿共66张，创作于星期日Effector StepsiRNA bindingsiRNA unwindingRISC activation第49页，讲稿共66张，创作于星期日RNAiRNAi技术技术第50页，讲稿共66张，创作于星期日医学分子生物学课程作业根据自身专业和研究方向，以RNAi技术在XXX领域的研究进展为题目，写一篇小综述。写作要求：1.按照一般发表文献的格式书写。2.可查阅CNKI（中国知网）或Pubmed上相关文献，不得抄袭！3.字数：3000字左右。4.不得抄袭！不得抄袭！第51页，讲稿共66张，创作于星期日论
22、文格式题目摘要（Abstract)200字以内正文前言正文问题与展望参考文献10-15篇第52页，讲稿共66张，创作于星期日完成方式：手写稿或电子打印稿完成日期：2012年12月15日前交到医学实验楼B-312或者下周上课课堂上交。第53页，讲稿共66张，创作于星期日疾病相关基因的克隆与鉴定疾病相关基因的克隆与鉴定Cloning and Identification of Disease Relative Genes第第 五五 节节第54页，讲稿共66张，创作于星期日克隆疾病相关基因的策略克隆疾病相关基因的策略（一）功能性克隆（一）功能性克隆(functional cloning)（二）定位克
23、隆（二）定位克隆(positional cloning)（三）非定位候选基因克隆策略（三）非定位候选基因克隆策略(position-independent candidate gene approaches)（四）定位候选基因克隆策略（四）定位候选基因克隆策略(positional candidate gene approaches)第55页，讲稿共66张，创作于星期日定义定义 从对一种致病基因的功能的了解从对一种致病基因的功能的了解出发，克隆该致病基因。出发，克隆该致病基因。（一）功能性克隆（一）功能性克隆应用应用 生化机制已明确、基因表达产物生化机制已明确、基因表达产物较易得到部分纯化的遗
24、传性疾病。较易得到部分纯化的遗传性疾病。第56页，讲稿共66张，创作于星期日克隆方式克隆方式 利用特异性抗体筛选表达型利用特异性抗体筛选表达型cDNA文库；文库；根据已知的部分氨基酸序列合成寡核苷酸作探针，根据已知的部分氨基酸序列合成寡核苷酸作探针，筛选筛选cDNA文库。文库。第57页，讲稿共66张，创作于星期日（二）定位克隆（二）定位克隆定义定义从一种致病基因的染色体定位出发逐步缩小范围，从一种致病基因的染色体定位出发逐步缩小范围，最后克隆该基因。最后克隆该基因。系统的定位克隆工作系统的定位克隆工作 遗传学分析遗传学分析(确定致病基因染色体定位确定致病基因染色体定位)交换分析、连锁不平衡分析
25、交换分析、连锁不平衡分析 分子生物学分析分子生物学分析染色体异常染色体异常(缺失、易位等缺失、易位等)分析、基因文分析、基因文库的筛选与基因克隆库的筛选与基因克隆第58页，讲稿共66张，创作于星期日基因定位的基本方法1.体细胞杂交法p2832.原位杂交和荧光原位杂交3.连锁分析第59页，讲稿共66张，创作于星期日体细胞杂交:细胞杂交又称细胞融合,是将来源不同的两种细胞融合成一个新细胞(杂种细胞).大多数细胞杂交是用人的细胞与小鼠的体细胞杂交,它的特点是在其繁殖传代过程中保留小鼠染色体而人染色体逐渐丢失仅保留少数甚至一条人染色体的细胞正是进行基因连锁分析和基因定位的有用材料只需要集中精力于某一染
26、色体上,就可找到某一基因座位第60页，讲稿共66张，创作于星期日原位杂交和荧光原位杂交(FISH):根据疾病基因所编码蛋白质的信息,将其mRNA反转录成cDNA,再以cDNA为探针从基因组DNA中钓取该蛋白质量的编码基因如:用及珠蛋白基因的cDNA作探针,与各种不同的人/鼠杂种细胞进行原位杂交,找出cDNA探针与人染色体DNA的同源互补关系,从而将及珠蛋白基因分别定位于第16号和第11号染色体上.第61页，讲稿共66张，创作于星期日连锁分析原理:基因在染色体上成直线排列,不同基因相互连锁成连锁群,即应用被定位的基因与同一染色体上另一基因或者遗传标记相连锁的特点进行定位利用某个待定位的基因是否与
27、某个遗传存在连锁关系,以及连锁的紧密程度就能将该基因定位到染色体的一定部位.第62页，讲稿共66张，创作于星期日定位克隆程序举例杜氏肌营养不良(DMD)致病基因的克隆是一个定位克隆的过程,分为两阶段进行:首先,通过遗传学的家族分析确定了致病基因是位于Xp21,从而完成了该基因的染色体定位.接着,研究人员利用一个Xp21区带缺失的病例采用扣除杂交实验进行了基因克隆原理:将病人的DNA与正常人的DNA进行杂交,从而减掉了相同的基因序列,最后剩余的序列即为病人缺失的基因DMD,该基因的产物被命名为肌营养不良蛋白第63页，讲稿共66张，创作于星期日（三）表型克隆（三）表型克隆定义:建立在表型的基础上,
28、对特定致病基因DNA片断的直接克隆.从疾病的表型出发,直接对产生变异的DNA片断进行克隆,而不依赖基因的染色体位置或基因产物的信息.如:代表性差异分析(RDA技术)p285第64页，讲稿共66张，创作于星期日人类基因组计划与疾病相关基因克隆人类基因组计划与疾病相关基因克隆当致病基因的染色体定位确认后，人们可以当致病基因的染色体定位确认后，人们可以利用因特网上的基因网站利用因特网上的基因网站(NCBI)(NCBI)所提供基因序列数所提供基因序列数据，鉴定出候选致病基因。据，鉴定出候选致病基因。利用基因组数据库利用基因组数据库,通过同源序列比较与分析通过同源序列比较与分析(BLAST),(BLAST),在计算机上就可以进行疾病相关基因或新基在计算机上就可以进行疾病相关基因或新基因的拼接克隆因的拼接克隆,甚至不需要传统意义的实验操作甚至不需要传统意义的实验操作第65页，讲稿共66张，创作于星期日感感谢谢大大家家观观看看第66页，讲稿共66张，创作于星期日