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1、细胞工程细胞工程关于植物细胞培养与次级代谢产物制备第1页，讲稿共63张，创作于星期二细胞工程细胞工程第五章第五章 植物植物细胞培养细胞培养l根据培养规模根据培养规模:小规模培养和大批量培养；小规模培养和大批量培养；l根据培养方式根据培养方式:悬浮培养、单细胞培养等；悬浮培养、单细胞培养等；l根据要求产物根据要求产物:用于诱变的细胞培养和生产次生产物的细胞用于诱变的细胞培养和生产次生产物的细胞培养。培养。植物细胞培养（植物细胞培养（plant cell culture）是指在离体条件下对植是指在离体条件下对植物物单个细胞或小的细胞团单个细胞或小的细胞团进行进行培养使其增殖获得细胞或细胞培养使其增
2、殖获得细胞或细胞产物的技术。产物的技术。第2页，讲稿共63张，创作于星期二细胞工程细胞工程第一节 植物细胞培养的特点植物细胞直径一般约为10-200m，平均直径比微生物细胞大30-100倍。植物细胞通常以一定细胞数目的非均相细胞团方式存在于培养液中。植物细胞具有纤维素细胞壁和大的液泡，很容易被剪切力损伤。与微生物细胞相比，植物细胞生长速度慢，操作周期长，分批培养一般需要2-3周。第3页，讲稿共63张，创作于星期二细胞工程细胞工程植物细胞培养基成分丰富而复杂，适合微生物生长，因此防止污染更困难。植物细胞培养一般需要光照，通过光合作用合成有机物，因此氧气和CO2的含量与传递对细胞培养影响较大。第4
3、页，讲稿共63张，创作于星期二细胞工程细胞工程与微生物细胞相比，植物细胞有什么特点？细菌，真菌、植物细胞都有细胞壁胞。细菌无成形的细胞核，真菌、植物细胞有成形的细胞核。细菌只有核糖体一种细胞器。植物细胞比微生物细胞大。生命活动与细胞分裂第5页，讲稿共63张，创作于星期二细胞工程细胞工程第二节第二节 植物细胞培养技术植物细胞培养技术1、植物细胞培养基 无机盐（大量、微量）碳源（蔗糖）有机氮源（水解酪蛋白）有机酸、维生素 植物生长激素等第6页，讲稿共63张，创作于星期二细胞工程细胞工程（1）单细胞分离）单细胞分离1 1、酶解法、酶解法 选择专一性水解酶在温和的条件下将植物细胞壁物质（纤维素 果胶
4、多糖）降解植物细胞壁物质，从而使细胞彼此分开，这种方法称为酶解法。经常采用的生物酶包括：纤维素酶、果胶酶、琼脂酶等生物酶。/机械法机械法外植体捣碎，然后过滤和离心。外植体捣碎，然后过滤和离心。2、由植物培养组织（愈伤组织）中分离单细胞植物单细胞分离与小规模培养植物单细胞分离与小规模培养第7页，讲稿共63张，创作于星期二细胞工程细胞工程 酶解法酶解法Takebe等（等（1968）最早报道：用果胶酶处理可以分离大量的）最早报道：用果胶酶处理可以分离大量的叶肉细胞叶肉细胞加果胶酶加果胶酶过滤、离心过滤、离心第8页，讲稿共63张，创作于星期二细胞工程细胞工程由愈伤组织诱导分离单细胞由愈伤组织诱导分离单
5、细胞茎段茎段步骤：步骤：诱导产生愈伤组织；诱导产生愈伤组织；愈伤组织反复继代，使组织不断愈伤组织反复继代，使组织不断增殖，提高愈伤组织的松散性；增殖，提高愈伤组织的松散性；第9页，讲稿共63张，创作于星期二细胞工程细胞工程摇床用于振荡摇床用于振荡继代继代悬浮悬浮（Suspension culture)将愈伤组织在液体培养将愈伤组织在液体培养基中培养，建立悬浮培基中培养，建立悬浮培养物养物120rpm culturetransfer 1time/3d 3 weeks100-130目网过滤目网过滤Centrifuge(离心）离心）isolation第10页，讲稿共63张，创作于星期二细胞工程细胞工
6、程（2）植物单细胞小规模培养植物单细胞小规模培养l看护培养看护培养l饲养层培养技术饲养层培养技术l细胞平板培养细胞平板培养l微室培养微室培养第11页，讲稿共63张，创作于星期二细胞工程细胞工程看护培养看护培养概念：用一块愈伤组织或植物离体组织看护单细胞使其生长增殖的一种单细胞培养方法。第12页，讲稿共63张，创作于星期二细胞工程细胞工程第13页，讲稿共63张，创作于星期二细胞工程细胞工程饲养层培养饲养层培养将饲养细胞先用射线辐射处理，使其失去活性，然后将饲养细胞和培养细胞混合植板，经过照射的细胞对于培养细胞能够起到一个饲养作用。第14页，讲稿共63张，创作于星期二细胞工程细胞工程双层滤纸植板培
7、养方法双层滤纸植板培养方法培养基培养基饲养层细胞饲养层细胞看护滤纸层转移碟滤纸转移碟滤纸培养细胞培养细胞第15页，讲稿共63张，创作于星期二细胞工程细胞工程第16页，讲稿共63张，创作于星期二细胞工程细胞工程概念：将制备好的概念：将制备好的单细胞悬浮液单细胞悬浮液，按照一定的细胞密度，按照一定的细胞密度，接种在接种在1mm1mm左右的左右的薄层固体培养基薄层固体培养基上进行培养，称之为平板上进行培养，称之为平板培养。培养。细胞平板培养法细胞平板培养法第17页，讲稿共63张，创作于星期二细胞工程细胞工程微室培养微室培养概念：人工制造一个小室，将单细胞培养在小室中的少量培养基上，使概念：人工制造一
8、个小室，将单细胞培养在小室中的少量培养基上，使其分裂增殖形成细胞团的方法，称微室培养。其分裂增殖形成细胞团的方法，称微室培养。第18页，讲稿共63张，创作于星期二细胞工程细胞工程第19页，讲稿共63张，创作于星期二细胞工程细胞工程微室培养特点：微室培养特点：能在显微镜下追踪单细胞分裂增殖形成细胞团的全过程。能在显微镜下追踪单细胞分裂增殖形成细胞团的全过程。培养基少，营养和水分难以保持，培养基少，营养和水分难以保持，pHpH值变动幅度大，培值变动幅度大，培养细胞仅能短期分裂。养细胞仅能短期分裂。第20页，讲稿共63张，创作于星期二细胞工程细胞工程 细胞同步化是指同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通
9、过细胞同步化是指同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。细胞周期的某一特定时期。同一培养体系中，细胞不同步使悬浮细胞的分裂、代谢以同一培养体系中，细胞不同步使悬浮细胞的分裂、代谢以及生理、生化状态等更趋复杂化，所以人们一直希望通过一定及生理、生化状态等更趋复杂化，所以人们一直希望通过一定的技术途径，使同一培养体系中的细胞能保持相对一致的细胞的技术途径，使同一培养体系中的细胞能保持相对一致的细胞学和生理学状态。学和生理学状态。细胞的同步化培养细胞的同步化培养第21页，讲稿共63张，创作于星期二细胞工程细胞工程体积选择法：体积选择法：用大、小孔径筛网过滤、收集单细胞。用大、小孔
10、径筛网过滤、收集单细胞。冷冷/低温处理法：低温处理法：4低温下处理几天使细胞同步化后，低温下处理几天使细胞同步化后，再添加新的培养液培养。再添加新的培养液培养。饥饿法：饥饿法：控制营养液浓度，通过饥饿使细胞达到同步化，控制营养液浓度，通过饥饿使细胞达到同步化，再添加营养液培养。再添加营养液培养。抑制法：抑制法：使用抑制剂如尿苷、使用抑制剂如尿苷、5-5-氟脱氧尿苷、秋水仙氟脱氧尿苷、秋水仙素等使细胞达到同步化。素等使细胞达到同步化。第22页，讲稿共63张，创作于星期二细胞工程细胞工程l无论何种细胞同步化处理，对细胞本身或多或少都有一定无论何种细胞同步化处理，对细胞本身或多或少都有一定的伤害。的
11、伤害。l如果处理的细胞没有足够的生活力，不仅不能获得理想的如果处理的细胞没有足够的生活力，不仅不能获得理想的同步化效果，还可能造成细胞的大量死亡，因此在进行同同步化效果，还可能造成细胞的大量死亡，因此在进行同步化处理之前，细胞必须进行充分的活化培养。步化处理之前，细胞必须进行充分的活化培养。l用于处理的细胞系最好处于用于处理的细胞系最好处于对数生长期对数生长期。第23页，讲稿共63张，创作于星期二细胞工程细胞工程细胞系和细胞株细胞系和细胞株细胞系和细胞株概念细胞系和细胞株概念原原代代培培养养物物经经首首次次传传代代成成功功即即称称为为细细胞胞系系（Cell Cell LineLine），因因此
12、此细细胞胞系系可可泛泛指指一一般般可可以以传传代代的的细细胞胞。是是以以一一种种细细胞为主的、能在体外长期生存的不均一的细胞群体。胞为主的、能在体外长期生存的不均一的细胞群体。第24页，讲稿共63张，创作于星期二细胞工程细胞工程通通过过选选择择法法或或克克隆隆形形成成法法从从原原代代培培养养物物或或细细胞胞系系中中获获得得具具有有特特殊殊性性质质或或标标志志物物的的培培养养细细胞胞称称为为细细胞胞株株（Cell Cell StrainStrain），也也就就是是说说，细细胞胞株株是是用用细细胞胞系系单单细细胞胞分分离离培培养养或或通通过过筛筛选选的的方方法法，由由单单细细胞胞增增殖殖形形成成的
13、的细细胞胞群群。细细胞胞株株的的特特殊性质或标志必须在整个培养期间始终存在。殊性质或标志必须在整个培养期间始终存在。第25页，讲稿共63张，创作于星期二细胞工程细胞工程细胞株筛选1、适合于工业化生产的细胞株必须满足以下条件：（1）分散性好，适合大规模悬浮培养。（2）均一性好，细胞大小、生理状态一致。（3）生长速度快 培养周期短 不易染菌。（4）目标产物含量高，容易分离提取。（5）细胞遗传稳定。2、适合工业生产用细胞株的一般筛选流程：（自学）3、细胞株定向富集驯化4、人工诱变筛选第26页，讲稿共63张，创作于星期二细胞工程细胞工程 5 5、细胞株保存、细胞株保存继代培养保存法 悬浮培养的细胞通过
14、每隔12周换液进行一次继代培养。这种方法适合于短期保种。低温保存法 一般选择5-10的温度下培养，每隔十天左右更换一次培养液。冷冻保存 包括低温保存（-20）、超低温保存（液氮-196）。第27页，讲稿共63张，创作于星期二细胞工程细胞工程植物细胞大规模悬浮培养植物细胞大规模悬浮培养(cell suspension culture)(1)(1)细胞悬浮培养的概念和意义细胞悬浮培养的概念和意义悬浮培养是将单个游离细胞或小细胞团悬浮在液体培悬浮培养是将单个游离细胞或小细胞团悬浮在液体培养基中进行培养增殖的技术。养基中进行培养增殖的技术。第28页，讲稿共63张，创作于星期二细胞工程细胞工程意义意义/
15、优点优点u细胞可以不断增殖，形成高密度的细胞群体，适于大规细胞可以不断增殖，形成高密度的细胞群体，适于大规模培养；模培养；u能够提供大量较为均匀的细胞，为研究细胞的生长、分化能够提供大量较为均匀的细胞，为研究细胞的生长、分化创造方法和条件。创造方法和条件。第29页，讲稿共63张，创作于星期二细胞工程细胞工程Cell suspensionPlantsArtificial seedsSecondary productsIsolation protoplastsMutation select细胞悬浮培养的应用细胞悬浮培养的应用第30页，讲稿共63张，创作于星期二细胞工程细胞工程细胞悬浮培养起始培养物
16、的建立细胞悬浮培养起始培养物的建立l选择适宜的外植体：选择适宜的外植体：幼胚、胚轴、子叶幼胚、胚轴、子叶是最常使用的外植体。是最常使用的外植体。l 选择适宜的培养基：选择适宜的培养基：较高浓度较高浓度激素；必要的附加物质。激素；必要的附加物质。l 愈伤组织的要求：愈伤组织的要求：松散性好、增殖快、再生能力强。松散性好、增殖快、再生能力强。第31页，讲稿共63张，创作于星期二细胞工程细胞工程建立细胞悬浮系建立细胞悬浮系第32页，讲稿共63张，创作于星期二细胞工程细胞工程悬浮细胞的生长与增殖悬浮细胞的生长与增殖悬浮培养与固体培养比较有三个优点：悬浮培养与固体培养比较有三个优点：一是增加培养细胞与培
17、养液的一是增加培养细胞与培养液的接触面接触面，改善营养供应；，改善营养供应；二是在振荡条件下可避免细胞代谢产生的二是在振荡条件下可避免细胞代谢产生的有害物质有害物质在局部积累而在局部积累而对细胞自身产生对细胞自身产生毒害毒害；三是振荡培养可以适当三是振荡培养可以适当改善气体的交换改善气体的交换。第33页，讲稿共63张，创作于星期二细胞工程细胞工程悬浮培养细胞数目的增殖变化悬浮培养细胞数目的增殖变化第34页，讲稿共63张，创作于星期二细胞工程细胞工程细胞生长各个时期的特点：细胞生长各个时期的特点：滞后期（延迟期）滞后期（延迟期）:细胞很少分裂，其长短与接种量、大小和继代时细胞很少分裂，其长短与接
18、种量、大小和继代时原种细胞所处的生长期有关；原种细胞所处的生长期有关；对数生长期对数生长期:细胞分裂活跃，细胞数目增加，增长速率保持不变细胞分裂活跃，细胞数目增加，增长速率保持不变直线生长期直线生长期:细胞生长和发育最明显的时期细胞生长和发育最明显的时期缓慢期缓慢期:生长逐渐缓慢生长逐渐缓慢,培养液消耗将尽，有毒代谢物质增多，氧气减少；培养液消耗将尽，有毒代谢物质增多，氧气减少；静止静止/平台期平台期:生长几乎处于停止状态，细胞数目增加极少，甚至开生长几乎处于停止状态，细胞数目增加极少，甚至开始死亡。始死亡。衰亡期衰亡期：细胞死亡速度加快，细胞开始快速自溶，死亡。：细胞死亡速度加快，细胞开始快
19、速自溶，死亡。第35页，讲稿共63张，创作于星期二细胞工程细胞工程成功的悬浮细胞培养体系必须满足三个条件：成功的悬浮细胞培养体系必须满足三个条件：悬浮培养物分散性良好，细胞团较小，一般在悬浮培养物分散性良好，细胞团较小，一般在30305050个细胞，在实际培个细胞，在实际培养中很少有完全由单细胞组成的植物细胞悬浮系。养中很少有完全由单细胞组成的植物细胞悬浮系。均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同。悬浮系外观为大小均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同。悬浮系外观为大小均一的小颗粒，培养基清澈透亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡黄均一的小颗粒，培养基清澈透亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色。色。细胞生
20、长迅速，悬浮细胞的生长量一般细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般2 23 3天甚至更短时间便可增加天甚至更短时间便可增加一倍。一倍。第36页，讲稿共63张，创作于星期二细胞工程细胞工程影响悬浮细胞生长的因素：影响悬浮细胞生长的因素：起始愈伤组织的质量：松散性好、增殖快、再生能力强。其外观一起始愈伤组织的质量：松散性好、增殖快、再生能力强。其外观一般是色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒状，疏松易碎。般是色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒状，疏松易碎。接种细胞密度：接种初期的细胞密度过低往往使延迟期加长，悬浮细胞接种细胞密度：接种初期的细胞密度过低往往使延迟期加长，悬浮细胞的起始密度一般在的起始
21、密度一般在0.50.52.5102.5105 5个细胞个细胞/毫升，低于这一密度则会毫升，低于这一密度则会使细胞生长延迟。使细胞生长延迟。培养条件：方式、温度、继代周期培养条件：方式、温度、继代周期第37页，讲稿共63张，创作于星期二细胞工程细胞工程植物细胞悬浮培养的生物反应器植物细胞悬浮培养的生物反应器自学自学生物反应器是指用于高等生物细胞批量化培养的装置生物反应器是指用于高等生物细胞批量化培养的装置及其相应控制系统。及其相应控制系统。机械搅拌式培养系统机械搅拌式培养系统气气升升式反应器式反应器 鼓泡式反应器鼓泡式反应器第38页，讲稿共63张，创作于星期二细胞工程细胞工程植物细胞大规模培养，
22、根据一个培养周期中是否添加培养基，植物细胞大规模培养，根据一个培养周期中是否添加培养基，可分为可分为成批培养、连续培养、半连续培养方式等。成批培养、连续培养、半连续培养方式等。成批培养（成批培养（batch culturebatch culture）:指在一个培养体积中，接种指在一个培养体积中，接种细胞和添加培养基后，中途不添加培养基也不更换培养细胞和添加培养基后，中途不添加培养基也不更换培养基的方式。基的方式。植物细胞规模化培养方式植物细胞规模化培养方式第39页，讲稿共63张，创作于星期二细胞工程细胞工程连续培养（连续培养（continuous culturecontinuous cultu
23、re）:在培养过程中，不断地向反应器在培养过程中，不断地向反应器中添加培养基，同时以相同的流量从系统中取出培养液，从而维持中添加培养基，同时以相同的流量从系统中取出培养液，从而维持培养系统的内在细胞密度、产物浓度以及物理状态相对平衡的培养培养系统的内在细胞密度、产物浓度以及物理状态相对平衡的培养方式。方式。半连续培养（半连续培养（semi-continuous culturesemi-continuous culture）:这是一种介于成批培养这是一种介于成批培养与连续培养之间的培养方式，其基本方法是在完成上述成批培养的与连续培养之间的培养方式，其基本方法是在完成上述成批培养的一个周期后，只从
24、反应器中取出大部分细胞悬液，保留小部分细胞一个周期后，只从反应器中取出大部分细胞悬液，保留小部分细胞悬液作为下一个培养周期的种子细胞，然后加入新鲜培养基进行培悬液作为下一个培养周期的种子细胞，然后加入新鲜培养基进行培养。养。第40页，讲稿共63张，创作于星期二细胞工程细胞工程 植物细胞固定化需要采用固定剂，是一些多糖和多聚类化合物，植物细胞固定化需要采用固定剂，是一些多糖和多聚类化合物，常用的包括海藻酸盐、琼脂糖、卡拉胶等。常用的包括海藻酸盐、琼脂糖、卡拉胶等。1、海藻酸盐、海藻酸盐固定化固定化在在Ca2+离子等多价阳离子的存在下，离子等多价阳离子的存在下，海藻酸盐的羧基和海藻酸盐的羧基和Ca
25、2+之间以离子键形之间以离子键形成不溶于水的海藻酸钙成不溶于水的海藻酸钙，从而在，从而在细胞细胞表面形成凝胶表面形成凝胶。如果采用如果采用磷酸、柠檬酸、磷酸、柠檬酸、EDTA等等螯合螯合剂处理将剂处理将Ca2+离子除去，又能使胶体离子除去，又能使胶体溶解释放出细胞。溶解释放出细胞。无菌空气入口无菌空气入口玻璃瓶玻璃瓶细胞和褐藻酸钠混合液细胞和褐藻酸钠混合液空气出口空气出口形成胶体颗粒的喷射口形成胶体颗粒的喷射口隔滤板隔滤板装有装有CaCl2溶液溶液的烧瓶的烧瓶 植物细胞固定化方法海藻酸盐固定化细胞步骤海藻酸盐固定化细胞步骤第41页，讲稿共63张，创作于星期二细胞工程细胞工程 常用方法：常用方法
26、：（1 1）滴入法：）滴入法：将细胞悬浮液与灭菌的含将细胞悬浮液与灭菌的含NaClNaCl的卡拉胶溶液混匀，然的卡拉胶溶液混匀，然后滴入含中后滴入含中KClKCl的培养基中，使其分散成小颗粒。过滤、清洗颗粒的培养基中，使其分散成小颗粒。过滤、清洗颗粒后转入适当的培养基中进行培养。后转入适当的培养基中进行培养。（2 2）模铸法：）模铸法：将细胞将细胞-卡拉胶溶液注入柱形铸模中形成颗粒。卡拉胶溶液注入柱形铸模中形成颗粒。（3 3）两相法：）两相法：将细胞将细胞-卡拉胶溶液与无菌豆油或石蜡油搅拌混匀，卡拉胶溶液与无菌豆油或石蜡油搅拌混匀，形成液滴置于冰浴中不断搅拌，凝固成均匀颗粒，再离心除去油相形成
27、液滴置于冰浴中不断搅拌，凝固成均匀颗粒，再离心除去油相和大部分溶液。和大部分溶液。2 2、卡拉胶固定化、卡拉胶固定化第42页，讲稿共63张，创作于星期二细胞工程细胞工程 琼脂糖琼脂糖(Agarose)固定化：固定化：（1 1）凝块法：）凝块法：将细胞悬浮于灭菌的琼脂糖中，搅拌待凝结包将细胞悬浮于灭菌的琼脂糖中，搅拌待凝结包埋细胞后，将凝块挤进无菌金属网中，使其分散成小颗粒。埋细胞后，将凝块挤进无菌金属网中，使其分散成小颗粒。清洗颗粒后转入适当的培养基中进行培养。清洗颗粒后转入适当的培养基中进行培养。（2 2）模铸法：）模铸法：同卡拉胶法同卡拉胶法（3 3）两相法：）两相法：同卡拉胶法同卡拉胶法
28、 优点：与海藻酸盐、优点：与海藻酸盐、卡拉卡拉胶等固定化方法相比，不需要其它胶等固定化方法相比，不需要其它离离 子来保证胶的稳定性。子来保证胶的稳定性。不足：制得的颗粒较大、形状不规则。不足：制得的颗粒较大、形状不规则。3 3、琼脂糖、琼脂糖(Agarose)固定化固定化第43页，讲稿共63张，创作于星期二细胞工程细胞工程 固定化后需要测定细胞存活率大小，方法有：固定化后需要测定细胞存活率大小，方法有：（1 1）荧光染色观察法：）荧光染色观察法：根据活细胞对根据活细胞对FDAFDA（二乙酸荧光素）（二乙酸荧光素）黄黄绿色绿色荧光染料能被吸收，而死细胞无法吸收原理鉴定。荧光染料能被吸收，而死细胞
29、无法吸收原理鉴定。（2 2）呼吸强度测定：）呼吸强度测定：用氧电极法测定固定化细胞的呼吸强度判断存活率。用氧电极法测定固定化细胞的呼吸强度判断存活率。（3 3）细胞生长速率的测定：）细胞生长速率的测定：通过测定细胞的湿重或干重增加率反映细胞活性大小。通过测定细胞的湿重或干重增加率反映细胞活性大小。固定化细胞活力测定固定化细胞活力测定第44页，讲稿共63张，创作于星期二细胞工程细胞工程第三节第三节 植物细胞培养生产次级代谢产物植物细胞培养生产次级代谢产物l概述概述l培养系统培养系统l植物细胞规模培养技术要点植物细胞规模培养技术要点l提高细胞次生代谢产物的途径提高细胞次生代谢产物的途径l细胞规模化
30、培养中的有关技术问题细胞规模化培养中的有关技术问题第45页，讲稿共63张，创作于星期二细胞工程细胞工程概述概述l长期以来，长期以来，植物一直是许多化学品的主要资源植物一直是许多化学品的主要资源，特别在制，特别在制药和食品加工业中更是不可缺少；药和食品加工业中更是不可缺少；l据不完全统计，至少有据不完全统计，至少有20%20%左右的药物是由植物衍生而来，左右的药物是由植物衍生而来，而且每年都有发现许多植物来源的新化合物。而且每年都有发现许多植物来源的新化合物。第46页，讲稿共63张，创作于星期二细胞代谢产物分为初级代谢产物、次级代谢产物。细胞代谢产物分为初级代谢产物、次级代谢产物。初级代谢产物（
31、初级代谢产物（Primary metabolitesPrimary metabolites）是通过初级代谢是通过初级代谢产生的维持细胞生命活动必需的物质，如氨基酸、核苷产生的维持细胞生命活动必需的物质，如氨基酸、核苷酸、多糖、脂类等。酸、多糖、脂类等。次级代谢产物（次级代谢产物（Secondary metabolitesSecondary metabolites）是指植物中一大是指植物中一大类并非植物生长发育所必需的小分子有机化合物，其产生和类并非植物生长发育所必需的小分子有机化合物，其产生和分布通常有种属、器官组织和生长发育期的特异性。分布通常有种属、器官组织和生长发育期的特异性。大多大多是
32、分子结构比较复杂的小分子化合物，例如抗生素、激素、是分子结构比较复杂的小分子化合物，例如抗生素、激素、生物碱、毒素等。植物次生代谢产物次生产物在植物中的合生物碱、毒素等。植物次生代谢产物次生产物在植物中的合成与分解过程称为次生代谢。成与分解过程称为次生代谢。第47页，讲稿共63张，创作于星期二细胞工程细胞工程不同种类的生物所产生的次级代谢产物不相同，不同种类的生物所产生的次级代谢产物不相同，它们可能积累在细胞内，也可能排到外环境中。它们可能积累在细胞内，也可能排到外环境中。由于次级代谢产物大多具有生物活性，因此是由于次级代谢产物大多具有生物活性，因此是植物代谢产物研究的重点。植物代谢产物研究的
33、重点。第48页，讲稿共63张，创作于星期二细胞工程细胞工程 由于资源短缺和需求量增加，依靠从栽培植物提取天由于资源短缺和需求量增加，依靠从栽培植物提取天然的次级代谢产物途径很难满足人类需求，而利用植物然的次级代谢产物途径很难满足人类需求，而利用植物细胞生物反应器大量培养次生代谢产物成为最有效途径。细胞生物反应器大量培养次生代谢产物成为最有效途径。优点：优点：减少耕地占用，不受季节、地域限制；减少耕地占用，不受季节、地域限制；可以排除病菌和害虫的影响可以排除病菌和害虫的影响(密闭无菌操作密闭无菌操作)；l可通过选择优良株系和优化培养条件提高代谢物产可通过选择优良株系和优化培养条件提高代谢物产量；
34、量；l能通过改造生物合成途径获得新有用物质。能通过改造生物合成途径获得新有用物质。第49页，讲稿共63张，创作于星期二l植物次生代谢产物在医药、食品、轻化工业等领域具有植物次生代谢产物在医药、食品、轻化工业等领域具有重要意义重要意义李时珍（李时珍（15931593）在本草纲目中所开列的）在本草纲目中所开列的18921892种药物绝大多数是植物药物，目前仍有约种药物绝大多数是植物药物，目前仍有约2525的法定药品来自植物。其药物的有效成分均为的法定药品来自植物。其药物的有效成分均为次生产物次生产物。第50页，讲稿共63张，创作于星期二细胞工程细胞工程1 1、药用代谢产物、药用代谢产物 这是重要应
35、用领域，包括生物碱、萜类、苷类、酮类等。这是重要应用领域，包括生物碱、萜类、苷类、酮类等。例如，紫杉醇（例如，紫杉醇（TaxolTaxol）是从红豆杉属植物中分离得到的一种）是从红豆杉属植物中分离得到的一种二二萜烯类萜烯类化合物，化合物，治疗乳腺癌、肺癌、卵巢癌等的药物治疗乳腺癌、肺癌、卵巢癌等的药物。通过植物细胞培养技术生产有价值的次生代谢产物通过植物细胞培养技术生产有价值的次生代谢产物需求：需求：仅美国每年就有仅美国每年就有50 000名妇女患卵巢癌，每名妇女患卵巢癌，每年需约年需约24kg紫杉醇；还有约紫杉醇；还有约40 000名妇女死于乳腺名妇女死于乳腺癌，年需求量将增至癌，年需求量将
36、增至100kg。全世界每年需要。全世界每年需要500kg紫杉醇才能满足广大癌症患者需求。紫杉醇才能满足广大癌症患者需求。生产生产1 kg紫杉醇需要砍伐紫杉醇需要砍伐60年生大树年生大树3000-4000棵棵。紫杉醇在紫杉醇在树皮、嫩芽中含量最高树皮、嫩芽中含量最高。若光从树皮中提。若光从树皮中提取紫杉，每年需砍伐取紫杉，每年需砍伐150-200万棵万棵左右的大树。左右的大树。第51页，讲稿共63张，创作于星期二细胞工程细胞工程2 2、天然食品和食品添加剂、天然食品和食品添加剂 如胡萝卜素、叶黄素、甜菊苷、辣椒素等，因为化学合成色素和如胡萝卜素、叶黄素、甜菊苷、辣椒素等，因为化学合成色素和甜味剂
37、越来越受到担心和严格限制。甜味剂越来越受到担心和严格限制。3 3、杀虫剂和杀菌剂、杀虫剂和杀菌剂 如利用万寿菊细胞生产噻吩烷，香草生产鱼藤酮杀虫剂。如利用万寿菊细胞生产噻吩烷，香草生产鱼藤酮杀虫剂。4 4、饲料、精细化工等产品、饲料、精细化工等产品 如用培养的槡、榆等细胞，再加入大豆粉、糖、淀粉等可充足供应蚕如用培养的槡、榆等细胞，再加入大豆粉、糖、淀粉等可充足供应蚕养殖业的饲料。养殖业的饲料。精细化工产品种类繁多（精细化工产品种类繁多（3636类），附加值高，具有功能性或最终类），附加值高，具有功能性或最终使用性。除上述医药、农药、添加剂外，还包括染料、涂料、香精、使用性。除上述医药、农药、
38、添加剂外，还包括染料、涂料、香精、洗涤剂、化妆品、金属表面处理剂、芳香消臭剂等产品。洗涤剂、化妆品、金属表面处理剂、芳香消臭剂等产品。第52页，讲稿共63张，创作于星期二细胞工程细胞工程第53页，讲稿共63张，创作于星期二细胞工程细胞工程 植物次级代谢产物的生物合成植物次级代谢产物的生物合成聚酮途径：聚酮途径：又称乙酸丙二酸途径，又称乙酸丙二酸途径，乙酰辅酶乙酰辅酶A A通过直线式聚合生成通过直线式聚合生成脂肪酸和环状次级代谢产物。脂肪酸和环状次级代谢产物。聚酮类化合物的合成。聚酮类化合物的合成。莽草酸途径：莽草酸途径：生物碱、类黄酮、生物碱、类黄酮、香豆素等产物。香豆素等产物。甲戊二羟酸途径
39、：甲戊二羟酸途径：又称甲瓦龙又称甲瓦龙酸途径，合成萜类、甾体、蒽酸途径，合成萜类、甾体、蒽醌等产物。醌等产物。第54页，讲稿共63张，创作于星期二细胞工程细胞工程（1）细胞株）细胞株 植物不同部位的细胞产生次生代谢产物的能力是不同的，所以植物不同部位的细胞产生次生代谢产物的能力是不同的，所以在进行植物细胞培养生产有价值的代谢产物时，在进行植物细胞培养生产有价值的代谢产物时，必须弄清楚产物的必须弄清楚产物的合成部位合成部位，也就是应该考虑到不同部位，也就是应该考虑到不同部位来源细胞的特性来源细胞的特性。筛选出筛选出稳定、高产、稳定、高产、生长速度快生长速度快的细胞株的细胞株是细胞是细胞大规模培养
40、次生代谢产物的前提。缺乏适合的细胞株是目前大规模培养次生代谢产物的前提。缺乏适合的细胞株是目前许多代谢产物无法利用细胞培养生产的主要限制之一。许多代谢产物无法利用细胞培养生产的主要限制之一。细胞遗传特性细胞遗传特性植物次级代谢产物合成的影响因素植物次级代谢产物合成的影响因素第55页，讲稿共63张，创作于星期二细胞工程细胞工程 次级代谢产物的生物合成涉及次级代谢产物的生物合成涉及多基因参与（基因簇）多基因参与（基因簇），机制非常复杂，不同于蛋白质合成，影响因素非常多。，机制非常复杂，不同于蛋白质合成，影响因素非常多。结合目标产物进行生物合成机制研究，揭示代谢结合目标产物进行生物合成机制研究，揭示
41、代谢途径及诱导合成机制途径及诱导合成机制是细胞培养的重要生物学问是细胞培养的重要生物学问题，有利于指导建立优化的培养工艺与技术。题，有利于指导建立优化的培养工艺与技术。（2 2）生物合成机制）生物合成机制第56页，讲稿共63张，创作于星期二细胞工程细胞工程选择适宜的起始材料选择适宜的起始材料 a.a.首先必须选择能够首先必须选择能够高效合成目的产物高效合成目的产物的植物种类。的植物种类。b.b.再此前提下，起始培养材料还应考虑再此前提下，起始培养材料还应考虑器官和组织特异性器官和组织特异性，通常选取，通常选取自自然状态下能够积累次生产物的部位然状态下能够积累次生产物的部位，这样的细胞经过培养后
42、常具有合成，这样的细胞经过培养后常具有合成目的产物的能力，或比较容易诱导合成目的产物。目的产物的能力，或比较容易诱导合成目的产物。提高细胞次生代谢产物的途径提高细胞次生代谢产物的途径第57页，讲稿共63张，创作于星期二细胞工程细胞工程选择合适的培养基成分选择合适的培养基成分 培养基的成分既有利于细胞大量生长繁殖，又有利于次生培养基的成分既有利于细胞大量生长繁殖，又有利于次生代谢产物大量产生。代谢产物大量产生。一般来说，增加培养基的一般来说，增加培养基的N N，P P、K K的浓度能促进细胞生长，的浓度能促进细胞生长，而适当增加糖浓度有利于次生产物的合成。而适当增加糖浓度有利于次生产物的合成。提
43、高细胞次生代谢产物的途径提高细胞次生代谢产物的途径第58页，讲稿共63张，创作于星期二细胞工程细胞工程提高细胞次生代谢产物的途径提高细胞次生代谢产物的途径 前体（前体（precursor）的应用）的应用u 培养基中加入外源前体物质，可使目的产物产量提高。培养基中加入外源前体物质，可使目的产物产量提高。u选择适当的前体物质十分重要。细胞次生代谢是一个复杂的生选择适当的前体物质十分重要。细胞次生代谢是一个复杂的生理生化过程，对于某一目的产物来讲有多种前体物质，而同一理生化过程，对于某一目的产物来讲有多种前体物质，而同一种前体物质又可能有多种代谢路径从而形成不同的代谢产物。种前体物质又可能有多种代谢
44、路径从而形成不同的代谢产物。因此，添加前体物质必须在充分了解目的产物的代谢途径下，因此，添加前体物质必须在充分了解目的产物的代谢途径下，针对其合成的关键生化过程进行前体物质的添加。针对其合成的关键生化过程进行前体物质的添加。第59页，讲稿共63张，创作于星期二细胞工程细胞工程激发子（激发子（elicitorelicitor）的应用）的应用 植物细胞次生代谢除了自身的遗传或发育基础外，通常还植物细胞次生代谢除了自身的遗传或发育基础外，通常还与诱导因子有关。在一些不良环境或有微生物侵入的情况下，与诱导因子有关。在一些不良环境或有微生物侵入的情况下，细胞次生代谢活动显著增强。因此人为合理地应用这些诱
45、导细胞次生代谢活动显著增强。因此人为合理地应用这些诱导因子，就有可能提高目的产物的产量。因子，就有可能提高目的产物的产量。提高细胞次生代谢产物的途径提高细胞次生代谢产物的途径第60页，讲稿共63张，创作于星期二细胞工程细胞工程培养技术的选择培养技术的选择 包括对反应器的选择和对培养方式的选择，就目前的技术基础来包括对反应器的选择和对培养方式的选择，就目前的技术基础来讲，固定化培养是植物细胞规模化生产较为理想的系统。讲，固定化培养是植物细胞规模化生产较为理想的系统。为了解决产物对合成的反馈抑制可以采用两相培养技术为了解决产物对合成的反馈抑制可以采用两相培养技术，液液-液系统：分离相常用的有液体石
46、蜡、烷类化合物、甘油等液系统：分离相常用的有液体石蜡、烷类化合物、甘油等液液-固系统：常用的有活性炭、硅酸镁载体、沸石、蚕丝、树脂等。固系统：常用的有活性炭、硅酸镁载体、沸石、蚕丝、树脂等。一般来说，提取相的选择目标是具有较大的分离能力，同时对于没有毒一般来说，提取相的选择目标是具有较大的分离能力，同时对于没有毒副作用，不影响产物的化学稳定性。副作用，不影响产物的化学稳定性。提高细胞次生代谢产物的途径提高细胞次生代谢产物的途径第61页，讲稿共63张，创作于星期二细胞工程细胞工程利用植物细胞大规模悬浮培养为生产有用代谢产物提供了利用植物细胞大规模悬浮培养为生产有用代谢产物提供了有效途径，但是由于
47、有效途径，但是由于植物细胞容易积聚植物细胞容易积聚、细胞分化、剪切力敏感、细胞分化、剪切力敏感、代谢途径复杂性代谢途径复杂性等因素使工业规模化培养受到限制。此外，植物细等因素使工业规模化培养受到限制。此外，植物细胞培养在胞培养在放大过程中往往产量放大过程中往往产量会比实验室摇瓶培养会比实验室摇瓶培养下降许多下降许多的的问题。问题。迄今为止，只有少数植物细胞培养实现了工业化，例如迄今为止，只有少数植物细胞培养实现了工业化，例如两步法生产紫草宁、迷迭香宁酸、肉桂酰丁二胺等。两步法生产紫草宁、迷迭香宁酸、肉桂酰丁二胺等。植物细胞培养生产代谢产物问题总结植物细胞培养生产代谢产物问题总结第62页，讲稿共63张，创作于星期二细胞工程细胞工程感感谢谢大大家家观观看看第63页，讲稿共63张，创作于星期二